Маълумот

Бартариҳои технологияи iTRAQ/TMT аз электрофорез чист?

Бартариҳои технологияи iTRAQ/TMT аз электрофорез чист?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ҳоло ман дар рӯи коғаз оид ба тадқиқоти протеомика кор мекунам. Ман саволҳои зиёдеро номбар кардам, ки донишҷӯёни якум ҳангоми таҳсил дошта метавонанд. Оё касе метавонад (дар асоси таҷрибаи шумо дар лаборатория) афзалиятҳо ва нуқсонҳои технологияи iTRAQ/TMT ва электрофорезро шарҳ диҳад? Кадом техника беҳтар аст?


Ман боварӣ дорам, ки ин мақола метавонад ба саволи шумо ҷавоб диҳад: Саволҳо дар бораи Протеомика (Q1-Q5). Дар он гуфта мешавад, ки 2-DGE технологияи ҷудокунии сафеда мебошад, ки дар якҷоягӣ бо технологияи MALDI-TOF таҳия шудааст. Дар назария, сафедаи умумиро бо фарқияти нуқтаи изоэлектрикӣ (IEF) ва вазни молекулавӣ (SDS-PAGE) як ба як ҷудо кардан мумкин аст. Вазъияти воқеӣ он қадар идеалӣ нест, зеро сафедаи камшуморро бомуваффақият доғдор кардан ва дидан мумкин нест ва сафеда пас аз тағир додани пас аз тарҷума аз мавқеи назариявӣ дур мешавад. 2-DGE метавонад ҳамагӣ 1000-2000 сафедаҳоро муайян кунад. Дар муқоиса бо усулҳои ба электрофорез асосёфта ба монанди 2-DE ва DIGE, iTRAQ/TMT дорои қарори баланд аст. MtoZ Biolabs дар намунаҳои ҳуҷайраҳои коркардкардааш ҳадди аксар 6000 сафеда пайдо кард, ки аксари онҳо маълумоти миқдорӣ ва сифатӣ доранд. Ғайр аз он, iTRAQ-и он дорои ҷараёни баланд аст ва метавонад дар як вақт то 8 намунаро анҷом диҳад. Агар технологияи TMT истифода шавад, он метавонад дар як вақт то 10 намунаро анҷом диҳад, ки махсусан барои муқоисаи ҳамзамон байни намунаҳои сершумор ва муайянкунии динамикии равандҳои биологӣ мувофиқ аст.


Протеомикаи миқдории дақиқи баланд бо истифода аз iTRAQ дар LTQ Orbitrap: Усули нави масс-спектрометрӣ, ки манфиатҳои ҳамаро муттаҳид мекунад

Намоиши мақолаҳо маблағи ба COUNTER мувофиқи зеркашии матни пурраи мақолаҳо аз моҳи ноябри соли 2008 (ҳам PDF ва ҳам HTML) дар тамоми муассисаҳо ва шахсони воқеӣ мебошанд. Ин нишондиҳандаҳо мунтазам нав карда мешаванд, то истифодабариро то чанд рӯзи охир инъикос кунанд.

Иқтибосҳо шумораи мақолаҳои дигаре мебошанд, ки аз ин мақола истинод мекунанд, аз ҷониби Crossref ҳисоб карда шудаанд ва ҳар рӯз нав карда мешаванд. Маълумоти бештарро дар бораи иқтибосҳои Crossref пайдо кунед.

Холи таваҷҷӯҳи Altmetric як ченаки миқдории таваҷҷӯҳест, ки мақолаи тадқиқотӣ дар интернет гирифта шудааст. Ангуштзании тасвири донут саҳифаеро дар altmetric.com бо тафсилоти иловагӣ дар бораи хол ва ҳузури шабакаҳои иҷтимоӣ барои мақолаи додашуда бор мекунад. Маълумоти бештарро дар бораи Altmetric Attention Score ва чӣ гуна ҳисоб кардани хол дарёфт кунед.


Реферат

Ҳадафи ин тадқиқот муқоиса кардани амиқ ва такроршавандагии протеоми умумӣ ва фарогирии протеинҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда дар нусхаҳои техникӣ ва сегона бо истифода аз реагентҳои iTRAQ 4-plex, iTRAQ 8-plex ва TMT 6-plex буд. Таҳлил аз он сабаб анҷом дода шуд, ки муқоисаи ҳамаҷонибаи такроршавандагии тегҳои изобарӣ дар адабиёт ба таври васеъ гузориш дода нашудааст. Шумораи зиёди сафедаҳо бо 4-плекс, пас аз он 8-плекс ва сипас 6-плекс реагентҳо муайян карда шуданд. Таҳлилҳои миқдорӣ нишон доданд, ки сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда бо реагентҳои 4-плекс нисбат ба реагентҳои 8-плекс ва реагентҳои 6-плекс муайян карда шудаанд. Таҷдиди такрорӣ барои нусхаҳои техникӣ ≥69% ва барои се нусхаи техникӣ ≥57% муайян карда шуд. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки гузаронидани як таҷрибаи 8-plex ё 6-plex ба ҷои таҷрибаи 4-plex боиси мутаносибан 26 ё 39% камтар муайянкунии сафедаҳо гардид. Вақте ки спектрҳои 4-плекс бо се асбоби нармафзор - ProteinPilot, Mascot ва Proteome Discoverer ҷустуҷӯ карда шуданд - шумораи бештари мушаххасоти сафедаҳо бо Mascot ба даст оварда шуданд. Таҳлили назорати манфӣ аҳамияти гузаронидани таҷрибаҳоро ҳамчун такрор нишон дод. Дар маҷмӯъ, ин тадқиқот бартариҳои истифодаи реагентҳои iTRAQ 4-plex нисбат ба iTRAQ 8-plex ва TMT 6-plex реагентҳоро нишон медиҳад, тахминҳои такрори такрории техникӣ ва сегонаро пешниҳод мекунад ва арзиши иҷроиши намунаҳои такрориро таъкид мекунад.


Протеомика: техника

Усулҳои пастсифат:

1. Усулҳои ба антитело асосёфта

Усулҳо ба монанди ELISA (таҳлили иммуносорбенти бо фермент алоқаманд) ва blotting ғарбӣ ба мавҷудияти антителоҳо, ки ба сафедаҳо ё эпитопҳои мушаххас нигаронида шудаанд, барои муайян кардани сафедаҳо ва миқдори ифодаи онҳо такя мекунанд.

2. Усулҳои ба гел асосёфта

Электрофорези дученакаи гелӣ (2DE ё 2D-PAGE), аввалин техникаи протеомикӣ таҳия шудааст, ҷараёни барқро барои ҷудо кардани сафедаҳо дар gel аз рӯи заряд (андозаи 1) ва масса (андозаи 2) истифода мебарад. Электрофорези дифференсиалии гел (DIGE) як шакли тағирёфтаи 2DE мебошад, ки рангҳои гуногуни флюоресцентиро истифода мебарад, то имкон медиҳад ҳамзамон муқоисаи ду то се намунаи сафеда дар як гел. Ин усулҳои ба гел асосёфта барои ҷудо кардани сафедаҳо пеш аз таҳлили минбаъда тавассути мисол, масс-спектрометрия (MS) ва инчунин барои профили экспрессияи нисбӣ истифода мешаванд.

3. Усулҳои ба хроматография асосёфта

Усулҳои ба хроматография асосёфта метавонанд барои ҷудо ва тоза кардани сафедаҳо аз омехтаҳои мураккаби биологӣ ба монанди лизатҳои ҳуҷайра истифода шаванд. Масалан, хроматографияи мубодилаи ион сафедаҳоро аз рӯи заряд ҷудо мекунад, хроматографияи истисноии андоза сафедаҳо аз рӯи андозаи молекулавӣ ҷудо мекунад ва хроматографияи наздикӣ таъсири мутақобилаи баръакс байни лигандҳои наздики мушаххас ва сафедаҳои ҳадафи онҳоро истифода мебарад (масалан, истифодаи лектинҳо барои тоза кардани IgM ва IgA молекулаҳо). Ин усулҳоро барои тоза кардан ва муайян кардани сафедаҳои манфиатдор, инчунин барои омода кардани сафедаҳо барои таҳлили минбаъда аз ҷониби масалан, MS дар поёноб истифода бурдан мумкин аст. 8

Усулҳои баландсифат:

1. Микромассивҳои таҳлилӣ, функсионалӣ ва баръакс


Боздид аз кашфи биомаркер аз ҷониби протеомикаи плазма

Таҳлили клиникии хун як усули паҳншудаи ташхис дар тиб мебошад ва биомаркерҳои хун барои гурӯҳбандӣ кардани беморон ва дастгирии қарорҳои табобат истифода мешаванд. Аммо, биомаркерҳои мавҷуда аз ҳамаҷониба дуранд ва аксар вақт хусусият надоранд ва навҳои нав бо суръати хеле суст таҳия карда мешаванд. Тавре ки дар ин барраси тавсиф шудааст, протеомикаи масс-спектрометрия (MS) ба як технологияи пуриқтидор дар таҳқиқоти биологӣ табдил ёфтааст ва ҳоло он омода аст, ки тавсифи протеомаи плазмаро амиқтар кунад. "Стратегияҳои секунҷаи" қаблӣ ба дарёфти номзадҳои ягонаи биомаркер дар гурӯҳҳои хурд нигаронида шудаанд ва пас аз он, иммуноассайсҳои классикӣ дар гурӯҳҳои васеътари тасдиқкунӣ. Мо стратегияи профили протеоми плазмаи "росткунҷа" -ро пешниҳод менамоем, ки дар он намунаҳои протеомҳои когортҳои калон бо фенотипҳои онҳо дар саломатӣ ва беморӣ алоқаманданд. Тарҷумаи чунин мафҳумҳо ба амалияи клиникӣ таҷдиди сохтори якчанд ҷанбаҳои қабули қарорҳои ташхисиро талаб мекунад ва мо баъзе қадамҳои аввалинро дар ин самт баррасӣ мекунем.

Муқаддима

Нақши марказӣ ва муттаҳидкунандаи хун дар физиологияи инсон маънои онро дорад, ки он бояд инъикоси универсалии ҳолат ё фенотипи шахс бошад. Ҷузъҳои ҳуҷайравии он эритроситҳо, тромбоситҳо ва лимфоситҳо мебошанд. Қисми моеъро плазма, вақте ки ҳамаи ҷузъҳо нигоҳ дошта мешаванд ва зардоб, вақте ки каскади коагулятсия фаъол шудааст (лахташавии хун) номида мешавад. Барои содда кардан, мо истилоҳи "плазма" -ро истифода хоҳем кард, на "зароба", зеро аксари хулосаҳо ба ҳарду дахл доранд.

Консентратсияи ҷузъҳои гуногуни плазма дар амалияи клиникӣ мунтазам муайян карда мешавад. Ба онҳо электролитҳо, молекулаҳои хурд, доруҳо ва сафедаҳо дохил мешаванд. Сафедаҳое, ки протеомаи плазмаро ташкил медиҳанд, метавонанд ба се синфи гуногун тақсим карда шаванд (расми 1А ва В). Якум дорои сафедаҳои фаровонест, ки дар хун нақши функсионалӣ доранд. Ба онҳо альбумини хунобаи инсон (HSA, тақрибан нисфи массаи умумии сафеда) аполипопротеинҳо дохил мешаванд, ки дар интиқоли липидҳо ва протеинҳои марҳилаи шадиди гомеостазии аксуламали иммунии модарзод ва сафедаҳои каскади коагулятсия нақши муҳим доранд. Синфи дуюм сафедаҳои ихроҷи бофтаҳо мебошанд, ки дар гардиш вазифаи махсус надоранд. Намунаҳо ферментҳо ба монанди аспартатаминотрансфераза (ASAT) ва аланинаминотрансфераза (ALAT), ки барои ташхиси бемориҳои ҷигар истифода мешаванд, инчунин изоформаҳои сатҳи пасти бофтаҳои сафедаҳо ба монанди тропонинҳои дил мебошанд. Синфи сеюм молекулаҳои сигнализатсия ба монанди гормонҳои сафедаи хурд (масалан, инсулин) ва ситокинҳо мебошанд, ки одатан дар ҳолати устувор миқдори хеле кам доранд ва ҳангоми зарурат танзим карда мешаванд. Сатҳи ибтидоии цитокин интерлейкин-6 (IL-6) 5 пг/мл буда, диапазони динамикии протеомаи плазмаро дар муқоиса бо консентратсияи сафедаи фаровонтарини HSA бо тақрибан 50 мг/мл ташкил медиҳад. мл.

