Маълумот

Ядрои Cas9 кай қатъ мешавад?

Ядрои Cas9 кай қатъ мешавад?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Агар ман дуруст фаҳмам, қадамҳои таҳрири ген бо CRISPR-Cas9 тақрибан чунинанд

  • Nuclease Cas9 ва РНК роҳнамо як маҷмааро ташкил медиҳанд.
  • Маҷмааи Cas9+RNA-и роҳнамо ДНК-и геномиро скан мекунад ва пайдарпаии гомологии РНК-ро эътироф мекунад
  • Танаффуси риштаи дукаратаро дар ДНК дар болооби пайдарпайии PAM ба вуҷуд меорад (танҳо вақте мешиканад, ки пайдарпаии гомологии РНК роҳнамо дар наздикии PAM ҷойгир аст).
  • Модификатсияи генетикӣ бо истифода аз механизми таъмири ДНК (NHEJ, HDR) пас аз шикастани дукарата.

Агар ин тавр бошад, дар таҳрири генҳо бо CRISPR-Cas9, таҳрири ген эҳтимол дорад то он даме, ки Cas9 фаъолияти худро гум накунад, оё ман дуруст аст?

Саволи ман

  • Кас кай фаъолияти худро гум мекунад?
  • Мантиқи таҷриба, ки вақтро муайян мекард, чӣ гуна буд? / Агар худи масъала тадциц нашуда бошад, барои муайян кардани вацти гум шудани фаъ-олияти Кас чй гуна тачрибахо гузарондан мумкин аст?

Тавре ки ин филм нишон медиҳад, агар таҳриркунии ген бомуваффақият сурат гирад, он воқеан мутацияро дар гени мавриди ҳадаф ҷорӣ мекунад.

Бо вуҷуди ин, ҳатто агар ин тавр бошад, - ин танҳо тахмини ман аз ин ҷост - эҳтимол аст, ки он ба гени мақсаднок, ҳадди аққал дар болооби РНК дастури иловагӣ боқӣ мемонад. Аммо, ҳатто агар гени мақсаднок мутатсия карда шавад, эҳтимол дорад пайдарпаии иловагии РНК-и роҳнамо боқӣ монад, ҳадди аққал дар болооби мутация. Ҳамин тавр, ҳатто агар як таҳрири ген бомуваффақият анҷом дода шавад, ман фикр мекунам, ки таҳриркунии ген метавонад дар ҳамон макон дубора рух диҳад. Ғайр аз он, ҳатто агар сайти мақсаднок бомуваффақият таҳрир карда шавад ҳам, имкони таҳрири минбаъдаи берун аз ҳадаф дар ҷои дигар вуҷуд дорад. Аз ин рӯ, ман фикр мекунам, ки асбобҳо барои боздоштани CAS вуҷуд доранд.


РНК-и роҳнамо ба гени мавриди ҳадаф, ки аз ҷониби CAS газида шудааст, мепайвандад. Риштае, ки дар муқобили риштае, ки РНК-и роҳнамо ба он пайваст шуда буд, тоза канда шудааст. Иқтибос аз ин видео.

Як идея барои таҷриба барои муайян кардани вақти хомӯшии CAS Агар колонияи ягонаи ҳуҷайра аз аҳолии аз рӯи ген таҳриршуда сохта шуда бошад ва дар ҳуҷайраҳои аз ин колония таваллудшуда тафовути генетикӣ вуҷуд дошта бошад, пас ман фикр мекунам, ки ин маънои онро дорад, ки ҳатто пас аз оғози колонияи ягонаи ҳуҷайра дар фарҳанг фаъолияти Cas9 вуҷуд дошт. Оё ин фикр дуруст аст? Оё таҷрибаи оқилонатар вуҷуд дорад?


Дар мавриди аз даст додани фаъолияти Cas9, шумо аллакай ба ҷавоби саволи худ дахл мекунед. Cas9 ҳамчун нуклеаза/фермент ҳамеша фаъол аст ва ҷудо кардани ДНК-и дуқабатаро идома медиҳад, то он даме, ки сайтҳои мақсадноки иловагӣ ва РНК-ҳои роҳнамоӣ барои роҳнамоии он вуҷуд доранд. Агар сайти мақсаднок бошад не мутаатсияшуда ё пас аз тақсимшавӣ комилан хориҷ карда шудааст, Cas9 воқеан метавонад ҳамон сайтро дубора пора кунад.

Аммо, ҳатто агар гени мақсаднок мутатсия шуда бошад ҳам, эҳтимол аст, ки пайдарпаии пурраи РНК-и роҳнамо боқӣ монад, ҳадди аққал дар болооби мутация.

Ман боварӣ надорам, ки оё ман фикреро, ки шумо дар ин ҷо гуфтанӣ ҳастед, нодуруст мефаҳмам, аммо ҷорӣ кардани мутатсияҳо одатан ки барои пешгирии шикастани такрории ҳамон як макон кофӣ аст (гарчанде ки таҳқиқоти эффектҳои ғайриҳадаф ба таври возеҳ нишон медиҳанд, ки ин на ҳамеша чунин аст):

Ҳарду Streptococcus pyogenes ва Staphylococcus aureus Cas9 маконҳои мавриди ҳадафи худро дар байни мавқеъҳои -3 ва -4 ҷудо мекунад ва аз охири пайдарпаии дастури 20-nt ҳисоб мекунад (нигаред ба расми замимашуда дар поён). Пас аз он танаффуси дуқабата метавонад ё тавассути пайвастшавии охири гомологӣ (NHEJ) ё тавассути рекомбинатсияи гомологии ба қолаб асосёфта (HR) таъмир карда шавад.

Дар ҳолати қаблӣ (NHEJ), танаффусҳои дукарата мебошанд баъзан бо хатохои хурд таъмир карда шуд. Ин хатогихо одатан дар наздикии макони танаффус ҷамъ мешаванд (дар бораи NHEJ хонед, то фаҳмед, ки чаро) ва чунин мутатсияҳо маъмулан макони шинохти gRNA-ро нобуд мекунанд. Аммо, қайд кунед, ки на ҳама (воқеан, хеле кам) Ҳодисаҳои таъмири NHEJ боиси ҷорӣ шудани мутатсияҳо мешаванд ва танаффусҳои "комил таъмиршуда" ҳам метавонанд аз ҷониби Cas9 дубора ҷудо карда шаванд. Аммо азбаски тақсимоти такрорӣ барои ҳуҷайра марговар аст, барои мутатсияҳо бартарии интихобӣ вуҷуд дорад, ки аз дубора буридани макони ҳадаф пешгирӣ мекунад. Инчунин қайд кунед, ки ҷорӣ намудани мутатсияҳо (ва ба ин васила таҳриркунии генҳо) тавассути NHEJ як раванди тасодуфӣ буда, бидуни назорати мустақим аз ҷониби тадқиқотчӣ.

Дар ҳолати охирин (HR), қолаби ДНК-ро, ки барои таъмири танаффуси дуқабата истифода мешавад, одатан аз ҷониби тадқиқотчӣ интихоб карда мешавад. Масалан, он метавонад як порчаи аз ҷиҳати химиявӣ синтезшудаи ДНК ё маҳсулоти ПТР бошад, ки ҳадди аққал як гомологияи пайдарпайӣ ба минтақаҳои паҳлӯи макони ҷудошавӣ дорад. Аммо азбаски барои минтақа талаби мушаххаси пайдарпай вуҷуд надорад дар байни минтақаҳои гомологӣ, ин минтақаи фосилавӣ метавонад тавре тарҳрезӣ шавад, ки он қисман ё пурра иваз кардани шинохти аслӣ ва/ё пайдарпаии PAM (минтақаи бунафш дар расми зер) гардад.


Нуклеаз мурданд Cas9

Интишори 1 апрели соли 2021 аз ҷониби доктор Фрэнсис Коллинз

Кредит: iStock/Firstsignal

Таҳрири генҳо ваъдаи бузургеро ҳамчун як роҳи меросӣ барои табобати доираи васеи шароитҳо, аз ҷумла бисёре аз бемориҳои ирсӣ ва ба наздикӣ, ҳатто COVID-19 нишон дод. Аммо оё як версияи асбоби таҳрири ген CRISPR инчунин метавонад бе хатари нашъамандӣ бо доруҳои опиоидҳои рецептӣ дарди дарозмуддатро сабук кунад?

Дар кори ба карибй дар журнал чопшуда Илмҳои тибби тарҷумавӣ, муҳаққиқон дар мушҳо нишон доданд, ки версияи тағирёфтаи системаи CRISPR метавонад барои "хомӯш кардани" ген дар нейронҳои муҳим барои бастани интиқоли сигналҳои дард истифода шавад [1]. Гарчанде ки таҳқиқоти бештар лозим аст ва ин равиш ҳанӯз дар байни одамон санҷида намешавад, бозёфтҳо нишон медиҳанд, ки ин стратегияи нави CRISPR метавонад барои як роҳи нави идоракунии дарди музмин асос гузорад.

Ин равиши нав барои табобати дарди музмин ба Ана Морено, аввалин муаллифи тадқиқот, вақте ки ӯ доктори илм буд. донишҷӯ дар лабораторияи аз ҷониби NIH дастгирӣшавандаи Прашант Мали, Донишгоҳи Калифорния, Сан Диего. Мали доираи васеи терапевтҳои нави ген ва ҳуҷайраҳоро меомӯхт. Ҳангоми хондани ҳарду, Морено рӯи коғаз дар бораи мутатсия дар ген, ки сафедаи пурқувваткунандаи дардро дар нейронҳои сутунмӯҳра бо номи NaV1.7 рамзгузорӣ мекунад, фуруд омад.

Морено хондааст, ки кӯдаконе, ки бо мутатсияи аз даст додани функсия дар ин ген таваллуд шудаанд, як ҳолати нодире доранд, ки бо номи ҳассосияти модарзодӣ ба дард (CIP) маълум аст. Онҳо аслан эҳсос намекунанд ва ба дард ҷавоб медиҳанд. Ҳарчанд ин кӯдакон аксар вақт ҷароҳатҳои ҷиддиро эътироф намекунанд, зеро онҳо дард надоранд, то онҳоро огоҳ кунанд, онҳо дигар таъсироти ҷисмонии чашмрас надоранд.

Барои Морено чизе пахш кард. Чӣ бояд кард, агар як намуди нави табобатро таҳия кардан мумкин бошад, ки барои коҳиш додани ин ген пешбинӣ шудааст ё пурра хомӯш карда, одамонро аз эҳсоси дарди музмин манъ мекунад?

Морено инчунин дар бораи чӣ гуна ин корро кардан фикре дошт. Вай бо истифода аз версияи CRISPR бо номи “dead” Cas9 [2] дар бораи фишор додан ё “хомӯш кардани” генҳо кор мекард. Дар системаҳои CRISPR, ки барои таҳрири ДНК тарҳрезӣ шудаанд, ферментҳои Cas9 аксар вақт ба як ҷуфт кайчи монанд карда мешаванд. Вазифаи он буридани ДНК дар ҷои дуруст бо ёрии дастури РНК мебошад. Аммо, Cas9-и CRISPR-мурда дигар қобилияти буридани ДНК надорад. Он танҳо ба ҳадафи гении худ часпида, ифодаи онро манъ мекунад. Бартарии дигар дар он аст, ки система ба ягон тағйироти доимии ДНК оварда намерасонад, зеро ҳама гуна табобат дар асоси CRISPR-мурда Cas9 метавонад бехатар баргардонида шавад.

Пас аз муайян кардани он, ки техника дар ҳуҷайраҳо кор мекунад, Морено ва ҳамкасбон ба омӯзиши мушҳои лабораторӣ гузаштанд. Онҳо векторҳои вирусии муолиҷаи CRISPR-ро ба мушҳо бо намудҳои гуногуни дарди музмин, аз ҷумла дарди илтиҳобӣ ва химиотерапия ворид карданд.

Морено ва ҳамкасбон муайян карданд, ки ҳамаи мушҳо далели сабукии устувори дардро нишон доданд. Ҷолиб он аст, ки табобат низ се моҳ ё бештар аз он давом кард ва муҳимтар аз ҳама, бе ягон аломати таъсири тараф. Муҳаққиқон инчунин як равиши дигареро барои иҷрои як кор бо истифода аз маҷмӯи гуногуни абзорҳои таҳриркунӣ, ки нуклеазаҳои ангушти руҳ (ZFNs) ном доранд, меомӯзанд.

Муҳаққиқон мегӯянд, ки яке аз ин равишҳо метавонад рӯзе барои одамоне, ки дорои шумораи зиёди шароити музмини дард, ки интиқоли сигнали дард тавассути NaV1.7 доранд, кор кунад. Ба он полиневропатияи диабетикӣ, сиатика ва остеоартрит дохил мешаванд. Он инчунин метавонад барои беморони гирифтори химиотерапия ва дар баробари онҳое, ки аз бисёр шароитҳои дигар азият мекашанд, сабукӣ диҳад. Морено ва Мали як ширкати ҷудогонаи Navega Therapeutics, Сан Диего, Калифорнияро таъсис доданд, то дар қадамҳои пеш аз клиникӣ кор кунанд, то муносибати онҳо ба клиникаро наздиктар кунанд.

Дарди музмин як мушкилоти харобиовари саломатии ҷамъиятӣ мебошад. Гарчанде ки опиоидҳо барои дарди шадид самараноканд, онҳо метавонанд барои бисёр ҳолатҳои музмини дард бештар аз фоида зарар расонанд ва онҳо барои бӯҳрони умумимиллии нашъамандӣ ва марги аз меъёр зиёди маводи мухаддир масъуланд [3]. Мо ҳеҷ яке аз ин мушкилотро бидуни дарёфти роҳҳои нави табобати дарди музмин ҳал карда наметавонем. Вақте ки мо ба оянда менигарем, умедворем, ки терапевтҳои нави инноватсионӣ ба монанди ин системаи таҳрири ген метавонад рӯзе барои расонидани кӯмаки хеле зарурӣ кӯмак кунад.

[1] Бедардшавии дарозмуддат тавассути репрессияи дар макони мақсадноки NaV1.7 дар мушҳо. Морено AM, Алеман Ф, Катроли ГФ, Хант М, Ху М, Дайлами А, Пла А, Воллер С.А., Палмер Н, Парех У, Макдоналд Д, Робертс А.Ж, Гудвил В, Драйден И, Хевнер РФ, Делай Л, Гонсалвес Дос Сантос Г, Якш ТЛ, Мали P. Sci Transl Med. 2021 марти 1013 (584):eaay9056.

[2] Nuclease dead Cas9 як блоки барномарезишаванда барои репликатсияи ДНК мебошад. Whinn KS, Kaur G, Lewis JS, Schauer GD, Мюллер SH, Jergic S, Maynard H, Gan ZY, Naganbabu M, Bruchez MP, O’Donnell ME, Dixon NE, Van Oijen AM, Ghodke H. Sci Rep. 2019 сентябри 169(1):13292.