Расми 1. Санҷиши лабораторӣ дар асоси хун дар шароити клиникӣ

Дар истифодаи қабулшуда, "биоморкер хусусияти муайяншудаест, ки ҳамчун нишондиҳандаи равандҳои муқаррарии биологӣ, равандҳои патогенӣ ё посух ба таъсир ё дахолат чен карда мешавад" (FDA-NIH: Biomarker-Working-Group, 2016). Бо мақсади ин барраси, мо махсусан ба биомаркерҳои сафеда ё тағир додани сафеда тамаркуз мекунем. Ба ин маъно, зиёда аз 100 озмоишҳои клиникии плазма ё хунобаи аз ҷониби FDA тасдиқшуда ё FDA тасдиқшуда мавҷуданд, асосан дар синфи фаровони функсионалӣ (50%), пас аз он маркерҳои ихроҷи матоъ (25%) ва боқимонда лигандҳои ретсепторӣ мавҷуданд. , иммуноглобулинҳо ва секрецияҳои аберрантӣ (Андерсон, 2010). Аксари инҳо даҳсолаҳо доранд ва сатҳи ҷорӣ намудани маркерҳои нав дар як сол камтар аз ду нафар аст (Андерсон ва дигарон, 2013). Санҷиши маъмулӣ аз таҳлили ферментативӣ ё иммуноассай бар зидди як ҳадаф иборат аст. Клиникҳо натиҷаҳоро дар якҷоягӣ бо дигар маълумоти беморон, дар асоси дониши коршиносии худ шарҳ медиҳанд. Таносуби фаровонӣ танҳо дар ҳолатҳои мушаххас истифода мешавад. Намунаҳо таносуби 60-солаи Де Ритиси ASAT/ALAT барои фарқ кардани сабабҳои бемории ҷигар мебошанд (De-Ritis) ва дигарон, 1957) ё таносуби навтарини sFlt-1/PlGF барои ташхиси преэклампсия (Левин) ва дигарон, 2004 ).

Баръакси усулҳои ферментативӣ ва антитело, протеомика дар асоси масс-спектрометрия (MS) спектрҳои масса ва фрагментатсияи пептидҳоро, ки аз ҳазми пайдарпайии сафедаҳо ба даст омадаанд, чен мекунад. Азбаски массаҳо ва пайдарпаии ин пептидҳо нодиранд, протеомика табиатан мушаххас аст, мушкилоти доимӣ бо санҷишҳои ферментҳои колориметрӣ ва иммуноассайҳо (Wild, 2013). Аслан, протеомика дар асоси MS метавонад ҳамаи сафедаҳо дар система - протеомаи онро таҳлил кунад ва ба ин маъно беғаразона ва гипотеза озод аст (Aebersold & Mann, 2016). Ғайр аз он, усулҳои MS барои кашф ва муайян кардани тағиротҳои пас аз тарҷума (PTM) дар сафедаҳо комилан мувофиқанд. Ин PTMҳо инчунин метавонанд асоси санҷишҳои ташхисӣ бошанд, ба монанди сатҳи HbA1c, ки ҳамчун хондани таъсири дарозмуддати глюкоза дар заминаи диабет хидмат мекунанд. Бо вуҷуди ин, ҳеҷ яке аз озмоишҳои мунтазами лабораторӣ дар плазма ба сафедаҳо асос ёфтааст, ки бо равишҳои масс-спектрометрӣ муайян карда шудаанд ва дар таҳлили муқаррарӣ, MS то ҳол танҳо барои чен кардани молекулаҳои хурд ба монанди доруҳо ва метаболитҳо истифода мешавад (Vogeser & Seger, 2016 ).

Дар тӯли солҳои охир, технологияи протеомика дар асоси MS ба таври назаррас такмил ёфт ва он ҳоло як асоси тамоми таҳқиқоти биологӣ мебошад, ки сафедаҳоро дар бар мегирад (Cox & Mann, 2011 Altelaar & Heck, 2012 Ричардс ва дигарон, 2015 Чжан ва дигарон, 2016). Махсусан, иҷрои он ба таври устувор ба ҳассосият ва диапазони динамикӣ табдил ёфтааст, ки онро барои омӯзиши биомаркер ҷолиб мегардонад. Ин барраси ба дурнамои муайян кардани сафедаҳои хун тавассути масс-спектрометрия тамаркуз хоҳад кард. Мо имрӯз аз арзёбии таҷрибавӣ нақши сафедаҳо дар ташхиси клиникӣ оғоз мекунем ва адабиётро дар бораи кӯшишҳои қаблии дарёфти биомаркерҳо дар плазма тавассути протеомика дар асоси MS ба таври муфассал баррасӣ мекунем. То ба ҳол, стратегияҳои протеомика таҳқиқоти васеъи чанд намунаро дар бар гирифтаанд, ки бо равишҳои мақсаднок дар гурӯҳҳои калонтар пайравӣ мекунанд. Мо муҳокима мекунем, ки чӣ гуна пешрафтҳои охирин дар технология ҳоло стратегияи наверо фароҳам меоранд, ки дар он протеомаҳои амиқ барои бисёр вақтҳо ва иштирокчиён бо умеди пайдо кардани биомаркерҳо ва панелҳои биомаркерҳо чен карда мешаванд. Мо боварӣ дорем, ки протеомика дар давоми даҳсолаи оянда як қисми реҷаи инструменталӣ дар лабораторияи клиникӣ хоҳад шуд ва ҳатто метавонад дар ояндаи дур технологияҳои кунуниро аз байн барад.

Дараҷаи кунунии ташхиси клиникӣ дар асоси протеин

Санҷишҳои лаборатории хун ва моеъҳои бадан ба ташхис ё тасдиқи беморӣ, пешгӯии хатар, мониторинги пешгӯӣ ва арзёбии самаранокии табобат нигаронида шудаанд. Одатан тахмин карда мешавад, ки 70% ташхисҳо тавассути санҷиши хун огоҳ карда мешаванд, гарчанде ки ин рақам дуруст тасдиқ нашудааст. Дар Институти тибби лаборатории беморхонаи донишгоҳии Мюнхен, барои аксарияти беморони статсионарӣ дар як лаҳза ҳангоми бистарӣ санҷиши лабораторӣ таъин карда мешавад (77% Расми 1C). Ин фраксия дар бемороне, ки дар яке аз амбулаторияҳои беморхона мушоҳида мешаванд, хеле хурдтар аст (31% Расми 1D). Ин рақамҳо нишон медиҳанд, ки беморони дар беморхона бистарӣшуда, ки одатан беморанд, нисбат ба беморони амбулаторӣ бештар ташхисҳои лабораторӣ мегиранд. Дар асоси шумораи таҳлилҳои дархостшуда, реҷаи клиникӣ сафедаҳо (42% таҳлилҳо), пас аз он молекулаҳои хурд (35%) ва ҳуҷайраҳо (17%) бартарӣ доранд (расми 1E). Ҳамин тариқ, аллакай имрӯз сафедаҳо дар амалияи клиникӣ синфи бештари таҳлилшавандаи лабораторӣ мебошанд. Мо инчунин қайд мекунем, ки усулҳои мувофиқ барои муайян кардани сафедаҳои плазма ҳиссаи калонтарини ҷаҳонро доранд in vitro ташхис.

Таҳлилҳои лабораторӣ барои сафедаҳои плазма ё ба химияи клиникии классикӣ, бо истифода аз фаъолияти ферментативии сафедаҳои муайяни плазма ё ба иммуноассайсҳои антитело асос ёфтаанд. Хароҷоти таҳлилҳои ферментативӣ танҳо дар ҳудуди цент аст ва онҳо дар анализаторҳои автоматии баландсуръат кор мекунанд, ки дар як соат то 10 000 натиҷаи санҷиш медиҳанд. Баръакси ин, иммуноассайҳо гаронтаранд (одатан чанд евро/доллар барои як намуна) ва интиқоли анализаторҳои автоматии дахлдор тақрибан 1000 санҷиш дар як соат аст. Химияи калони клиникӣ ва инчунин анализаторҳои ба иммуноассай асосёфта метавонанд реагентҳоро барои зиёда аз 100 параметрҳои гуногуни таҳлилӣ интиқол диҳанд. Афзалиятҳои асосии иммуноассайҳо дараҷаи бештари чандирӣ аз сабаби дастрас будан ба сафедаҳои плазмаи бе фаъолияти ферментативӣ ва ҳассосияти хеле баландтар мебошанд. Масъалаи дигаре, ки аз ҷиҳати клиникӣ муҳим аст, вақти зарурӣ барои санҷиши лабораторӣ мебошад. Аз сабаби зарурати қабули қарори фаврӣ, аксарияти таҳлилҳои ферментативӣ ва якчанд иммунотазияҳо бояд то вақти таҳлили < 10 дақиқа кам карда шаванд. Дар маҷмӯъ, иммуноассайҳо нисбат ба таҳлилҳои ферментативӣ бештар вақт мегиранд, аммо аксарияти мутлақи иммуноассайҳои автоматии ҷорӣ на бештар аз 30 дақиқаро талаб мекунанд.

Баррасии мунтазами протеомикаи плазма дар асоси MS дар таҳқиқоти биомаркер

Протеинҳои плазма аллакай дар солҳои 1990-ум тавассути электрофорези дученакаи гелӣ, баъзан дар якҷоягӣ бо MS муайян кардани нуқтаҳои экссизӣ тафтиш карда шуданд. Аммо, инҳо умуман танҳо якчанд даҳҳо сафедаҳоро муайян карданд ва азбаски онҳо пеш аз протеомика дар асоси MS буданд, онҳо дар ин барраси муҳокима карда намешаванд. Даъвоҳои ошкорсозии барвақти саратон дар асоси спектрҳои хеле пасти MALDI-и плазма, ки намунаҳо ба вуҷуд овардаанд, аммо мушаххасоти сафеда надоранд (Petricoin) ва дигарон, 2002) исбот нашудааст (Баггерли ва дигарон, 2004) ва ин технологияҳо имрӯз асосан партофта шудаанд.

Барои ба даст овардани маҷмӯаи ҳамаҷонибаи нашрияҳо, ки бо таҳқиқоти биомаркерҳои плазма ва бо истифода аз протеомика дар асоси MS машғуланд, мо ҷустуҷӯи бемаҳдудияти PubMed анҷом додем, ки ҳамҷоя будани истилоҳҳои “биомаркер”, “плазма Ё хуноба”, “протеом”, “протеомика”, ва «масс-спектрометрия». Ин рӯйхати ибтидоии 947 нашрияро дод, ки 103-тои онҳо баррасиҳо буданд. Мо минбаъд тадқиқотҳоеро, ки бо субъектҳои инсонӣ сарукор надоштанд ё плазма ё хунобаро дар бар намегиранд, 381 нашрияи аслии (Dataset EV1) боқӣ гузоштем.

Нашрияҳо дар соли 2002 пайдо шуданд ва ҳадди аксар дар як сол ба 33 адад дар соли 2005 расид, вақте ки шумораи махсус дар бораи протеомаи плазма аз ҷониби Созмони Proteome Human (HUPO) нашр шуд (Omenn). ва дигарон, 2005). Ду максималии дигар дар солҳои 2011 ва 2014 бо 39 ва 43 нашр дар як сол пайдо шуданд ва пас аз он дар соли 2013 ба 24 ва дар 2016 танҳо 20 нашр дар як сол коҳиш ёфт (расми 2А). Динамикаи мушоҳидашуда бо як ҷомеаи афзояндаи муҳаққиқон бо истифода аз протеомика, ки дар ҳазорон нашрияҳо дар як сол инъикос меёбад, бо тамоюли равшани боло муқоиса мекунад. Таносуби нашрияҳои протеомҳои плазма ба нашрияҳои умумии протеомҳо ҳоло < 1% аст ва коҳишро идома медиҳад. Бо назардошти эҳтиёҷоти дақиқи тиббӣ ба биомаркерҳои плазма ва муваффақияти протеомикаи MS дар дигар соҳаҳо, ин саволро ба миён меорад, ки соҳаи протеомикаи плазмаро чӣ нигоҳ медорад.