[3] Марги аз меъёр зиёди маводи мухаддир. Марказҳои назорат ва пешгирии бемориҳо.

Ҳассосияти модарзодӣ ба дард (Маркази Миллии Илмҳои Тарҷумонӣ / NIH)

Опиоидҳо (Институти Миллии нашъамандӣ/NIH)

Лабораторияи Мали (Донишгоҳи Калифорния, Сан Диего)

Дастгирии NIH: Пажӯҳишгоҳи Миллии Тадқиқоти Геномии Инсон Институти Миллии Саратон Институти Миллии Илмҳои Умуми Тибби Институти Миллии Ихтилоли Неврологӣ ва Инсулт


Пайвастшавӣ ва ҷудошавии ДНК

Системаҳои CRISPR/Cas9 як РНК-и роҳнаморо бо минтақае, ки ба ДНК-и мақсаднок илова мекунанд, барои пайваст кардани пайдарпайии ҳадафи худ истифода мебаранд. Аммо, дар ин бобат як масъалаи фаврӣ ва хос вуҷуд дорад. Барои ноил шудан ба хосият, РНК-ҳои роҳнамои дарозтар фоидаоваранд, зеро ҳар як нуклеотид дар дастури РНК хосияти нуклеазаро тақрибан 4 маротиба зиёд мекунад. Аммо, барои он ки ДНК гудохта шавад ва ҷуфтшавии асосро ба РНК-и роҳнамо ҷойгир кунад, роҳнамои РНК ҳар қадар дарозтар бошад, нуклеаза ҳамон қадар самараноктар нест. Чӣ тавр системаҳои CRISPR/Cas9 метавонад нисбат ба дигар нуклеазаҳо ба мисли TALENS ва ZFNS хусусияти ба таври назаррас афзоишёфта дошта бошад ва то ҳол самаранокии тақрибан якхеларо нигоҳ дорад, агар беҳтар набошад? (Мали ва дигарон 2013)

Ҷавоб ин аст, ки системаи CRISPR/Cas9 ҳатмии Protospacer Adjacent Motif (PAM) -ро ҳамчун як қадами пешакӣ дар пайдо кардани пайдарпаии ҳадаф истифода мебарад. Тавре ки тавассути микроскопияи флуорессенси ягонаи молекулавӣ муайян карда шуд, пайвастагии ибтидоии Cas9 ба пайдарпаии PAM (N-G-G) ба фермент имкон медиҳад, ки пайдарпайии эҳтимолии ҳадафро зуд тафтиш кунад. Фермент аз ДНК, ки пайдарпаии дурусти PAM надорад, зуд ҷудо мешавад. Агар сафеда ҳадафи эҳтимолиро бо PAM мувофиқ пайдо кунад, вай ДНК-и боқимондаро дар ҳадаф гудохта, санҷида мешавад, ки оё пайдарпаии ҳадафи боқимонда ба пайдарпаии дастури он мукаммал аст ё не. Қадами ҳатмии PAM ба протеин имкон медиҳад, ки ҳадафҳои эҳтимолиро зуд тафтиш кунад ва аз обшавии бисёр пайдарпаии ғайриҳадаф дар ҷустуҷӯи пайдарпайии пурраи пурраи бурида худдорӣ кунад. (Sternberg et al. 2014)

Дар моҳи июли соли 2014, Андерс ва дигарон. сохтори кристаллро нашр кард, ки ба модели пайвастшавӣ, кушодан ва шинохти нуклеазаи Cas9 аз ДНК-и ҳадаф вобаста ба PAM оварда расонд. Тасвирҳои зерин дар асоси расми 4-и коғаз сохта шудаанд ё ин тасвирҳо дар Pymol (аз ҷониби Шредингер тақсим карда шудаанд) бо истифода аз сохтори кристаллӣ аз ин коғаз (аз Бонки маълумоти протеин гирифта шудаанд).

Модели пешниҳодшуда барои пайвастшавӣ, обшавӣ ва шинохти ДНК-и ҳадаф аз PAM вобаста аз ҷониби Cas9:

Тасвири 2: Пайвасткунии Пам ва Қулфи Фосфат (тасвири аслӣ) (тасвири кристаллӣ аз PDB оварда шудааст: 4UN3 Anders et al. 2014.)

Пойгоҳҳои Protospacer Adjacent Motif (PAM) NGG-и риштаи ДНК-и мақсаднок бо ранги зард нишон дода шудаанд. Боқимондаҳои аргинин 1333 ва 1335 домени PAM Interacting (PI) ба чуқури асосии пойгоҳҳои гуанин дар PAM мепайвандад. Бақияи лизин дар ҳалқаи қулфи фосфат, инчунин дар домени PI, чуқури хурдро мепайвандад.

Ин PAM ва ДНК-и ҳадафро тавре ҷойгир мекунад, ки серин 1109 дар ҳалқаи қулфи фосфатӣ ва ду нитрогени ҳалқаи қулфи фосфатӣ метавонанд пайвандҳои гидрогениро ба фосфат дар мавқеи +1-и PAM ташкил кунанд. Ин ДНК-и ҳадафро мӯътадил мегардонад, то пойгоҳҳои аввалини пайдарпаии ҳадаф (ё протоспасер) гудохта ва ба боло ба сӯи РНК роҳнамо гарданд.

Тасвири 3: Пайвасткунии ҳалқаи фосфатӣ ва кушодани ДНК (тасвири аслӣ) (тасвири кристаллӣ аз PDB: 4UN3 Anders et al. 2014)

Агар ДНК-и мақсаднок ба риштаи роҳнамои РНК мукаммал бошад, ду ришта ҷуфт мешаванд. Ин имкон медиҳад, ки ДНК-и мақсаднок кушода шавад, зеро асосҳо ба боло бармегарданд ва РНК-и роҳнаморо мебанданд. Бе пайвастшавии ибтидоии PAM ва устуворсозии фосфати +1, РНК-и роҳнамо хеле кам метавонад ДНК-и мақсаднокро бипайвандад ва Cas9 хеле бесамар хоҳад буд. Ин як механизмеро нишон медиҳад, ки чаро Cas9 қодир аст ҳам самаранокии баланд ва ҳам хосияти баланд дошта бошад ва аз ин рӯ онро як воситаи пуриқтидори таҳрири геном гардонад.

Тасвири 4: Шинохтан ва ҷудошавии ДНК (тасвири аслӣ) (тасвири кристаллӣ аз PDB: 4UN3 Anders et al. 2014.)

Ниҳоят, тозакунии пурраи РНК-и роҳнамо ба ДНК-и мақсаднок имкон медиҳад, ки нуклеазаҳои HNH ва RuvC риштаҳои мувофиқи худро ҷудо кунанд. Ин нуклеазаҳо махсусан дар байни нуклеотидҳои 3 ва 4 аз PAM ҷудо мешаванд. Боз ҳам, ин хусусияти ҷудошавӣ, инчунин он, ки нуклеазаҳои инфиродӣ метавонанд мустақилона ва бидуни таъсир ба қобилияти Cas9 барои пайваст кардани пайдарпаии мушаххас мутатсия карда шаванд, системаи CRISPR/Cas9-ро ба як воситаи таҳрири геномҳои пурқувват ва чандир табдил медиҳад.