Расми 2. Баррасии ҳамаҷонибаи адабиёт

Аз 381 нашрияҳои ибтидоӣ, тақрибан нисфи онҳо бо тавсифи таҳлилии ҷараёни коре, ки дар таҳлили плазма истифода мешаванд, машғул буданд, дар ҳоле ки боқимонда саволи физиологӣ ё патофизиологиро таҳқиқ карданд (расми 2В). Тақрибан сеяки онҳо ба саратон, баъд аз он бемориҳои дилу раг (КВ), мавзӯъҳо дар биологияи инсон, илтиҳоб, диабети қанд ва бемориҳои сироятӣ тамаркуз карданд (Расми 2B). Равшан аст, ки ин фармоиш таваҷҷӯҳро ба бемориҳо инъикос мекунад, на эҳтимоли пайдо кардани тағйироти мувофиқ бо технологияи мавҷуда. Танҳо 47% тадқиқотҳо ҳама гуна тасдиқи бозёфтҳои аввалияро доштанд (расми 2C). Дар нисфи ҳолатҳо (24%), инҳо блокҳои оддии ғарбӣ ё ELISA-и сафедаҳои номзад буданд, ки бо ҳамон намунаҳо иҷро карда шуданд, на як гурӯҳи мустақил, ки таҷрибаи маъмулӣ дар таҳқиқоти клиникӣ. Танҳо 36 ҳуҷҷат барои тасдиқи биомаркерҳои эҳтимолӣ, ки мустақилона пешниҳод шуда буданд, протеомикаи асоси MS-ро истифода бурданд (Dataset EV1).

Диапазони бениҳоят баланди динамикии плазма муайян кардани зиёда аз якчанд сад сафедаҳои фаровонро аз ҷониби LC-MS/MS душвор мегардонад. Барои қисман бартараф кардани ин мушкилот, сафедаҳои хеле фаровони плазма одатан тавассути сутунҳо бо антителоҳои иммобилизатсияшуда, ки бар зидди сафедаҳои боло аз 1 то 20 нигаронида шудаанд, кам карда мешаванд (расми 2D). Аммо, ин антителоҳо ҳеҷ гоҳ сафедаҳои комилан мушаххас ва алоқаманд нестанд, ба монанди HSA - худ ба якчанд сафедаҳои дигар наздикӣ доранд (Tu). ва дигарон, 2010 Bellei ва дигарон, 2011). Ҳамин тариқ, намунаи плазмаи тамомшуда ифодаи миқдории протеоми аслӣ нест. Ин махсусан ҳангоми истифодаи "супер-тараф" дуруст аст (Qian ва дигарон, 2008) - омехтаи васеи антителоҳои поликлоналӣ, ки бар зидди тамоми плазма ба вуҷуд омадаанд - ё дандонҳо бо омехтаҳои пептидҳои гексамерӣ, ки протеомаи плазмаро ба таври мушаххас "муқаррарӣ" мекунанд (Туласираман) ва дигарон, 2005).Ғайр аз он, ин равандҳо тағирёбанда ва хароҷоти иловагиро ба ҷараёни кор ворид мекунанд, ки умуман миқдори дақиқи сафедаҳои плазмаро пешгирӣ мекунанд. Аз ин рӯ, истифодаи онҳо дар айни замон бо лоиҳаҳои хурди кашф маҳдуд аст.

Стратегияи дуюм барои мубориза бо диапазони динамикӣ ва мушкилоти ҳассосият фраксияи васеъи плазма мебошад, ки онро метавон бо роҳҳои гуногун дар сатҳи сафеда ё пептид анҷом дод. Якчанд тадқиқотҳо, ки ба фарогирии амиқи протеомаи плазма тавассути камшавии якҷоя ва ҷудошавии васеъ (то садҳо фраксияҳо) аз якчанд сад то якчанд ҳазор сафеда (Лю) муайян карда шудаанд. ва дигарон, 2006 Пан ва дигарон, 2011 Cao ва дигарон, 2012 Кол ва дигарон, 2013 Кешишян ва дигарон, 2015 Ли ва дигарон, 2015). Аҳамият диҳед, ки бисёре аз таҳқиқоти протеоми плазма меъёрҳои мушаххаси омориро нисбат ба суръати кашфи бардурӯғи 1% пептид ва сафеда (FDR), ки дар протеомика дар асоси MS стандартӣ шудаанд, истифода мебаранд.

Пастшавии ҳаҷми интиқолро, ки дар фраксия вуҷуд дорад, қисман тавассути мултиплекс барқарор кардан мумкин аст. Масалан, аз чор то даҳ намуна бо истифода аз стратегияҳои iTRAQ ё TMT якҷоя таҳлил карда шуданд, ки дар он намунаҳо бо барчаспҳои бетарафии оммавӣ нишон дода шудаанд, ки боиси пайдоиши ионҳои гуногуни каммасрафи репортер мешаванд (Kolla ва дигарон, 2010 Чжоу ва дигарон, 2012 Cominetti ва дигарон, 2016). Миқдорӣ тавассути тақсим кардани пептидҳо ва муайян кардани таносуби нисбии ионҳои гузоришдиҳанда ба даст оварда мешавад (Бантшефф ва дигарон, 2008). Ҳарчанд дар принсипи ҷолиб, ин усулҳо одатан аз таҳрифи таносуб, ки аз намудҳои якхелаи пептид ба вуҷуд омадаанд, азият мекашанд, ки ҳама ба як шакли ионҳои хабарнигор саҳм мегузоранд (“фишурдани таносуб”). Танзими сафедаҳои сатҳи хеле паст ё онҳое, ки тағироти хурд, вале ба беморӣ марбутанд, метавонанд комилан пинҳон карда шаванд. Дар протеомикаи тирпарронӣ, пептидҳои элютӣ аз рӯи шиддат тақсим карда мешаванд (ба даст овардани маълумот вобаста), як раванди нимстохастикӣ, ки метавонад боиси гум шудани арзишҳо дар LC-MS/MS гардад. Стратегияҳои ба наздикӣ ҷорӣ кардашудаи ба даст овардани маълумот аз рӯи мустақил пептидҳоро дар тамоми давруҳо устувортар муайян мекунанд (Picotti & Aebersold, 2012 Sajic ва дигарон, 2015). Бо вуҷуди ин, онҳо бо мултиплекссозии репортер-ион мувофиқ нестанд, зеро як миқдори миёнаи гурӯҳҳои пептидҳоро муайян кардан мумкин аст.

Тақрибан дар 30% тадқиқотҳо, намунаҳои плазма ҷамъ карда шуданд, то ба фарогирии дилхоҳи протеоми плазма дар давоми вақти ченкунии дастрас ноил шаванд. Ин равиш тафовутҳои дохили гурӯҳро қурбон мекунад ва сафедаҳои берунӣ ё ифлоскунанда дар намунаҳои инфиродӣ метавонад тамоми гурӯҳро таҳриф кунад ва баҳо додан мумкин аст, ки оё сафедаҳои байни гурӯҳҳо воқеан дар як шахс муҳиманд ё не.

Қисман дар натиҷаи талабот ба вақти асбоб, умуман на бештар аз 20-30 намуна таҳлил карда шуд ва танҳо чанде аз онҳо аз 500 гузашт (Гарсиа-Байло). ва дигарон, 2012 Cominetti ва дигарон, 2016 Ли ва дигарон, 2017). Бо назардошти шумораи зиёди нуқтаҳои ченкунӣ дар дохили намунаҳо, ин рақамҳои хурди намунавӣ мебошанд. Мутаносибан, аксари тадқиқотҳо якчанд «биоморкерҳои эҳтимолӣ»-ро пешниҳод карданд, ки ҳамчун сафедаҳо муайян карда шудаанд, ки дар байни ҳолатҳо ва назорат фарқ мекунанд. Ғайр аз он, бисёре аз ин номзадҳо аз эҳтимол дур нест, ки нишондиҳандаҳои мушаххаси бемории мавриди назар бошанд, зеро онҳо ба категорияҳои биологӣ тааллуқ доранд, ки ба таври ғайримустақим ба ин беморӣ алоқаманданд ё эҳтимолан артефактҳои тайёр кардани намуна мебошанд (масалан, кератинҳо ва сафедаҳои ҳуҷайраҳои сурх) . Хулоса, маҳдудиятҳо дар технологияи протеомика ва тарҳрезии таҷрибавӣ то имрӯз муайян кардани биомаркерҳои ҳақиқиро дар адабиёти нашршуда пешгирӣ кардаанд. Ба маълумоти мо, ягона истиснои имконпазир санҷиши OVA1 мебошад, ки дар он сатҳи сафедаҳои хеле фаровони плазма бета-2 макроглобулин, аполипопротеин 1, трансферрини хуноба ва пеш аз альбумин бо маркери қаблан муқарраршудаи саратони тухмдон CA125 якҷоя карда шудаанд. Нишони танг, аз ҷониби FDA тасдиқшуда (Rai ва дигарон, 2002 Чжан ва дигарон, 2004 ).

Стратегияи кашф ва тасдиқи биомаркер дар асоси MS секунҷа

Бартарии асосии протеомикаи MS дар асоси гипотеза дар он аст, ки дар муқоиса бо ченакҳои ягонаи сафеда дар таҳқиқоти биомаркерҳои классикӣ, ҳеҷ гуна тахмин дар бораи табиат ва шумораи эҳтимолии биомаркерҳо лозим нест. Консепсия, протеомика дар асоси MS тамоми таҳқиқоти эҳтимолии биомаркерро барои ҳар як беморӣ ба як фарзия муттаҳид мекунад ва илова бар ин, робитаи биомаркерҳои эҳтимолиро бо ҳамдигар муайян мекунад. Дар амал, мушкилоти протеомикаи плазма то ба ҳол аз таҳқиқоти амиқ ва миқдорӣ дар гурӯҳҳои калон пешгирӣ кардаанд. Ба ҷои ин, стратегияи марҳила ба марҳила ё "секунҷа" барои кашфи биомаркер, бо якчанд марҳилаҳо, ки дар онҳо шумораи шахсони алоҳида аз якчанд то бисёр меафзояд, дар ҳоле ки шумораи сафедаҳо аз садҳо ё ҳазорҳо то ба чанд кам мешавад (Рифаи) ва дигарон, 2006 Расми 3А).

Расми 3. Парадигмаҳои кунунӣ дар таҳқиқоти биомаркерҳои плазма («муносибати секунҷа»)

Ҷараёни маъмулии протеомикаи кашфи гипотеза дар плазма ба он монанд аст, ки дар дигар соҳаҳои протеомикаи аз поён ба боло истифода мешавад (Aebersold & Mann, 2016 Altelaar & Heck, 2012 Расми 3B). Хулоса, сафедаҳо ба таври ферментативӣ ба пептидҳо ҳазм мешаванд, ки бо хроматографияи моеъи фишори баланд (HPLC) ва бо ионизатсияи электроспрей ҷудо карда мешаванд. Массаҳо ва фаровонии пептидҳо дар спектрометри масса дар сканҳои пурраи MS чен карда мешаванд, дар ҳоле ки қадами минбаъдаи тақсимоти пептидҳо спектрҳои MS/MS барои муайянкунии пептидҳоро ба вуҷуд меорад. Платформаҳои нармафзори хуби протеомикӣ ба таври худкор ва оморӣ пептидҳоро дар ҷустуҷӯи пойгоҳи додаҳо муайян мекунанд ва миқдори онҳоро муайян мекунанд (Cox & Mann, 2008 MacLean ва дигарон, 2010 Рост ва дигарон, 2014). Ғайр аз он, плазма дорои ҷузъҳои хун ба монанди липидҳо мебошад, ки метавонанд сутунҳои HPLC-ро ба осонӣ пӯшанд, ки тартиби махсуси тозакунии пептидҳоро талаб мекунад (Geyer) ва дигарон, 2016а).

Протеомикаи мақсаднок барои санҷиши номзадҳо марҳилаи дуюми стратегияи секунҷа мебошад (расми 3C). Шумораи нисбатан ками сафедаҳо (одатан & lt 10) бо ифодаи дифференсиалӣ дар марҳилаи кашф дар як гурӯҳи калонтар ва идеалӣ мустақил санҷида мешаванд. Азбаски immunoassays аксар вақт дастрас нестанд, усулҳои мақсадноки MS метавонанд истифода шаванд. Паҳншудатарини онҳо «мониторинги реаксияҳои сершумор» мебошад (MRM - баъзан мониторинги реаксияи ягона ё интихобшуда низ номида мешавад - SRM) (Picotti & Aebersold, 2012 Карр ва дигарон, 2014 Эбхардт ва дигарон, 2015). Барои ҳар як сафеда, маҷмӯи пептидҳои мувофиқ интихоб карда мешаванд ва рафтори элюсия ва фрагментатсияи онҳо барои муайян кардани таҳлили MRM арзёбӣ мешавад. Ҳангоми таҳлил, масс-спектрометр барномарезӣ шудааст, ки танҳо ин пептидҳоро ҳангоми элитаҳо пайваста пора кунанд. Бо мониторинги якчанд порчаҳо дар як пептид, метавон ҳатто бо спектрометрҳои массаи пасти ҳассос ва мушаххасро ба даст овард. Бартарии MRM нисбат ба протеомикаи тир барои тафтиш ҳассосият ва қобилияти баландтари он мебошад. Тадқиқотҳои байнилабораторӣ ба такрористеҳсоли хуб ноил гардиданд (Addona ва дигарон, 2009 Abbatiello ва дигарон, 2015), аммо ҳассосиятҳои гузоришшуда одатан ба диапазони консентратсияи пасти нг/мл намерасанд ва қобилиятҳои мултиплексии амалан ба даст овардашуда бо даҳҳо пептидҳо маҳдуданд (Перси) ва дигарон, 2013 Ши ва дигарон, 2013 Обербах ва дигарон, 2014 Ву ва дигарон, 2015). Бо вуҷуди ин, ду таҳқиқоти охирин гузориш доданд, ки ҳадафи сафедаҳои 82 ва 192 мутаносибан (Озжан) ва дигарон, 2017 Перси ва дигарон, 2017). Ҳассосияти MRM метавонад ба диапазони пасти нг/мл ё ҳатто баланд pg/ml тавассути коркарди васеътари намуна бо камшавӣ ё фраксия беҳтар карда шавад (Бюргесс ва дигарон, 2014 Ким ва дигарон, 2015 Ние ва дигарон, 2017 ).

Миқдори мутлақ ва дақиқ стандартҳои дохилиро талаб мекунад - одатан версияҳои изотопҳои вазнини пептидҳои назоратшаванда. Пептидҳои вазнини синтезшуда пас аз ҳозима илова карда мешаванд, ки манбаи нодурусти миқдорӣ ба вуҷуд меоранд, зеро тағирёбии ҳазми сафедаҳо ба назар гирифта намешавад. Инро тавассути ворид кардани пептид дар контексти пайдарпайии аслии худ ҳал кардан мумкин аст, масалан, дар стратегияи SILAC-PrEST, ки дар он дарозии аз 150 то 250-кислотаи аминокислотаҳои ҳар як протеини мавриди таваҷҷӯҳ, ки ба теги миқдор муттаҳид карда шудааст, рекомбинантӣ ифода карда мешавад. дар шакли вазнин (Zeiler ва дигарон, 2012 Эдфорс ва дигарон, 2014 Гейер ва дигарон, 2016а).

Усулҳои мақсаднокро инчунин бо ғанисозии иммунии сафедаҳо ё пептидҳо якҷоя кардан мумкин аст. Масалан, дар "стандартҳои устувори изотопҳо ва забт бо антителоҳои зидди пептидӣ" (SISCAPA) пептидҳои мушаххас дар якҷоягӣ бо ҳамтоёни дорои тамғагузории вазнини худ иммунопреципитатсия карда мешаванд ва пас аз он хондани зуд дар асоси MS (Андерсон) ва дигарон, 2004 Разавӣ ва дигарон, 2016). Ин қобилиятҳои ғанисозии антителоҳоро бо хусусияти муайянкунии MS муттаҳид мекунад, аммо таҳияи таҳлилҳо метавонад душвор ва вақтро талаб кунад - бартариятро дар муқоиса бо усулҳои комилан ба антитело асосёфта танг мекунад.

Марҳилаи ниҳоии стратегияи секунҷа тасдиқи иммуноассайҳо мебошад, ки соҳае, ки дар тӯли даҳсолаҳо ба камол расидааст. Барои мушаххасии ҳадди аксар, таҳлилҳои сэндвич маъмуланд (расми 3D). Гарчанде ки коркарди онҳо гарон ва заҳматталаб аст, онҳо метавонанд ҳассосияти баланд ва қобилияти баланди интиқолро ба даст оранд. Ҳатто гурӯҳҳое, ки ҳазорҳо иштирокчиён доранд, метавонанд бо ин технология санҷида шаванд, аммо танҳо барои як ё якчанд номзадҳои биомаркер. Чунин рақамҳои калон метавонанд барои муайян кардани мушаххасот на танҳо бар зидди назорат, балки нисбати дигар бемориҳо низ зарур бошанд. Талаботи стандартӣ суғуртаи қудрати мувофиқи оморӣ ва такрорӣ дар аҳолии мустақилро дар бар мегирад. Имрӯз, чунин таҳқиқоти клиникӣ метавонанд кӯшишҳои бисёрсолаи гаронбаҳо бошанд, ки қисман кам будани биомаркерҳои навро шарҳ медиҳанд.

Иммуноассайҳо баъзе маҳдудиятҳои хос доранд, ки асосан ба шинохти антиген-антитело алоқаманданд. Ба инҳо реактивии байнисоҳавӣ, дахолати молекулаҳои замина ба монанди триглицеридҳо ва аксуламали ғайрихаттӣ ("эффекти қалмоқ") дохил мешаванд (Hoofnagle & Wener, 2009 Wild, 2013). Ғайр аз он, на ҳама вариантҳои аз ҷиҳати клиникӣ муҳими сафеда тавассути таҳлилҳои антитело ба осонӣ шинохта мешаванд. Бо назардошти ин маҳдудиятҳо, усулҳои ба MS асосёфта ҳадди аққал дар баъзе озмоишҳои клиникии васеъмиқёс алтернативаҳои ҷолиб хоҳанд буд, аммо ин нисбат ба технологияҳои имрӯза технологияҳои мустаҳкам, ҳассос ва баландтарро талаб мекунад.

Дар тӯли даҳсолаи охир, ҷомеаи протеомика дастурҳоро барои рушди дурусти биомаркерҳо таҳия кардааст, ки стандартҳои сифатро муҳокима мекунанд ва аҳамияти интихоби гурӯҳҳои мувофиқро, ки аҳамияти омории бозёфтҳо, инчунин хусусияти биомаркерҳои эҳтимолӣ ва татбиқи эҳтимолии клиникии онҳоро таъмин мекунанд, таъкид мекунанд (Luque- Гарсия ва Нойберт, 2007 Паулович ва дигарон, 2008 Мисчак ва дигарон, 2010 Суринова ва дигарон, 2011 Конькиҳо ва дигарон, 2013 Паркер & Борчерс, 2014 Hoofnagle ва дигарон, 2016 ).

Тааҷҷубовар нест, ки бо назардошти талаботҳои қатъии стратегияи секунҷа, шумораи ками гузоришҳо вуҷуд доранд, ки дар онҳо он пурра ва бомуваффақият татбиқ карда шудааст. Ин метавонад қисман аз он вобаста бошад, ки се технологияи гуногун - протеомикаи таппонча, протеомикаи мақсаднок ва рушди иммуноассай - ҷалб карда мешаванд. Бисёре аз нашрияҳо танҳо марҳилаи аввалро тавсиф мекунанд ё онро танҳо бо санҷиши иммуноассай дар як гурӯҳ муттаҳид мекунанд (Dataset EV1).

Дар байни тадқиқотҳо, ки беш аз чанд иштирокчӣ ва бо баъзе санҷишҳо, аксарият номзадҳои манфиатдорро интихоб карданд ва таҳлилҳои ғарбӣ, ELISA ё MRM-ро анҷом доданд. Намунаи намояндагӣ тадқиқоти Чжан мебошад ва дигарон (2012), ки дар он плазмаи тамомшудаи 10 беморони саратони колоректалӣ нисбат ба назорат бо iTRAQ нишонгузорӣ шуда, фраксия карда шуда буд, ки боиси муайян кардани сафедаҳои 72 гардид. Дар байни якчанд сафедаҳои боло ё поён танзимшаванда, ORM2 аз ҷониби ELISA дар 419 нафар пайгирӣ карда шуд. Азбаски ин протеин як қисми системаи иммунии модарзод аст (ба монанди ду номзади дигар танзимшаванда), гумон аст, ки он аломати мушаххаси саратон бошад. Дар як таҳқиқоти дигар, супер-делетатсия, тамғагузории iTRAQ ва фраксияҳо 830 протеинро дар як гурӯҳи кашфи 751 беморони гирифтори ҳодисаҳои дилу раг ва назорат, ки ба 50 намунаи ҷамъшуда кам карда шудаанд, муайян карданд (Юхасз). ва дигарон, 2011). Маркерҳои маъруфи CRP ва фибронектин аз рӯйхати номзадҳо интихоб карда шуданд ва муайян карда шуданд, ки дар когорти аслӣ тавассути иммуноассайҳо бар зидди ин сафедаҳо ба таври назаррас танзим карда шудаанд. Дар як тадқиқоти трансплантатсияи дил, таҳлили плазмаи тамомшуда ва бо тамғаи iTRAQ гузошташуда аз 26 бемор дар панҷ нуқтаи пеш аз ҷарроҳӣ ва пас аз ҷарроҳӣ дар маҷмӯъ зиёда аз 900 сафеда муайян карда шудааст (273 барои як Коэн инфиродӣ). ва дигарон, 2013). Таҳлилҳои MRM ва ELISA бар зидди панҷ сафедаи фаровони миёна дар як гурӯҳи пайгирии қисман мустақили 43 нафар барои таҳияи лӯлаи ҳисоббарорӣ барои аломатҳои хатар барои рад кардани узвҳо хидмат карданд. Дар равиши фоиданокии потенсиалии клиникӣ, плазмаи тамомшуда аз модели муши саратони сина имкон дод, ки зиёда аз 1000 сафедаи плазма муайян карда шавад, ки аз онҳо 88-тои онҳо барои таҳлили MRM дар гурӯҳи мустақили санҷиши 80 ҳайвон интихоб карда шуданд (Уайткер) ва дигарон, 2011 ).

Стратегияи росткунҷаи биомаркер ва профили протеоми плазма

Дар чанд соли охир, ҷомеа тамоми ҷанбаҳои ҷараёни кори протеомика дар асоси MS-ро ба таври назаррас такмил дод. Ҳангоми тайёр кардани намуна, ҷараёни кории заҳматталаб ва бисёрмарҳалаи омодагӣ бо коркарди мустаҳкам ва як шиша бо ҳадди ақали қадамҳои коркард иваз карда шуд. Ин инчунин ба автоматизатсия кӯмак мекунад ва қобилияти интиқолро афзоиш медиҳад. Ҳассосият ва суръати пайдарпайии асбобҳои MS якчанд маротиба беҳтар шуд. Тамоми системаи LC-MS/MS хеле мустаҳкамтар шудааст, гарчанде ки ин ҳанӯз аз он чизе, ки барои татбиқи муқаррарии клиникӣ лозим аст, дур аст. Ниҳоят, таҳлили биоинформатикии натиҷаҳо ҳоло аз ҷиҳати оморӣ дуруст ва осон барои истифода аст ва ҳарчи бештар имкон медиҳад, ки натиҷаҳои MS бо доираи васеи дигар маълумоти клиникии классикӣ ва иловагии "омика" алоқаманд бошанд. Қувваи пешрафтаи протеомикаи MS дар асоси MS-ро нишон дода, ҳоло хатҳои ҳуҷайра метавонанд дар як муддати нисбатан кӯтоҳ, баъзан ҳатто бидуни фраксияҳо ба умқи беш аз 10 000 сафедаи гуногун миқдори муайян карда шаванд (Манн). ва дигарон, 2013 Ричардс ва дигарон, 2015 Шарма ва дигарон, 2015 Беккер-Йенсен ва дигарон, 2017 ).