Мундариҷа

Дар геноми бактериявӣ, локусҳои CRISPR дорои "фосилаҳо" (ДНК-и вирусӣ ба локуси CRISPR ҷойгир карда шудаанд), ки дар намуди II системаҳои мутобиқшавии иммунии аз ҳамлаи ДНК-и вирусӣ ё плазмидӣ (бо номи "протоспайсерҳо") сохта шудаанд. Ҳангоми ҳамлаи минбаъда, як нуклеазаи марбут ба CRISPR ба монанди Cas9 ба маҷмааи tracrRNA-crRNA пайваст мешавад, ки Cas9-ро ба пайдарпаии протоспасери ҳамлакунанда роҳнамоӣ мекунад. Аммо Cas9 пайдарпаии protospacerро вайрон намекунад, агар пайдарпаии PAM ҳамсоя набошад. Фосила дар макони бактериявии CRISPR дорои пайдарпайии PAM нахоҳад буд ва аз ин рӯ бо нуклеаза бурида нахоҳад шуд, аммо протоспайсер дар вирус ё плазми ҳамлакунанда пайдарпаии PAM-ро дар бар мегирад ва аз ин рӯ нуклеазаи Cas9 ҷудо мешавад. [4] Дар барномаҳои таҳрири геном, олигонуклеотиди кӯтоҳ бо номи РНК-и роҳнамо (gRNA) барои иҷрои вазифаи маҷмааи tracrRNA-crRNA дар шинохти пайдарпайии генҳо, ки пайдарпаии PAM дар 3'-охири доранд, синтез карда мешавад ва ба ин васила "ҳидоят" мекунад. ядроиро ба пайдарпаии мушаххасе, ки нуклеаза қодир аст бурида шавад. [7] [8]

PAM каноникӣ пайдарпаии 5'-NGG-3' мебошад, ки дар он "N" ҳама гуна нуклеобаза ва пас аз ду нуклеобаза гуанинӣ ("G") мебошад. [9] РНК-ҳои роҳнамо метавонанд Cas9-ро ба ягон макони геном барои таҳрири ген интиқол диҳанд, аммо дар ягон сайте, ки дар он Cas9 PAM-ро эътироф мекунад, таҳрир кардан мумкин нест. PAM каноникӣ бо нуклеазаи Cas9 алоқаманд аст Streptococcus pyogenes (SpCas9 таъин шудааст), дар ҳоле ки PAMҳои гуногун бо сафедаҳои Cas9 бактерияҳо алоқаманданд Neisseria meningitidis, Трепонемаи дентикола, ва Streptococcus thermophilus. [10] 5'-NGA-3' метавонад як PAM хеле самараноки ғайриканоникӣ барои ҳуҷайраҳои инсон бошад, аммо самаранокӣ вобаста ба ҷойгиршавии геном фарқ мекунад. [11] Кӯшишҳо барои муҳандисии Cas9s барои шинохтани PAMҳои гуногун бо мақсади беҳтар кардани қобилияти CRISPR-Cas9 барои таҳрири генҳо дар ҳама макони дилхоҳи геном анҷом дода шуданд. [12]

Cas9 аз Франсиселла Новичида пайдарпаии каноникии PAM 5'-NGG-3'-ро эътироф мекунад, аммо барои шинохтани 5'-YG-3' тарҳрезӣ шудааст (ки "Y" пиримидин аст [13]), ба ин васила ба доираи ҳадафҳои имконпазири Cas9 илова мекунад. [14] Нуклеазаи Cpf1 аз Франсиселла Новичида PAM 5'-TTTN-3' [15] ё 5'-YTN-3' -ро эътироф мекунад. [16]

Ба ғайр аз CRISPR-Cas9 ва CRISPR-Cpf1, бешубҳа бисёр нуклеазаҳо ва PAM-ҳои ҳанӯз кашфнашуда мавҷуданд. [17]

CRISPR/Cas13a (қаблан C2c2 [18] ) аз бактерия Leptotrichia shahii системаи CRISPR, ки бо РНК роҳнамоӣ карда мешавад, на ДНК, балки пайдарпайҳоро дар РНК ҳадаф қарор медиҳад. PAM барои CRISPR-и мақсадноки RNA алоқаманд нест, гарчанде ки гуанин дар паҳлӯи ҳадаф ба самаранокии манфӣ таъсири манфӣ мерасонад ва ба "макони протоспасери канорӣ" (PFS) таъин шудааст. [19]

Технологияе бо номи GUIDE-Seq таҳия шудааст, ки пораҳои берун аз ҳадафро таҳлил мекунад, ки тавассути чунин таҳрири ген тавлид шудааст. [20] Талаботи PAM-ро барои ба таври махсус ҳадаф гирифтани мутатсияҳои гетерозиготии якнуклеотид истифода бурдан мумкин аст ва дар ҳоле, ки ба аллелҳои навъи ваҳшӣ ягон таъсири аберантӣ намерасонад. [21]


Имкониятҳои дастрасӣ

Дастрасии пурраи маҷалларо дар тӯли 1 сол гиред

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.
ААИ баъдтар дар кассири илова карда мешавад.
Ҳисобкунии андоз дар вақти ҳисобкунӣ анҷом дода мешавад.

Дастрасии вақти маҳдуд ё пурраи мақоларо дар ReadCube гиред.

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.


Бо истифода аз маҷмӯаи вектории GeneArt CRISPR Nuclease-и мо трансфексия, ғанӣ, экран ва нашр. Системаи CRISPR Nuclease як системаи вектории барои истифода омода ва ҳама дар як экспрессро бо кассетаи ифодаи нуклеазаи Cas9 ва кассетаи клонкунии РНК барои клонкунии зуди crRNA-и мушаххас пешниҳод мекунад. Ин система ба шумо имкон медиҳад, ки макони геномии интихобкардаатонро бо як пайдарпаӣ аз як плазмид таҳрир ва муҳандисӣ кунед. Пас аз муайян кардани ҳадафҳои дахлдор бо GeneArt CRISPRs, мутатсияҳои аз ҷиҳати биологӣ алоқамандро бо GeneArt TALs тасдиқ кардан мумкин аст, то эҳтимолияти берун аз ҳадафро коҳиш диҳад.

Маҷмӯаҳои вектории GeneArt CRISPR Nuclease векторӣ системаҳои вектории гузоришдиҳанда барои ифодаи ҷузъҳои функсионалии барои таҳрири геномҳои CRISPR-Cas заруранд. Маҷмӯаҳо бо истифода аз вектори плазмидӣ, ки инчунин эндонуклеазаи Cas9-ро ифода мекунанд, ифодаи РНК-и дастури ғайрикоднашавандаро (аз ҷумла crRNA ва tracrRNA) осон мекунанд.

GeneArt CRISPR Nuclease Vector бо OFP (протеини флуоресцентии афлесун) барои ба навъбандии цитометрияи ҷараёни популяцияи ҳуҷайраҳои крРНК, дар ҳоле ки GeneArt CRISPR Nuclease Vector бо CD4 имкон медиҳад, ки ҳуҷайраҳои экспресскунандаи crRNA ғанӣ гардонида шаванд.

Векторҳои ядроии GeneArt CRISPR. (А) Nuclease GeneArt CRISPR: Харитаи плазмиди OFP Reporter ва хусусиятҳои Nuclease GeneArt CRISPR: OFP Reporter. Вектор дар байни нуклеотидҳои 6,732 ва 6,752 хаттӣ дода мешавад ва дар ҳар як ришта 5 bp 5´ болопӯшҳо, тавре ки нишон дода шудааст, таъмин карда мешавад. (Б) Nuclease GeneArt CRISPR: Харитаи плазми ғанисозии CD4 ва хусусиятҳои GeneArt CRISPR Nuclease: ғанисозии CD4. Вектор дар байни нуклеотидҳои 7,336 ва 7,355 хаттӣ дода мешавад ва дар ҳар як ришта 5 bp 5´ болопӯшҳо, тавре ки нишон дода шудааст, дода мешавад. Векторҳои нуклеазии хаттии GeneArt CRISPR роҳи зуд ва муассири клон кардани олигонуклеотидҳои дуқабатаро таъмин мекунанд, ки crRNA-ро ифодакунандаи ҳадафи дилхоҳ ба кассетаи экспрессиявӣ, ки имкон медиҳад ҳадафи пайдарпайии нуклеазаи Cas9-ро нишон диҳад.

Маҳсулоти алоқаманд

Кӯшиш кунед Маҷмӯаҳои ДНК-и Invitrogen TrueTag метавонад ба шумо бо истифода аз қолибҳои қаблан тарҳрезишуда ва тасдиқшудаи ДНК-и донорӣ ба шумо кӯмак кунад, ки ҳуҷайраҳои кӯфташударо то 100% ба даст оред.

Дар ҷустуҷӯи қарорҳои олии таҳрири геномҳои мо?

Бисёр омӯхтан

Пас аз клон кардани порчаҳои ДНК барои ҷузъҳои системаи CRISPR-Cas9, векторро дар дохили он паҳн кардан мумкин аст. E. coli ҳуҷайраҳо барои тавлиди миқдори кофии плазми ифодаи шумо. Мо пешниҳод гуногуни салоҳиятдор E. coli ҳуҷайраҳо, ки интихоби онҳо аз усули трансформатсия ва интиқоли таҷрибаи шумо вобаста аст.

Усулҳои гуногун барои тасдиқи дурустии сохтори плазми шумо вуҷуд доранд, яъне PCR, ҳазми маҳдуд ё пайдарпай. Интихоб аз он вобаста аст, ки оё шумо ба муайян кардани он, ки плазмид дорои ДНК-и шуморо дар бар мегирад, васлкунӣ дар самти дуруст аст ё замима пайдарпаии дуруст дорад. Мо асбобҳои биологияи молекулавӣ барои татбиқи ҳама гуна усули таҳлили интихобкардаатон пешниҳод менамоем.


Ҷавоб

Системаи CRISPR ҳамчун системаи иммунии мутобиқшавандаи прокариотӣ инкишоф ёфт. Системаи CRISPR як эндонуклеазаи бо РНК идорашавандаи Cas9-ро истифода мебарад, ки қодир аст буришҳои мушаххаси маконро дар пайдарпаии ДНК кунад, ки ба пайдарпаии беназири байни такрорҳои палиндромӣ дар массиви CRISPR мувофиқат кунад. Дар табиат, системаи CRISPR эндонуклеазаи Cas9-ро барои нест кардани ДНК аз объектҳои ҳамлакунанда, ба монанди бактериофаг истифода мебарад.

Организмҳои истифодакунандаи CRISPR инчунин метавонанд ДНК-и навро аз намудҳои ҳамлакунанда гирифта, онро ба массиви мавҷудаи CRISPR дохил кунанд. Ин қобилияти ворид кардани ДНК-и нав ба организмҳо имкон медиҳад, ки аз сироятҳои оянда, ки пайдарпаии навтаъсисро дар бар мегиранд, муҳофизат кунанд, аммо инчунин талаб мекунад, ки протеини Cas9 ба пайдарпаии бешумори ДНК ҳадаф мутобиқ бошад. Тадқиқотчиён ин мутобиқшавии системаи CRISPR-ро барои сохтани нуклеазаи барномарезишуда истифода бурданд, ки метавонад пайдарпаии ДНК-ро бо хусусият ва самаранокии беҳамто бурида тавонад.

Илова бар ин, Cas9 бисёрҷонибаи назаррасро нишон дод. Он метавонад пайдарпайии геномиро дар прокариотҳо, эукариотҳо, ширхӯрон ва ҳатто дар ҳуҷайраҳо ва ҷанинҳои инсон ба таври муассир ва махсус бурида, никоҳ ва пайваст кунад. Ин универсалӣ барои як қатор пешрафтҳои нав дар муҳандисии геномӣ ва назорати экспрессия роҳ кушод. Ин вебсайт биохимияи аслии CRISPR/Cas9-ро меомӯзад ва кӯшиш мекунад фаҳмонад, ки чӣ аз ҷиҳати биохимиявӣ Cas9-ро дар кори худ ин қадар хуб мекунад. Кӯтоҳаш:

CRISPR/Cas9 роҳи муассир ва чандирро барои ба таври интихобӣ ҳадаф гирифтан ва ҷудо кардани ДНК таъмин мекунад. Протеини Cas9 рахҳои дукаратаро тавассути доменҳои мустақили RuvC ва HNH нуклеаза дар ҳадафе, ки молекулаи роҳнамои РНК муайян кардааст, тавлид мекунад. Усулҳои мавҷудаи таҳрири геном, ба монанди таъмири гомологӣ ба эҷоди танаффусҳои дукарата такя мекунанд. Азбаски молекулаи роҳнамои РНК метавонад барои ҳадафи пайдарпайии нуклеотидҳои гуногун тағир дода шавад, усулҳои CRISPR/Cas9 нисбат ба дигар усулҳои муқарраршудаи биологияи молекулавӣ интихоби бештарро таъмин мекунанд.

Тасвир: Диаграммаи карикатураи Cas9 бо истифода аз 2 домени нуклеазаи худ барои ҷудо кардани молекулаи ДНК-и ҳадаф дар маконе, ки аз ҷониби протоспайсери мотиви ҳамсоя (NGG) ва 20 роҳнамои нуклеотидҳои РНК муайян шудааст. (расми аслӣ)

Ғайр аз он, маҷмӯи Cas9 тавассути механизми пайваст кардани ДНК-и худ ДНК-ро самаранок ҳадаф қарор медиҳад. Азбаски як домени нуклеазро бидуни таъсир ба дигараш ғайрифаъол кардан мумкин аст, комплекси Cas9 метавонад ба никаза табдил дода шавад. Интихобан, ғайрифаъол кардани ҳарду домени нуклеаз як комплекси хеле мушаххаси ДНК-ро ба вуҷуд меорад. Ин усулҳои гуногуни шинохтан ва ғайрифаъолкунии генҳо CRISPR/Cas9-ро як имконияти ҳаяҷонбахш барои таҳрири мақсадноки геном мекунанд.


Ташаккур

J.v.d.O. аз ҷониби Ташкилоти Нидерланд оид ба тадқиқоти илмӣ (NWO) тавассути гранти TOP (714.015.001) дастгирӣ карда мешавад. J.L аз ҷониби барномаи гравитация аз Ташкилоти Нидерландия оид ба тадқиқоти илмӣ (NWO) дастгирӣ карда мешавад. Кори Р. қисми Институти Oncode мебошад, ки қисман аз ҷониби Ҷамъияти саратони Ҳолланд маблағгузорӣ карда мешавад ва аз ҷониби барномаи гравитатсионӣ аз NWO маблағгузорӣ карда мешавад. Кори Н. қисман аз ҷониби Stichting Singelswim Utrecht, Stichting FSHD ва TKI / Health Holland дастгирӣ карда мешавад.