Бо назардошти ин пешрафти технологии протеомика дар намунаҳои хатти ҳуҷайра ва бофтаҳо, мо пурсидем, ки оё метавон як ҷараёни кории зуд ва автоматиро таҳия кард, ки миқдори протеоми плазмаро дар миқдори зиёди намунаҳо амиқ муайян кунад (Гейер). ва дигарон, 2016а). Мо фикр мекардем, ки ин пас як "стратегияи росткунҷа" -ро фароҳам меорад, ки дар он ҳарчи бештар сафедаҳо барои ҳарчи бештари одамон ва шароитҳо чен карда мешаванд. Баръакси ҷараёни кори секунҷа, гурӯҳи кашфи ибтидоӣ хеле калонтар хоҳад буд, ба таври идеалӣ садҳо ё ҳазорҳо иштирокчиёнро дар бар мегирад, ки дар натиҷа эҳтимолияти бештари ошкор кардани ҳама гуна намунаҳое, ки метавонанд гурӯҳҳо ё шароити таҳқиқшавандаро фарқ кунанд. Ин шумораи бештари ибтидоии протеомҳои плазма имкон медиҳад, ки аз ҷиҳати оморӣ муҳим, аммо фарқиятҳо ва тағиротҳои хурд, ки бо як гурӯҳи сафедаҳо алоқаманданд, кашф карда шаванд. Дар стратегияи пешниҳодшудаи росткунҷа, когортҳои кашф ва тасдиқ ҳарду бо протеомикаи тирандозӣ дар амиқ чен карда мешаванд. Ин вобастагии тасдиқро аз кашф бартараф мекунад, яъне маънои ҳарду гурӯҳро якҷоя таҳлил кардан мумкин аст (расми 4А). Ғайр аз он, доштани гурӯҳҳои алоҳида имкон медиҳад, ки нофаҳмиҳои мушаххаси омӯзишро ошкор созанд. Бартарии дигари стратегияи росткунҷа қобилияти он барои кашф ва тасдиқи намунаҳои сафеда мебошад, ки хоси вазъи саломатӣ ё беморӣ мебошанд, ба ғайр аз номзадҳои ягонаи биомаркер, чизе, ки бо равиши секунҷа дастнорас аст.

Расми 4. Раванди кори росткунҷа

Ҷолиб он аст, ки тағироти шабеҳи консепсия аллакай чанд сол пеш барои таҳқиқоти ассотсиатсияи умуми геномӣ (GWAS) рух дода буд. Тадқиқотчиёни ин соҳа муайян карданд, ки таҳлили муштараки ҳарчи бештари намунаҳо аз лӯлаи пайдарпай (Скол) бартарӣ дорад. ва дигарон, 2006). Дар протеомика, мушкилоти ошкоро ноил шудан ба умқи кофии протеомикӣ дар як муддати кӯтоҳ, идеалӣ бидуни тамомшавӣ ва дар ҷараёни кори устувор мебошад. Ин ҳадаф дар замони навиштан ба даст наомадааст, аммо суръати кунунии такмили технологӣ ваъда медиҳад, ки онро дар ояндаи наздик амалӣ хоҳад кард. Дар зер мо чор мисоли ин равиши пайдошударо баррасӣ мекунем.

Аввалин аз онҳо як гурӯҳи 36 ҷуфт дугоникҳои монозиготикӣ ва 22 дизиготикиро барои муайян кардани таъсири заминаи генетикӣ ба сатҳи сафедаҳои плазма таҳқиқ карданд (Лю. ва дигарон, 2015). Муаллифон китобхонаи спектриро бо истифода аз намунаҳои тамомшуда, тақсимшуда ва ҷамъшуда таъсис доданд ва намунаҳои онҳоро бо ба даст овардани мустақили додаҳо (DIA) чен карданд. Ҳамагӣ 232 намунаи плазма бо градиентҳои 35-дақиқа дар реҷаи мустақили маълумот чен карда шуданд, ки ба миқдори пайвастаи 1,904 пептид ва 342 сафеда оварда расонд. Ҷолиб он аст, ки сатҳҳои сафеда аксар вақт дар байни шахсони алоҳида нисбат ба шахсони алоҳида нисбатан устувор буданд. Ғайр аз он, нишондиҳандаҳои возеҳе буданд, ки сатҳи баъзе сафедаҳо таҳти назорати генетикӣ қарор доранд. Масалан, равандҳое, ки бо "вокуниши иммунӣ" ва "коагулятсияи хун" алоқаманд буданд, меросӣ буданд, дар ҳоле ки равандҳое, ки бо "вокуниши гормон" алоқаманд набуданд. Гарчанде ки як тадқиқоти пешрав, шумораи протеомаҳои плазма таҳлилшуда бо назардошти умумии саволи тадқиқотӣ нисбатан кам буд. Умуман, таҳқиқоти генетикӣ мунтазам ҳазорон иштирокчиёнро тафтиш мекунанд, то таъсироти нозуки меросиро ошкор кунанд, ки зарурати интиқоли хеле баландро дар протеомикаи клиникӣ нишон медиҳад.

Малмстрем ва дигарон (2016) тавассути сӯзандору сепсисро дар мушҳо ба вуҷуд овард S. pyogenes ва протеомаҳои плазмаи худро тавассути се нуқтаи вақт дар намунаҳои тамомнашуда ва фраксиянашуда пайравӣ карданд. Китобхонаи бофтаҳои гуногуни муш барои дастгирии мушаххасоти мустақили маълумот ва инчунин барои муайян кардани пайдоиши сафедаҳои зарари бофта истифода шудааст. Бо ин роҳ, даврони 2-соата ба ҳисоби миёна 786 сафедаи мушро муайян кард, гарчанде ки бояд қайд кард, ки меъёрҳои дурусти FDR барои муайян кардани шахсияти пептидҳо дар спектрҳои комплексии DIA MS/MS то ҳол муҳокима карда мешаванд (Несвижский. ва дигарон, 2007 Брюдерер ва дигарон, 2017 Розенбергер ва дигарон, 2017). Якчанд категорияҳои пешбинишудаи сафедаҳои плазма ҳангоми сепсис афзоиш ёфтанд, инчунин баъзе маркерҳои марбут ба осеби системаи рагҳо. Баъзе тағиротҳо бо сафарбар кардани системаи иммунӣ бар зидди патоген алоқаманд буданд ва дигарон бо некроз дар ҳайвонҳои сахт осебдида алоқаманд буданд.

Дар ҷараёни коре, ки "профили протеоми плазма" номида мешавад, мо ба таҳлили зуд ва боэътимоди ҳамагӣ 1 мкл плазмаи тамомнашуда аз як ангуштзанӣ (Гейер) тамаркуз кардем. ва дигарон, 2016а). Вақти умумии градиент ҳамагӣ 20 дақиқа буд, ки имкон медиҳад, ки варианти таҳлилӣ, дохилии таҳлилӣ, дохили инфиродӣ ва байни инфиродии протеомаи плазма гузаронида шавад. Дар асоси миқдори 300 сафедаи плазма, тақрибан 50 биомаркерҳои аз ҷониби FDA тасдиқшуда бо миқдори бидуни тамғакоғаз фаро гирифта шуданд (CV < 20%). Таҳлили фаврии доираи васеи намунаҳо инчунин маҷмӯи гуногуни аломатҳои сифатро ошкор намуд, ки намунаҳоро бо далелҳои лизиси ҳуҷайраҳои сурхи хун, қисман фаъолшавии каскади коагулятсия аз сабаби коркарди номуносиб ва ифлосшавии экзогенӣ ба монанди кератинҳо тасниф кардаанд. Гарчанде ки ин тадқиқот шарҳи муфидро дар бораи мундариҷаи иттилоотии протеоми плазма фароҳам овард, умқи фарогирӣ барои ҳалли сафедаҳои плазмаи сатҳи пасти танзимкунанда ҳанӯз кофӣ набуд. Дар як қадами ягонаи фраксияҳо протеомаи миқдории плазма аз тақрибан 1000 сафеда, аз ҷумла 183 сафеда бо консентратсияи гузоришшуда < 10 нг/мл ба даст омад, аммо бо арзиши вақти зиёдтари андозагирӣ барои як намуна.

Варианти мукаммали ҷараёни кории профили протеоми плазма имкон дод, ки роботи омодасозӣ ва андозагирии тақрибан 1300 намунаи протеоми плазма дар омӯзиши талафоти вазн (Geyer) ва дигарон, 2016б). Таҳлили чоргонаи шахсони алоҳида динамикаи миёнаи 437 протеинро ҳангоми аз даст додани вазн ва дар тӯли як сол нигоҳ доштани вазн муайян кард. Худи талафоти вазн ба протеоми плазмаи инсон бо 93 сафедаи ба таври назаррас тағйирёфта таъсири васеъ дошт. Тафовутҳои миқдорӣ аксар вақт хурд буданд, вале аз ҷиҳати физиологӣ муҳим буданд, ба монанди 16% кам шудани омили аз ҷониби adipocyte ҷудошаванда SERPINF1. Тарҳрезии омӯзиши тӯлонӣ, ки дар он афрод дар тӯли 1 сол ба ҳисоби миёна 12% талафоти вазн доштанд, имкон дод, ки динамикаи дарозмуддати протеомаи плазма сабт карда шавад ва онро ба сафедаҳои устувор дар муқоиса бо байни шахсони алоҳида гурӯҳбандӣ кунад. Намунаҳои бисёр сафеда системаи гомеостазии липидҳоро (оилаи аполипопротеинҳо), илтиҳоби сатҳи паст ва муқовимати инсулинро инъикос мекарданд. Ин намунаҳо бартариҳои талафоти вазнро дар сатҳи фард муайян карданд, ки эҳтимолан барои табобати инфиродӣ ва тавсияҳои тарзи зиндагӣ мекушоянд.

Якҷоя, ин таҳқиқот инчунин бартариҳои тарроҳии омӯзиши дарозмӯҳлатро нишон медиҳанд, зеро протеомаи плазма дар тӯли вақт дар як шахс нисбат ба одамони гуногун бештар доимӣ мешавад. Ғайр аз он, онҳо ба он монанданд, ки онҳо плазмаи камхарҷро камтар истифода мебаранд ва дар вақти таҳлили додашуда сафедаҳои зиёдеро муайян мекунанд (то 20 сафеда/дақ).