Системаи CRISPR-Cas дар прокариотҳо ДНК-ҳои паразитӣ ва вирусҳоро дақиқ муайян мекунад ва онҳоро нест мекунад. Системаи CRISPR-Cas барои таҳрири соддаи геном мутобиқ карда шудааст, ки аз давраи нав дар биологияи молекулавӣ мужда мерасонад. Цзян ва дигарон. нишон медиҳад, ки нуклеазаи Cas9 ҳангоми пайваст шудан ба RNA дастури ҳадаф тасдиқи мушаххасро қабул мекунад. РНК-и роҳнамо пас аз он шакли пешакӣ фармоишшударо мегирад. Ҳамин тариқ, ин "минтақаи насли РНК" омода аст, ки эътирофи пайдарпаии ҳадафи ДНК-ро оғоз кунад.

Иммунитети мутобиқшавии бактериявӣ протеинҳои CRISPR (кластерӣ, ки мунтазам байни фосилаи такрори кӯтоҳи палиндромикӣ) -и алоқаманд (Cas) ва транскриптҳои CRISPR барои таназзули ДНК-и хориҷӣ истифода мешавад. Дар системаҳои навъи II CRISPR-Cas, фаъолсозии эндонуклеазаи Cas9 барои шинохти ДНК ҳангоми пайвастшавии роҳнамо бо РНК бо механизми номаълум ба амал меояд. Сохторҳои кристаллии Cas9, ки ба РНК-и як роҳнамо пайвастанд, конформацияеро ошкор мекунанд, ки ҳам аз ҳолати апо ва ҳам бо ДНК алоқаманд фарқ мекунанд, ки дар он пайдарпаии 10-нуклеотиди РНК “тухми” барои пурсиши ибтидоии ДНК дар конформатсияи шакли А фармоиш дода шудааст. Ин сегменти РНК-и роҳнамо барои Cas9 барои ташаккули сохтори шинохти ДНК муҳим аст, ки омода аст бо пайдарпаии ҳадафҳои дуқабата ДНК ворид шавад. Мо инро ҳамчун эволютсияи конвергентии механизми "тухмӣ" шарҳ медиҳем, ки механизмеро, ки сафедаҳои Argonaute ҳангоми дахолати РНК ба эукариотҳо истифода мебаранд, ба ёд меорад.

Протеинҳои CRISPR-Cas дар якҷоягӣ бо RNA-ҳои баркамол CRISPR (crRNAs) барои муайян ва ҷудо кардани пайдарпаии ҳадафҳои иловагӣ дар кислотаҳои нуклеинҳои хориҷӣ фаъолият мекунанд (1). Дар системаҳои навъи II CRISPR, ферменти Cas9 ДНК-ро дар маконҳое, ки аз ҷониби сегменти роҳнамои 20-нуклеотид (nt) дар дохили crRNA-ҳо муайян карда шудааст ва дар якҷоягӣ бо крРНК-и транс-фаъолкунанда (tracrRNA) ҷудо мекунад.2), ки сохтори гибридии crRNA: tracrRNA-ро ташкил медиҳад, ки қодир ба ассотсиатсияи Cas9 (3). Пас аз он ки дар ДНК-и мақсаднок ҷамъ карда шуданд, доменҳои нуклеазаи Cas9 HNH ва RuvC пайдарпаии ДНК-и дуқабата (dsDNA)-ро дар дохили риштаҳо ҷудо мекунанд, ки мутаносибан ба сегменти роҳнамои РНК комплементарӣ ва ғайримукаммал мебошанд (3, 4) (расми 1А). Бо муҳандисии як РНК-и синтетикии як роҳнамо (sgRNA), ки crRNA ва tracrRNA-ро ба як транскрипти ягонаи аз 80 то 100 нт муттаҳид мекунад (расми 1В), Cas9:sgRNA ҳамчун як системаи ду компоненти барномарезишаванда барои муҳандисии геном дар соҳаҳои гуногун истифода шудааст. организмҳо (5, 6).

(А) Ташкилоти домени сафедаи навъи II-A Cas9 аз S. pyogenes (SpyCas9). (Б) Диаграммаи сохтори дуюмдараҷаи sgRNA, ки ба минтақаи 20-bp ДНК λ1 мукаммал аст. Пайдарпаии тухмӣ бо ранги беж қайд карда шудааст. Сутунҳои байни ҷуфтҳои нуклеотидҳо нуқтаҳои ҷуфтҳои каноникии Уотсон-Крикро нишон медиҳанд, ки таъсири мутақобилаи ҷуфтҳои ғайриканоникии пойгоҳҳоро нишон медиҳанд. Таъсири мутақобилаи stacking базавӣ бо як мураббаъ пур нишон дода мешавад. (C) Сохтори сеюми sgRNA дар тасвири лента, бо сигма-А вазншудаи таркибшудаи 2ФобФҳисоб харитаи зичии электрон контур дар 1,5σ. (Д) Диаграммаи лентаи комплекси SpyCas9-sgRNA, ки дар расми 1, A ва B муайян шудааст, бо ранг рамзгузорӣ шудааст. (Э) Намоишҳои рӯизаминии сохтори кристаллии SpyCas9 дар маҷмӯа бо sgRNA (дар мультфилм тасвир шудааст) ҳамон намуди дар расми 1D ва намуди гардиши 180°-ро нишон медиҳад.

Фоидаи Cas9 барои ҳам иммунитети бактериявӣ ва ҳам барномаҳои муҳандисии геномӣ ба интихоби дақиқи ҳадафи ДНК такя мекунад. Интихоби ҳадаф ба ҷуфтшавии пойгоҳҳо байни ДНК ва пайдарпаии 20-нтаи роҳнамои РНК, инчунин мавҷудияти як ҷуфти 2-4-базавӣ (bp) протоспакери проксималии мотиви ҳамсоя (PAM) ба макони ҳадаф такя мекунад.3, 4). Мукаммалии ҳадафи пайдарпаии "тухмӣ" дар сегменти роҳнамои crRNAs барои шинохти ДНК ва тақсимшавӣ муҳим аст (7, 8). Дар системаҳои навъи II CRISPR, Cas9 ба ҳадафҳо тавассути шинохтани PAM ва ҷустуҷӯи ДНК-и ҳамсоя барои мукаммал будан ба пайдарпаии 10-12-nt “тухми” дар охири 3′ охири сегменти РНК роҳнамо пайваст мешавад (расми 1B) (3, 911). Сохторҳои булӯрии Cas9 ба sgRNA ва риштаи ДНК-и ҳадаф, ки бо ё бе риштаи ғайриҳадафдори PAM доранд, тамоми сегменти 20-нти роҳнаморо нишон медиҳанд, ки бо риштаи ДНК мавриди ҳадаф қарор доранд (12, 13). Чӣ гуна минтақаи "тухмӣ" дар дохили РНК-и роҳнамо пайванди ДНК-ро муайян мекунад, номаълум боқӣ мондааст.