Дар робита ба саволи он, ки чӣ қадар сафедаҳо бояд фаро гирифта шаванд, мо дарёфтем, ки умқи протеомии зиёда аз 1500 протеин дар плазмаи камнашуда имкон медиҳад, ки сафедаҳои ихроҷи бофтаҳо, ба монанди ретсепторҳои липопротеинҳои ҷигарро фаро гирад ва дар доираи имкониятҳои технологӣ, ки ҳоло мавҷуд аст, дастрас аст. инкишоф дод. Дар байни 300 сафедаи аз ҳама фаровони аввал, ҳар чорум сафеда биомаркер аст, дар ҳоле ки дар 1200 сафедаи баъдӣ он танҳо ҳар 25-ум сафеда аст (расми 5). Чун нест априори сабаби он, ки биомаркерҳо бояд тақсимоти фаровони каҷ дошта бошанд, ин аз он шаҳодат медиҳад, ки бисёр биомаркерҳо ҳанӯз пайдо мешаванд. Мо боварӣ дорем, ки ваъдаи воқеии профили протеоми плазма бо истифода аз стратегияи росткунҷа дар он аст, ки он метавонад сафедаҳо ва намунаҳои сафедаҳоро кашф кунад, ки то ҳол ҳамчун биомаркерҳо баррасӣ нашудаанд. Афзоиши экспоненсиалӣ дар технологияи асосии LC-MS/MS афзоиши мувофиқи шумораи маҷмӯаҳои маълумотҳои протеомҳои плазма, ки дар лабораторияҳо дар саросари ҷаҳон сабт шудаанд, мусоидат мекунад. Ин як пойгоҳи васеи протеомҳои плазма ва динамикаи онҳоро бо ҷалби бисёр таҳқиқоти клиникӣ ва шахсони алоҳида фароҳам меорад. Пас аз он ин гуна маълумотҳоро метавон ҷамъ кард, то базаи донишро бунёд кунад, ки давлатҳои протеомро ба гуногунии васеи "ташаббусҳо", аз ҷумла бемориҳо, хатарҳо, табобатҳо ва тарзи зиндагӣ мепайвандад. Ҳадди ақал, ин равиш ҳамаи шароитҳои мухталиферо, ки дар он маҷмӯи муайяни биомаркерҳо иштирок мекунанд, ба ғайр аз контексти мушаххасе, ки онҳо кашф шудаанд, ошкор мекунад. Бархӯрди протеомҳо байни шароитҳои беморӣ метавонад муштаракоти байни онҳоро ошкор кунад (расми 4B, панели боло). Пас аз он профили протеоми плазмаи шахс ва динамикаи онро метавон тавассути муқоисаи он бо пойгоҳи дониши ҷаҳонӣ шарҳ дод. Ин метавонад барои бартараф кардани бемориҳои муштарак ва роҳнамоии табобат ва мониторинги самаранокӣ истифода шавад (расми 4B, панели поён).

Тасвири 5. Тақсимоти биомаркер дар доираи фаровонӣ

Стандартизатсияи лӯлаи кашфи биомаркерҳои протеомикӣ

Пешниҳод шудааст, ки мавҷуд набудани биомаркерҳо, ки ба бозор ворид мешаванд, метавонад натиҷаи ҷанбаҳои гуногуни техникӣ, илмӣ ва сиёсӣ бошад, аз ҷумла нобаҳодиҳӣ, дар натиҷаи номувофиқ стандартҳои танзимкунанда ва набудани далелҳо барои эътибори таҳлилӣ ва фоиданокии клиникӣ (Хейс). ва дигарон, 2013). Барои бартараф кардани ин мушкилот, қубурҳои систематикӣ барои рушди биомаркерҳо ҷонибдорӣ карда шуданд (Павлоу ва дигарон, 2013 Даффи ва дигарон, 2015). Дар заминаи гузаштан аз секунҷа ба стратегияи росткунҷаи кашфи биомаркер, баррасии принсипҳои зерин махсусан муҳим хоҳад буд.

(1) Хусусиятҳои иҷрои таҳлилӣ: Эътибори таҳлилӣ қобилияти санҷиш барои таъмини андозагирии дақиқ ва боэътимоди биомаркер мебошад. Муайян намудани дурустии таҳлилии методологияи протеомикаи плазма муҳим хоҳад буд, зеро ҳамон усул аксар вақт аз кашф то истифода бурда мешавад. Стандартҳои муфассал барои муайян кардани эътибори таҳлилӣ аз ҷониби Институти стандартҳои клиникӣ ва лабораторӣ (CLSI) (www.clsi.org) таҳия шудаанд. Шарҳи мухтасарро дар Grant and Hoofnagle (2014) ва Ҷеннингс пайдо кардан мумкин аст. ва дигарон (2009). Баъзе аз ин стандартҳо аз ҷониби Идораи озуқа ва маводи мухаддири ИМА (FDA) эътироф шудаанд ва барои ворид кардан қабул карда мешаванд. in vitro санҷиши ташхисӣ ба бозор (https://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfstandards/search.cfm). Гарчанде ки оғоз бо тасдиқи пурраи таҳлилии мувофиқ ба стандартҳои FDA метавонад дар кашфи биомаркер манъ бошад, ҳадди аққал баъзе аз меъёрҳои асосӣ, ба монанди интиқол, дақиқӣ, дақиқ, ҳассосияти таҳлилӣ, хосияти таҳлилӣ ва маҳдудияти миқдорӣ бояд санҷида шаванд. барвакт. Ин ба он чизе, ки мо дар заминаи стратегияи росткунҷа тарафдорӣ мекунем ва инчунин ба манфиати сарфаи захираҳо аст, зеро қадами пас аз кашфи биомаркер тасдиқи биомаркер мебошад, ки дар он эътибори таҳлилӣ ҳатмӣ хоҳад буд.

(2) Хусусиятҳои амалии клиникӣ: Эътибори клиникӣ ба бемориҳои алоқаманд ва шароити клиникии беморон дахл дорад ва аз эътибори аналитикӣ фарқ мекунад, ки ба андозагирии дурусти таҳлилҳо, ки тавассути таҳлил ҳадаф гирифта шудааст, тамаркуз мекунад. Мувофиқи Созмони Байналмилалии Стандартҳо (ISO) 15189 ва ISO 17025, валидкунӣ "тавассути пешниҳоди далелҳои объективӣ иҷро шудани талабот барои истифода ё истифодаи мушаххаси пешбинишуда" мебошад. Аз ин рӯ, муқаррар кардани иҷрои клиникӣ ҳадафи асосӣ дар марҳилаи тасдиқи биомаркер мебошад. Хусусиятҳои амалии клиникӣ иборатанд аз (i) муайян кардани диапазони муқаррарии истинод тавассути чен кардани гурӯҳи шахсони зоҳиран солим, (ii) муайян кардани ҳассосияти клиникӣ, ки ҳамчун таносуби шахсони гирифтори беморӣ ва санҷидашуда мусбӣ ва (iii) муайян кардани хосияти клиникӣ. , ки ҳамчун таносуби шахсони аз беморӣ озод, ки манфӣ санҷида шудаанд, муайян карда мешавад. Омори ҳосилшуда ба монанди қитъаҳои хусусияти амалиётии қабулкунанда (ROC) махсусан дар арзёбии фаъолияти клиникии биомаркерҳо муфид аст (Zweig & Campbell, 1993 Obuchowski ва дигарон, 2004 ).

(3) Тарҳрезии омӯзиш ва пеш аз таҳлил: Тарҳрезии омӯзиши бодиққат ва шароити хуб назоратшавандаи пеш аз таҳлил талаботи асосӣ дар ҳама вақт ҳангоми омӯзиши биомаркер мебошанд. Дар робита ба тарҳрезии омӯзиш, дақиқ муайян кардани саволи клиникӣ ва эҳтиёҷоти тиббие, ки бояд аз ҷониби биомаркер ҳал карда шавад, ҳатмист. Мушкилоти маъмул дар таҳқиқоти биомаркерӣ дар он аст, ки намунаҳо аз парвандаҳо ва назоратҳо мустақилона ҷамъоварӣ карда шудаанд ва аз рӯи синну сол, этникӣ, ҷинс ва дигар омилҳое, ки метавонанд ба ғарази ғайричашмдошт оварда расонанд ё накунанд, номувофиқанд (Даффи). ва дигарон, 2015). Усулҳои зидди ғаразнок тарҳи дурусти омӯзиш, инчунин фенотипии дақиқ ва амиқ клиникии иштирокчиёнро бо истифода аз таснифоти систематикӣ ба монанди Таснифи байналмилалии омори бемориҳо дар бар мегиранд (http://apps.who.int/classifications/icd10/browse/2016/en) ё онтологияи падидаҳои инсонӣ (Колер ва дигарон, 2017). Бо ин роҳ, агар шахс дорои якчанд бемориҳо бошад, онро дуруст ҳисоб кардан мумкин аст. Ҷамъоварии намунаҳо низ муҳим аст ва муҳим аст, ки ҳамаи намунаҳо (аз ҷумла ҳолатҳо ва назорат) аз гирифтани хун то марҳилаи таҳлилӣ баробар баррасӣ карда шаванд. Қадами дигари муҳим дар бисёр таҳқиқоти биомаркерӣ биобанкинг мебошад. Ҳангоми истифодаи ELISA, мо дарёфтем, ки нигоҳдории биомаркерҳои сафеда дар тӯли 3 моҳ ҳарорати -80 ° C ё камтарро талаб мекунад (Zander ва дигарон, 2014). Устувории намуна барои муддати тӯлонӣ танҳо суст таҳқиқ карда мешавад. Аммо, дар таҷрибаи мо, протеомикаи тирпарронӣ ба тағирёбии таърихи намуна таҳаммулпазирии баланд дорад, зеро эпитопҳои сафедае вуҷуд надоранд, ки онҳоро нигоҳ доштан лозим аст ва ҳатто таназзули қисман сафеда то он даме, ки аксарияти пептидҳои протеолитикии баъдан тавлидшуда бетағйир мемонанд, таҳаммулпазиранд.

Роҳ ба татбиқи клиникӣ

Пешрафти кунунӣ дар протеомикаи плазма барои тадқиқот ва клиника роҳҳои ҷолиби навро мекушояд. Бо назардошти тамоми чораҳои эҳтиётии дар боло зикршуда, то чӣ андоза эҳтимолияти он аст, ки равишҳои зикршуда боиси кашфи биомаркерҳои нав дар асоси сафедаҳо мешаванд? Ва биомаркери протеомикии оянда чӣ гуна хоҳад буд? Мавзӯи асосӣ дар ин замина қудрати табъизи биомаркер барои фарқ кардани мавҷудият ва набудани як ҳолати беморӣ ё хатари мушаххас, ба ибораи дигар, иҷрои клиникии он мебошад. Намунаҳои биомаркерҳои дар айни замон истифодашаванда бо хосиятҳои баланд ва ҳассосияти баланд тропонинҳои дил мебошанд, ки сафедаҳои сохторӣ мебошанд, ки махсусан дар кардиомиоцитҳо ифода шудаанд ва аз ин рӯ барои осеби миокард хеле хос мебошанд. Аз ин сабаб, тропонинҳои дил ҳатто ба таърифи универсалии инфаркти миокард дохил карда шудаанд (Роффи ва дигарон, 2016 ).

Эҳтимол аст, ки равишҳои протеомика дар муайян кардани биомаркерҳои иловагӣ бо нишондиҳандаҳои шабеҳ, ҳадди аққал барои баъзе бемориҳо муваффақ шаванд. Дар асл, мо бояд донем, ки аксари биомаркерҳои имрӯза истифодашаванда ё хеле фаровонанд ё аз контексти маълуми патофизиологӣ сарчашма мегиранд. Ҳамчун як таҷрибаи фикрӣ, мо таносуби шумораи биомаркерҳоро нисбат ба шумораи сафедаҳо дар доираи фаровонии баланд то диапазони ками сафедаҳо экстраполятсия кардем, ки потенсиали якчанд сад биомаркерҳои навро нишон медиҳад, ки метавонанд бо технологияи мувофиқ дастрас бошанд ( Расми 5). Дар муқоиса ба GWAS, ки шумораи зиёди хитҳо ба патофизиологияи қаблан номаълуми бемории таҳқиқшуда алоқаманд буданд (Holdt & Teupser, 2013 Manolio, 2013), эҳтимол дорад, ки маркерҳои нав, ки дар зери радарҳои стратегияҳои қаблӣ бо равишҳои нави систематикии протеомика муайян карда мешаванд. Ин биомаркерҳо инчунин метавонанд иқтидори беҳтар кардани фаҳмиши мо дар бораи патофизиологияи бемориро на танҳо дар ташхис, балки барои табобат низ дошта бошанд. Аммо дар хотир доред, ки биомаркерҳои муайяншуда на ҳамеша дар патофизиологияи беморӣ бевосита иштирок мекунанд, балки танҳо бо он алоқаманданд.

Геномҳои инсон тақрибан 20,000 генҳои сафедаи рамзгузориро рамзгузорӣ мекунанд, ки ба зиёда аз 14,500 бемориҳое, ки бо рамзи ICD тасниф шудаанд, мухолифанд. Ин ҳатто тасаввур карданро аз ҷиҳати консептуалӣ душвор мегардонад, ки як ген ё сафеда бо ҳар як ҳолати беморӣ алоқаманд аст, зеро аксар вақт дар кӯшишҳои мавҷуда барои дарёфти биомаркерҳо пешбинӣ шудааст. Баръакси ин, стратегияи росткунҷаест, ки имкон медиҳад, ки гурӯҳҳои калонро барои маркерҳои сершумор тафтиш кунад, барои кашф ва тасдиқи намунаҳои сафеда, ки хоси вазъи саломатӣ ё беморӣ мебошанд, ваъдаи бузург медиҳад. Воқеан, комбинатсияи бисёрмаркерҳо метавонанд дар муқоиса бо як маркерҳо хусусият ва ҳассосияти баландтар ба даст оранд ва асбобҳои аввалин барои интихоби комбинатсияи дақиқи нишонаҳо аз маълумоти омикӣ таҳия шудаанд (Маззара ва дигарон, 2017). Бо вуҷуди ин, мушкилоти умумӣ бо биомаркерҳои нав дар якҷоягӣ бо нишондодҳои мавҷуда дар он аст, ки онҳо аксар вақт танҳо ба такмилдиҳии ночизи таснифот оварда мерасонанд, алахусус ҳангоми илова кардани онҳо ба нишондодҳои хуб иҷрошаванда (Пенсина) ва дигарон, 2010). Бар хилофи пиндоштҳои маъмул ва интуитивӣ, нишон дода шудааст, ки таносуб (махсусан таносуби манфӣ) байни пешгӯиҳо метавонад барои табъиз муфид бошад (Демлер). ва дигарон, 2013). Тадқиқоти бештар дар ин соҳа ба таври возеҳ кафолат дода мешавад ва технологияҳои нави протеомика маълумоти заруриро барои тасдиқи усулҳои мувофиқи оморӣ таъмин хоҳанд кард.

Ниҳоят, ин нишонаҳо дар шароити клиникӣ чӣ гуна татбиқ мешаванд? Мо ченкунии амиқи тамоми протеомаи плазмаро новобаста аз маврид дастгирӣ мекунем, зеро ин маълумоти мукаммалро медиҳад. Бо гузашти вақт, он ба профили протеоми плазмаи тӯлонӣ илова мекунад, ки онро ҳатто аз субъектҳои солим ба таври муфид ба даст овардан мумкин аст. Тавре ки дар боло зикр гардид, сатҳҳои сафедаи плазма одатан мӯътадил мебошанд, вале хоси шахс буда, имкон медиҳад, ки ба ҷои арзишҳои қатъии популятсия тафсири мушаххаси инфиродӣ дошта бошад. Ғайр аз он, бемориҳои муштарак дар бисёр гурӯҳҳои беморон, на истисно, на қоида. Инҳо тавассути санҷиши ташхиси умумӣ, ба монанди профили протеомии плазма, ба ҷои пай дар пайи санҷишҳои инфиродии ELISA, хеле осонтар ва иқтисодӣ ҳал карда мешаванд. Бо вуҷуди ин, бешубҳа ҳолатҳои зиёде мавҷуданд, ки дар онҳо санҷиши универсалӣ мувофиқ нест, зеро он метавонад нохост шароити дигарро ошкор кунад. Мушкилоти шабеҳ бо дигар технологияҳо ба монанди пайдарпайии геном ё усулҳои тасаввурот ба миён меоянд, ки дар он ҷо одамон намехоҳанд дар бораи майлҳое, ки онҳо дар бораи онҳо каме кор карда метавонанд, омӯзанд. Дар ин ҳолатҳо ва умуман барои пешгирӣ кардани хатари ташхиси зиёдатӣ (Hofmann & Welch, 2017), табибон метавонанд санҷишҳои протеомикаи плазмаи дорои хусусияти бештар равонашударо, ки ба контексти мушаххаси беморӣ нигаронида шудаанд, бартарӣ медиҳанд. Инро метавон тавассути усулҳои дар боло зикршудаи MS, ки ба як панели сафедаҳо нигаронида шудааст, иҷро кард, на тамоми протеом.

Барои санҷишҳои ташхиси пурраи протеома ё санҷишҳои ба панел асосёфта саволе ба миён меояд, ки чӣ гуна духтурон бо маълумоти бисёрченакаи натиҷавӣ кор мекунанд. Тасвири 6А ташхиси биомаркери ягона/олигоро нишон медиҳад, ки ба қабули қарор асосан дар асоси донишҳои клиникӣ ва интуитсия муттаҳид карда шудааст. Биоморкерҳои нав ба таври возеҳ ваъдаи қарорҳои беҳтари клиникиро доранд, аммо инчунин хатари тавлиди намунаҳоеро, ки аз қобилияти маърифатии инсонии тафсир зиёдтаранд, дар назар доранд (расми 6B). Ҳалли ин мушкилот метавонад омезиши алгоритмии биомаркерҳои сершумор ба панели миқдорӣ бошад, ки эҳтимолан бо метамаълумоти клиникӣ якҷоя карда шавад, ки метавонад ба қабули қарорҳои клиникӣ ба таври назаррас кӯмак кунад (расми 6C). Бо дарназардошти рушди босуръати "омӯзиши амиқ" ва "маълумоти калон" хеле ҷолиб хоҳад буд, ки оё ин комбинатсия метавонад иттиҳодияҳои пурқувват ва бесобиқаро таъмин кунад. Мо қайд мекунем, ки имрӯз дар амалияи клиникӣ аллакай холҳои бисёрпараметрӣ мавҷуданд. Масалан, холҳои Child-Pugh ва Score Risk Framingham ҳар як чанд арзишҳои хунро бо маълумоти бемор муттаҳид кардаанд, то дар тӯли даҳсолаҳо мувофиқан ба қарори клиникӣ дар табобати бемориҳои ҷигар ва табобати дилу раг кӯмак расонанд. Ин инчунин роҳеро пешниҳод мекунад, ки чӣ гуна протеомикаи плазма метавонад ба амалияи тиббии ба далел асосёфта қабул карда шавад, як мушкили бузург бо назардошти параметрҳо ва омезиши параметрҳои зиёд, ки ҳама чизро бо озмоишҳои клиникии алоҳида тасдиқ кардан мумкин нест. Алтернативаи прагматикӣ метавонад таҳияи озмоишҳо бошад, ки дар он табибон ба таври тасодуфӣ маълумоти протеомикӣ ва дастгирии қарорҳои марбутаро ба даст меоранд. Пас муайян кардани он, ки оё фоидаи назаррас дар натиҷаҳои бемор вуҷуд дорад, осон хоҳад буд.

Тасвири 6. Татбиқи маълумоти протеомикӣ дар қарорҳои клиникӣ

Хулосахо

Баҳисобгирии таҷрибаи ҷорӣ дар тибби лабораторӣ нишон медиҳад, ки аксарияти қарорҳои табобат дар асоси санҷишҳои хун қабул карда мешаванд ва ченакҳои сафеда ҳатто имрӯз дар байни онҳо барҷастатарин мебошанд. Сарфи назар аз он ки миллионҳо нафар ҳар сол бомуваффақият гузаронида мешаванд, ин таҳлилҳо қариб ҳамеша бар зидди сафедаҳои инфиродӣ нигаронида шудаанд ва суръати ҷорӣ намудани санҷишҳои нави протеин то ба ҳадди аққал суст шудааст.

Протеомикаи ба MS асосёфта ба таври возеҳ потенсиали ченакҳои мултиплексӣ ва хеле мушаххас дорад, ки дар он намунаҳои сафедаҳо на биомаркерҳои ягона метавонанд хониши мувофиқ бошанд. Баррасии адабиёти мо нишон дод, ки кӯшишҳои қаблӣ бо мушкилоти бузурги таҳлилии протеоми плазма, чизе, ки танҳо ҳоло ба пешрафтҳои ҳаяҷонбахши технологӣ ҷой дода шудааст, боздошта шуданд. Мо баҳс мекунем, ки таҳлили шумораи зиёди шароитҳо ва иштирокчиён дар ҳама марҳилаҳои раванди кашф ва тасдиқ дорои потенсиали тавлиди панелҳои биомаркерӣ мебошад, ки эҳтимолан арзиши клиникӣ доранд. Ҳангоми пайвастан ба асосҳои бузурги дониш дар бораи тағирёбии шакли сафеда дар шароити муайян, чунин стратегияи профили протеоми плазма метавонад аслан тамоми мундариҷаи иттилооти ин моеъи баданро истифода барад.

Барои ба воқеият табдил додани ин биниш, такмили минбаъдаи интиқол, амиқи фарогирии протеом, устуворӣ ва дастрасии ҷараёни кори асосӣ муҳиманд. Ғайр аз он, протеомикаи плазма инчунин метавонад ба таҳлили тағиротҳои пас аз тарҷума васеъ карда шавад. Ба ҳамин монанд, метаболомикаи плазма инчунин ҷараёнҳои кории асоси MS-ро истифода мебарад ва метавонад дар оянда мунтазам бо протеомикаи плазма муттаҳид карда шавад. Мо боварӣ дорем, ки пешрафтҳои зарурии технологӣ метавонанд бо мурури замон ба даст оварда шаванд. Ҳадди аққал ҳамон қадар мушкилот консептуалӣ ва "сиёсӣ" хоҳад буд, зеро тӯфони иттилоотии протеомикӣ бояд ба маълумоти амалишаванда барои табибон ва системаи тандурустӣ табдил дода шавад. Ин аз тамоми шарикони ҷалбшуда ӯҳдадории содиқона ва монданашавандаро талаб мекунад. Мо боварӣ дорем, ки ваъдаи ташхиси дақиқтар ва мушаххас ба чунин саъю кӯшишҳо мукофот хоҳад дод.


Натиҷаҳо

Таҳлили афзоиши растаниҳо

Решаҳои сабзӣ дар марҳилаи навниҳоли (20 DAS, S1), марҳилаи шикастан (40 DAS, S2) ва марҳилаи баркамол (90 DAS, S3) ҷамъоварӣ карда шуданд (Расмҳои 1A & # x2013C). Дар 20 DAS, решаи сабзӣ сафед буд ва вазни решаи тару тоза аз вазни навда баръало камтар буд (Расми 1D). Дар марҳилаи шикастан, решаи сабзӣ дар рӯи он ранги норанҷӣ пайдо кард ва вазни навдаи тару тоза ба таври назаррас беҳтар шуд. Дар ин марҳила, на вазни решаи тару тоза ва на диаметр тағироти назаррасро нишон надоданд (Расми 1E). Дар давраи минбаъда реша тез нашъунамо ёфт ва вазни тару тозаи реша аз навда зиёдтар буд (расми 1D). Дар айни замон, диаметри реша ҳангоми афзоиши решаи сабзӣ хеле зиёд шуд (расми 1E).

Расми 1. Хусусиятҳои морфологии сабзӣ дар се марҳилаи инкишоф. (A𠄼) Ҳолати афзоиши сабзӣ ‘Karodagosun’ дар 20 DAS (А), 40 DAS (Б), ва 90 DAS (C). Хатҳои сиёҳ дар кунҷи поёни рости ҳар як тасвир 5 см мебошанд. (D) Вазни тару тозаи решаҳои сабзӣ дар се марҳилаи рушд. (E) Диаметри решаи сабзӣ дар се марҳилаи рушд. Ҳарфҳои хурд фарқияти назаррасро нишон медиҳанд П < 0,05.

Барои таҳқиқи минбаъдаи тағйироти анатомӣ ҳангоми рушди решаи сабзӣ, Сафранин-О/ ранги сабзи зуд барои намоиш додани сохтори бофтаҳои гуногуни растанӣ истифода шуд (расми 2). Дар ҳузури доғдор, деворҳои ҳуҷайраҳои lignified метавонанд сурх шаванд. Тавре ки дар расми 2А нишон дода шудааст, дар марҳилаи ниҳолшинонӣ миқдори зиёди ҳуҷайраҳои сарҳадӣ мавҷуд буданд. Дар ин марҳила, флоэма ва протоксилема хурд буданд ва лигнизатсия аён набуд (расми 2B). Бо зиёд шудани шумора ва андозаи ин ҳуҷайраҳо, решаҳои сабзӣ ғафс шудан гирифтанд. Дар марҳилаи дуюм камбийи рагҳо пайваста тақсим мешавад. Бисёр зарфҳо дар ксилема зич ҷойгир шудаанд ва лигнизатсияи девори ҳуҷайра ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расмҳои 2C, D). Минбаъд, дар марҳилаи охири рушди реша (Расмҳои 2E–G), тақсимоти рагҳо дар ксилема ба таври назаррас тағйир ёфт, ки ба ҷои ҷойгиршавии зич дар кластерҳо паҳн шудан гирифтанд. Дар ҳамин ҳол, дар ин давра миқдори зиёди гранулаҳои крахмал зуд ҷамъ шуданд.