Барои муайян кардани он, ки чӣ гуна Cas9 пеш аз шинохти субстрат бо РНК роҳнамо ҷамъ мешавад ва ҷойгир мекунад, мо сохтори кристаллии каталитикии фаъолро ҳал кардем. Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9) дар мураккаб бо sgRNA 85-nt дар ҳалли 2,9 Å (расми 1 ва ҷадвали S1). Сохтори умумии комплекси бинарии Cas9-sgRNA, ки ҳолати пеш аз ҳадаф алоқаманди ферментро ифода мекунад, ба меъмории билобеди ҳолати ДНК-и мақсаднок, тавре ки дар таҳқиқоти электронии микроскопӣ мушоҳида шудааст, шабоҳат дорад.14), бо сегменти роҳнамоии sgRNA дар канали марказӣ дар байни лобҳои шинохти нуклеаз ва спирал ҷойгир шудааст (расми 1, C то E). Ин меъмории сохторӣ ва созмони роҳнамоии РНК дар сохтори кристаллии версияи васеъ истифодашавандаи нуклеазаи ғайрифаъол аз Cas9 (D10A/H840A, бо dCas9 номида мешавад) дар маҷмӯа бо sgRNA нигоҳ дошта мешавад (расми S1).

Муқоисаи сохторҳои булӯрии SpyCas9, ки танҳо сафеда ва ҳолатҳои бо РНК ва РНК-ДНК алоқаманди ферментро намояндагӣ мекунанд, табиати чандирии конформатсионии Cas9-ро ҳангоми пайвастани sgRNA ва шинохти ҳадафи ДНК ошкор мекунад (расми 2А ва расмҳои S2 ва S3). Лоби шинохти спиралӣ ҳангоми пайвастшавии sgRNA, вале пеш аз ассотсиатсияи ДНК, махсусан дар домени спиралии 3, ки ҳамчун ҷисми сахт ҳаракат мекунад, тағироти ҷиддиро аз сар мегузаронад.

65 Å ба наздикии домени HNH (расми S2D). Ҷойгиршавии комплекси пеш аз ҳадаф вобаста ба Cas9-sgRNA ба сохторҳои бо ДНК-и ҳадаф алоқаманд тағйироти минбаъдаи конформатсионӣ, аз ҷумла тағирёбии хоксорона дар доменҳои спиралии 2 ва 3, инчунин ҷойгузинии ҳамзамон домени HNH ба сӯи риштаи ҳадафро ошкор мекунад ( Расми 2А ва расми S2, E ва F). Якҷоя бо маълумоти маҳдуди протеолиз (расми 2B ва расми S4), ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки пайвастшавии sgRNA тағйироти асосии конформатсионӣ дар дохили Cas9 (14), гарчанде ки азнавсозии сохтории иловагӣ ҳангоми пайвастшавии ДНК субстрат ба амал меояд. Ҷолиб он аст, ки дуплекси ДНК-и ба роҳнамо номувофиқ як намунаи протеолитикии шабеҳеро, ки барои Cas9 вобаста ба sgRNA мушоҳида мешавад (расми S4B) медиҳад, ки нишон медиҳад, ки конформатсияи пешакии Cas9-sgRNA барои шинохти PAM салоҳиятдор аст, зеро пеш аз ҳадаф тағироти минбаъдаи конформатсия талаб карда намешавад. Пайвастагии ДНК.

(А) Муқоисаи сохторӣ байни комплекси Cas9-sgRNA (ҳадафи пешакӣ) ва сохтори бо ДНК алоқаманд (PDB ID 4UN3) (инчунин ба филмҳои S1 ва S2 нигаред). Дарозии вектор бо миқёси ҳаракати домен алоқаманд аст. Тирҳои сиёҳ ҳаракатҳои доменро дар дохили Cas9-sgRNA ҳангоми пайвастшавии ДНК ҳадаф нишон медиҳанд. (Б) Протеолизи маҳдуд барои санҷидани тағироти васеъмиқёси конформатсияи Cas9 ҳангоми пайвастшавии sgRNA ва шинохти ҳадафи ДНК. (C) Ҷойгиркунии комплекси пешакии Cas9-sgRNA бо сохторҳои бо ДНК алоқаманд. Барои равшанӣ, танҳо домени CTD-и PAM нишон дода шудааст. (Д) Намоиши наздики канали тухмипошак дар тасвири рӯизаминӣ. (Э) sgRNA-ҳои иловашуда дар ҳолати пешакӣ (беж) ва ҳадафи бо ДНК алоқаманд (сиёҳ ва норанҷӣ) бо танҳо сегментҳои роҳнамо барои равшанӣ нишон дода шудаанд. Меҳвари спиралӣ бо хати нуқта нишон дода шудааст. Кунҷҳои диэдралӣ (θ) байни нуклеобазаҳои сегменти роҳнамо ва кунҷҳои гетеродуплекси шакли А-РНК-ДНК дар сохторҳои бо ДНК алоқаманд дар қавс нишон дода шудаанд. (Ф) Схематикӣ нишон додани ҳамкории калидии SpyCas9 бо пайдарпаии тухмии sgRNA. Дар дохил тағйироти конформии Tyr 450 ҳангоми ҳатмии ҳадаф таъкид мекунад.

Пайвастшавии як қатори роҳнамои РНК фармоиши минтақаи шинохти PAM-и Cas9-ро ба вуҷуд меорад. Дар сурати набудани sgRNA, домени C-терминали (CTD) бо PAM мутақобилаи Cas9 асосан бетартиб аст (расми S2A) (14). Бо вуҷуди ин, дар Cas9-sgRNA маҷмааи пеш аз ҳадаф басташуда ва сохторҳои бо ДНК алоқаманд, домени PAM-таъсири CTD барои ҷойгир кардани дуплекси PAM сохта шудааст (расми 2C). Ду аргинини муҳим зиндагӣ мекунанд (Arg 1333 ва Arg 1335), ки дар шинохти 5′-NGG-3′ PAM (13) дар сохтори Cas9-sgRNA пешакӣ ҷойгир карда шудаанд, то динуклеотиди GG-ро дар риштаи ДНК ғайриҳадаф эътироф кунанд. Ин маълумоти биохимиявиро мефаҳмонад, ки маҷмӯи Cas9-sgRNA эътирофи PAM-ро ҳамчун як қадами ҳатмӣ барои муайян кардани сайтҳои эҳтимолии ҳадафи ДНК истифода мебарад (9).

Дар сохтори Cas9-sgRNA, РНК конфигуратсияи L-шаклро қабул мекунад, ки дар он сегменти роҳнамои 5' дар наздикии фазоӣ ба ҳалқаи 1-и sgRNA ҷойгир аст (расми 1C ва расми S5). Similar to the DNA-bound Cas9 complexes, Cas9 in the pre–target-bound state makes extensive hydrogen-bonding contacts and aromatic stacking interactions with the crRNA repeat:tracrRNA anti-repeat duplex and stem loop 1 (fig. S6) (12, 15). In contrast to the sgRNA scaffold (nucleotides G21 to U82) for which clear electron density is observed, we observed unambiguous electron density for only 10 of the 20 nucleotides of the guide RNA segment (nucleotides 11 to 20 Fig. 1, B and C), all of which are located in the seed region. Nucleotides 1 to 10 of the guide RNA segment, although present in the crystals (fig. S1), are disordered. The ordered seed nucleotides (G11 to C20, counting from the 5′ end of the sgRNA) are threaded through the narrow nucleic acid–binding channel formed between the two Cas9 lobes, with their bases facing outward (Fig. 2D and fig. S7). Nucleotides G19, C20, and G11 to U13 are exposed to bulk solvent, whereas nucleotides G14 to C18 are shielded from solvent by helical domain 2. The solvent-exposed PAM-proximal seed nucleotides G19 and C20 are therefore positioned to serve as the nucleation site for initiating target binding. This explains how a 2-bp mismatch immediately adjacent to the PAM in the DNA abolishes Cas9 binding and cleavage activity (9).

The single-stranded guide RNA within the seed region maintains a nearly A-form conformation along the ribose-phosphate backbone (Fig. 2E). To maintain this helical configuration, Cas9 makes extensive hydrogen-bonding interactions with phosphates and 2′-hydroxyl groups of the seed nucleotides (Fig. 2F). Such presentation of the seed sequence in a conformation thermodynamically favorable for helical guide:target duplex formation (16) is reminiscent of the guide RNA positioning observed in eukaryotic Argonaute complexes that recognize transcripts by base pairing with a 6-nt RNA seed sequence (fig. S8, A and B) (1719). This situation is distinct from that observed in the type I CRISPR-Cascade targeting complex, in which the entire crRNA guide region is preordered, rather than just the seed segment (fig. S8C) (2022).

Another similarity between the Cas9-bound sgRNA guide segment and the Argonaute-bound microRNA guide segment is the synchronized tilting of bases at each half-helical turn of the RNA strand. In the Cas9-sgRNA complex, a kink introduced by insertion of Tyr 450 between seed nucleobases A15 and G16 results in coordinated tilting of nucleobases G11 to A15 relative to the same region of the guide RNA in the target-bound state (Fig. 2, E and F, and fig. S8A). Notably, the orientation of Tyr 450 shifts by

120° upon target binding (Fig. 2F). The bases G16 to C20 remain in an untilted orientation that is immediately ready for target DNA base pairing. This nonuniformity in base orientation may account for previous observations showing that the 5-nt sequence of the guide RNA that binds to DNA immediately adjacent to the PAM is the most critical segment for Cas9 binding (23).

Structural and biochemical data suggest that guide RNA binding triggers a large structural rearrangement in Cas9. To test whether the seed segment of the RNA itself contributes to formation of an activated Cas9 conformation, we monitored Cas9-sgRNA assembly with the use of a set of progressively truncated guide RNAs containing 0 to 20 nt of the guide segment (N0 to N20 table S2). Limited proteolysis showed that guide RNA binding confers protection from trypsin digestion only when the guide segment has a length of at least 10 nt of the target recognition sequence (N10) (Fig. 3A and fig. S9). The absence of the guide segment results in moderately decreased Cas9 binding affinity for the RNA (fig. S10). Together, these results indicate that despite forming a stable complex with Cas9 (fig. S11), the crRNA:tracrRNA scaffold region of the sgRNA alone fails to induce the target recognition–competent conformation of Cas9.

(А) SDS–polyacrylamide gel electrophoresis of limited trypsin digestion of SpyCas9 in the presence of truncated guide RNAs. (Б) Analytical size-exclusion chromatograms of SpyCas9-sgRNA in the absence or presence of single-stranded target DNA with the indicated number of complementary nucleotides. The dashed line indicates the peak position of stably bound SpyCas9-sgRNA-ssDNA ternary complex eluting from the gel filtration column. (C) Cas9-mediated endonuclease activity time course assays using plasmid and oligonucleotide DNA ( 32 P-labeled on both strands) containing a 20-bp λ1 DNA target sequence and a 5′-TGG-3′ PAM motif. Cn (н = 0, 10, 12, 14, 17, or 20) represents the number of potential guide-target base pairs counted from the PAM end.

To assess the molecular mechanism of Cas9-mediated RNA-DNA hybridization, we first used size exclusion chromatography to evaluate the effects of DNA length on the formation of Cas9-sgRNA-ssDNA (single-stranded DNA) ternary complexes. This analysis showed that target ssDNA length must be at least 10 nt to form a kinetically stable ternary complex with Cas9-sgRNA (Fig. 3B), in good agreement with the requirement for a 10- to 12-bp RNA-DNA heteroduplex to ensure strand propagation observed in Cas9 single-molecule experiments (9, 24). To further explore the importance of the seed region for Cas9-mediated DNA cleavage, we conducted endonuclease activity assays using both plasmid and oligonucleotide DNA substrates and our truncated guide RNAs. The plasmid cleavage assay revealed that the 12-bp seed:DNA heteroduplex is necessary for Cas9-mediated supercoiled plasmid cleavage, which proceeds by nicking first by the RuvC nuclease domain, then by the HNH nuclease domain (Fig. 3C and table S2). These data are consistent with structural observations indicating that the flexible HNH domain can adopt multiple non–catalytically productive states during sgRNA binding and target DNA recognition. In line with previous studies (25), the oligonucleotide cleavage assay showed that the N17 guide RNA displays an almost comparable cleavage rate but much reduced RuvC 3′-5′ exonuclease-trimming activity (3) relative to the N20 guide RNA (Fig. 3C). This trimming activity is more pronounced with the H840A nickase version of Cas9 relative to the D10A nickase version (fig. S12). This observation may explain why the D10A nickase is more efficient than the H840A nickase version of Cas9 when using a double-nicking strategy to enhance genome editing specificity (26).

We propose that the preordered PAM recognition region of the Cas9-sgRNA complex initiates DNA interrogation, followed by base pairing between a short PAM-proximal segment of DNA (1 or 2 bp) and the 3′ end of the seed sequence in the sgRNA (Fig. 4). Conformational changes of Cas9 upon initial DNA binding then accommodate guide RNA strand invasion into and beyond the seed region, triggering additional structural changes necessary for Cas9 to reach a cleavage-competent state. Recent crystal structures of human Argonaute2 bound to a microRNA guide and short RNA target sequences underscore the importance of seed region base pairing for accuracy of target selection (27).

When Cas9 is in the apo state, its PAM-interacting cleft (dotted circle) is largely disordered. In the pretarget state, the PAM-interacting domain and seed sequence from guide RNA are preorganized for PAM recognition, followed by dsDNA melting next to PAM. The nonseed region is disordered and indicated as a dotted line. Base pairing between the seed sequence and the target DNA drives Cas9 into a near-active conformation complete base pairing between the full guide segment and the target DNA strand enables Cas9 to reach a fully active state.

Our results suggest the apparent convergent evolution of a similar mechanism for CRISPR-Cas9. Collectively, our structural and biochemical data show that Cas9 is subject to multilayered regulation during its activation. The preordered RNA seed sequence and protein PAM-interacting cleft enable the Cas9-sgRNA complex to interact productively with potential DNA sequences for target sampling. The inactive conformation of apo Cas9, as well as the additional conformational changes required for the complex to reach its ultimate catalytically active state, could help to avoid spurious DNA cleavage within the host genome and hence minimize off-target effects in Cas9-based genome editing.


Маълумот дар бораи муаллиф

Мансубиятҳо

RNA Therapeutics Institute, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Haiwei Mou, Jordan L. Smith, Lingtao Peng, Chun-Qing Song, Ankur Sheel, Deniz M. Ozata, Erik J. Sontheimer, Melissa J. Moore & Wen Xue

David H. Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, USA

Hao Yin, Qiongqiong Wu, Daniel G. Anderson & Zhiping Weng

Program in Bioinformatics and Integrative Biology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Jill Moore, Xiao-Ou Zhang, Yingxiang Li & Zhiping Weng

Department of Bioinformatics, School of Life Science and Technology, Tongji University, Shanghai, People’s Republic of China

Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, 02142, USA

Harvard-MIT Division of Health Sciences & Technology, Cambridge, MA, 02139, USA

Institute for Medical Engineering and Science, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, USA

Wellstone Muscular Dystrophy Program, Department of Neurology, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Program in Molecular Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Erik J. Sontheimer & Wen Xue

Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Howard Hughes Medical Institute, University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA, 01605, USA

Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, University of Massachusetts Medical School, 368 Plantation Street, Worcester, MA, 01605, USA