Расми 2. Сохтори анатомии решаҳои сабзӣ аз марҳилаи 1 (А, В), Марҳилаи 2 (C,D) ва Марҳилаи 3 (E&x2013G). BC, ҳуҷайраҳои сарҳадӣ EP, эпидермис PC, ҳуҷайраи паренхималӣ Ph, феллоген РР, флоэми ибтидоӣ Px, протоксилемаи SG, гранулаи крахмал VC, камбийи рагҳои рагҳо Ve, зарф. Андозаи калон аз андозаи аслӣ 200 маротиба аст (A&x2013D) дар ҳоле ки афзоиш 400 маротиба дар (E–G).

Муайянкунӣ ва миқдори сафедаҳо

Технологияи iTRAQ барои таҳлили сафедаҳое, ки аз решаҳои сабзӣ дар марҳилаҳои наздик ба даст омадаанд, истифода мешуд. Умуман, 2845 протеин ошкор карда шуд. Дар давраи афзоиши решаи сабзӣ, ҳамагӣ 226 ва 418 DEP дар марҳилаи шикастан (S2) ва марҳилаи баркамол (S3) муайян карда шуданд (Маводи иловагӣ S2). Ғайр аз он, 118 DEP дар ду марҳила ҳамзамон ҳузур доштанд (Расми 3А).

Расми 3. Тағйироти умумӣ дар сатҳи сафеда дар тамоми рушди решаи сабзӣ. (А) Диаграммаи Венн, ки шумораи сафедаҳоеро, ки дар марҳилаҳои гуногуни рушд маъмулан ва беназир ифода мекунанд, нишон медиҳад. Рақамҳо дар байзавӣ сафедаҳои хоси фазаро ифода мекунанд ва адад дар ду байзавии бурида сафедаҳои такроршавандаро ифода мекунанд. (Б) Миқдори сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда байни ду марҳилаи пайдарпайи рушд. (C) Тағйироти миёна ва макс/дақи протеинҳои ба таври дифференсиалӣ ифодаёфта дар байни ду марҳилаи пайдарпайи рушд.

Дар расми 3B шумораи сафедаҳои боло ва поён танзимшаванда ҳангоми афзоиши решаи сабзӣ нишон дода шудааст. Дар ҳар як марҳила шумораи сафедаҳои боло ва поён танзимшаванда яксон буданд. Аммо, шумораи DEP-ҳо дар марҳилаи баркамол тақрибан ду маротиба аз он дар марҳилаи шикаста буд. Дар ҳамин ҳол, арзиши миёна ва ҳадди ақал/максималии DEP дар расми 3C тасвир шудааст. Дар давраи баркамол амплитудаи тагйирёбии ДЭП нисбатан равшантар буд.

Таснифи протеинҳои махсуси равандҳои мубодилаи моддаҳо

Дар асоси пойгоҳи додаҳои GO, мо шарҳи функсионалии ҳамаи DEP-ро байни ду марҳилаи пайдарпайи рушд гузаронидем. 20 истилоҳи беҳтарини GO аз се категория "раванди биологӣ", "компонентҳои ҳуҷайравӣ", "функсияи молекулавӣ" мувофиқи хусусиятҳои онҳо П-арзишҳо дар расми иловагии S1, маводи иловагӣ S1 нишон дода шудаанд. Аксарияти DEPҳо дар гурӯҳи ‘компонентҳои мобилӣ’ дар ду маҷмӯа (S2/S1, S3/S2) бой карда шуданд. Дар ҳамин ҳол, аксарияти истилоҳҳои GO дар ин гурӯҳ ба ҳам наздик буданд. Ҳамчун мисол, ‘nucleus’ ва ‘nucleolus’ истилоҳҳои GO дар ҳарду S2/S1 (мутаносибан 63 ва 55 DEPs) ва S3/S2 (мутаносибан 91 ва 79 DEPs) муаррифӣ шудаанд. Ҳамин падида дар ‘функсияи молекулавӣ’ рух дод. Барои & # x2018 раванди биологӣ, & # x2019 байни шартҳои GO ду маҷмӯа баъзе фарқиятҳо вуҷуд доранд. Вокуниш ба маҳрумият аз об ва анҷумани нуклеосомаҳо мутаносибан бештари DEP-ро дар S2/S1 (19 DEP) ва S3/S2 (28 DEPs) дар бар мегирад.

Роҳҳои биологӣ инчунин бо истифода аз пойгоҳи додаҳои KEGG таҳлил карда шуданд (Расми 4). Ҳамагӣ дувоздаҳ роҳ дар ду маҷмӯа мувофиқ буданд. Дар байни онҳо, ‘коркарди иттилооти генетикӣ,’‘раванди ҳуҷайра,’‘мубодилаи энергия,’ ва ‘системаҳои организмӣ’ таносуби калонтарини ҳамаи роҳҳо дар S2/4, 22,3, 9,7 ва 7,6%) ва S3/S2 (мутаносибан 31,6, 17,9, 10,4 ва 10,2%). Метаболизми липидҳо, метаболизми терпеноидҳо ва поликетидҳо ва биосинтези гликанҳо ва мубодилаи моддаҳо дар S3/S2 махсус пайдо шудаанд.

Расми 4. Таснифи KEGG аз DEPs аз решаҳои сабзӣ дар марҳилаҳои гуногуни рушд муайян карда шудааст. (А) Таснифи KEGG-и DEP дар байни S1 ва S2 муайян карда шудааст. (Б) Таснифи KEGG-и DEPs дар байни S2 ва S3 муайян карда шудааст.

Профилҳои кластерҳои функсионалии протеинҳо ҳангоми рушди решаи сабзӣ

Протеомаи бофтаи сабзӣ афзоиш ва инкишофи решаи гӯштро муайян мекунад. Сатҳи гуногуни ифодаи сафедаҳои гуногун ҳангоми рушди решаи сабзӣ вазифа ва аҳамияти махсусро дар марҳилаҳои гуногун таъкид мекунад. Тавре ки дар расми 5 нишон дода шудааст, баъзе аз DEPҳо мувофиқи вазифаҳои тахминии биологии онҳо гурӯҳбандӣ карда шудаанд. Ҳангоми рушди решаи сабзӣ, сатҳи ифодаи якчанд патогенҳои марбут (Расми 5B), вобаста ба стресс (Расми 5C), таназзули сафеда (Расми 5К) ва сафедаҳои сигнализатсия (Расми 5L) беҳтар шуданро идома дод. Дар мавриди сафедаҳое, ки дар мубодилаи кислотаи органикӣ иштирок мекунанд (Расми 5D), аксарияти ин DEPҳо дар S2 танзим карда шуданд. Баръакс, сатҳи ифода дар давраи камолот афзоишро нишон дод. Натиҷаҳо инчунин коҳиши ифодаи омилҳои дарозмӯҳлатро нишон доданд (Расми 5G), ферментҳои антиоксидантӣ (Расми 5Н), сафедаҳои фотосинтез ва энергияи алоқаманд (Расми 5N) ва сафедаҳои нақлиётӣ (Расми 5O). Бингар, ки дар маҷмӯъ, сафедаҳои гуногун бо як вазифаи баён тамоюлҳои гуногун.

Расми 5. Таҳлили иерархивии кластеркунии ифодаи сафеда дар марҳилаҳои гуногуни рушд. Харитаҳои гармӣ аз ҳисоби фаровонии нисбии сафедаҳои log2 сохта шудаанд. Рақами дохилшавӣ ва тавсифи сафеда барои ҳар як сафеда намоиш дода шуд. Протеинҳо аз рӯи нақшҳояшон дар роҳҳои мубодилаи моддаҳо гурӯҳбандӣ карда шуданд. (A–O) Функсияҳои гуногуни сафедаҳоро намояндагӣ мекунанд.

Муайян кардани протеинҳои экспансин дар сабзӣ

Дар асоси шарҳи сафеда, ду протеини экспансин аз маълумоти протеомикаи решаҳои сабзӣ дар марҳилаҳои гуногуни рушд ба даст оварда шуданд. Маълумот аз ҷумла pI, протеини Mw ва ғайра дар ҷадвали 1 оварда шудааст. Сатҳи ифодаи ин ду сафедаи экспансин яксон буданд, ки аввал боло рафта, баъд коҳиш ёфтанд.

Ҷадвали 1. Эзоҳ ва ифодаи сафедаҳои муайяншудаи экспансин.

Барои муайян кардани генҳои ин ду сафедаи экспансин, праймерҳои клонкунӣ мувофиқи пайдарпаии сафедаҳо тарҳрезӣ шудаанд. Ду DcEXP генҳо, DcEXP20 ва DcEXP22 тавассути RT-PCR клон карда шуданд ва чаҳорчӯбаи хониши кушодаи онҳо (ORF) 786 bp ва 789 bp буданд, ки мутаносибан 261 ва 262 аминокислотаро рамзгузорӣ мекунанд (Расми иловагӣ S2, Маводи иловагии S1).

Барои таҳқиқи ҳамаҷонибаи аҳамияти экспансинҳо, мо генҳои гуногуни экспансинҳоро дар геноми сабзӣ тафтиш кардем. Тибқи натиҷаи таркиши геноми сабзӣ, ҳамагӣ 30 гени экспансин сабзӣ муайян карда шуд. Ин генҳои экспансин ҳамчун ном гирифтанд DcEXP1-DcEXP30 дар партави номенклатураи қаблӣ (Kende et al., 2004). Генҳое, ки ба ду протеини ба таври дифференсиалӣ ифодаёфтаи экспансин мувофиқанд, ҳамчун шарҳ дода шуданд DcEXP20 (Рақами воридшавӣ: g13058) ва DcEXP22 (Рақами воридшавӣ: g63815), мутаносибан. Барои омӯхтани робитаи эволютсионии экспансинҳои сабзӣ, усули ҳамсоя-пайвастшавӣ (NJ) барои сохтани дарахти филогенетикӣ дар асоси тамоми пайдарпаии Арабидопсис ва сафедаҳои экспансин сабзӣ (Расми 6 ва Расми иловагӣ S3, Маводи иловагӣ S1). Ҳама DcEXPҳо ба чаҳор зерсохторҳо тақсим карда шуданд: EXPA, EXPB, EXLA ва EXLB. Зер оилаи EXPA андозаи калонтаринро дошт, ки аз 24 экспансинҳои сабзӣ иборат буд. Аммо, зероилаҳои EXLA ва EXLB мутаносибан танҳо як аъзо доштанд. Дар ҳамин ҳол, ҳарду сафедаҳои экспансинҳои ба таври дифференсиалӣ ифодаёфта ба оилаи EXPB тааллуқ доранд. Дарозии 30 экспансин дар сабзӣ 206 аминокислотаҳо буд. Натиҷаҳои таҳлили хосиятҳои физикӣ-кимиёвӣ нишон доданд, ки Mw дар ҳудуди 22,4�,2 кДа буд. Онхо pI аз 5,3 то 10,2 (Ҷадвали иловагӣ S2, Маводи иловагӣ S1). Зери оилаи EXLB хориҷ карда шудааст, аксари экспансинҳо доштанд pI арзишҳои болотар аз 7.0.

Расми 6. Дарахти филогенетикӣ ва таркибҳои мотивии генҳои экспансин сабзӣ.

Таҳлили сохтории пайдарпаии кислотаҳои аминокислотаҳо дар сабзӣ

Пайдарпайии кислотаҳои аминокислотаҳои 30 экспансин дар сабзӣ мувофиқ карда шуданд (Расми иловагӣ S4, Маводи иловагии S1). Пайдарпаии аминокислотаҳои сафедаҳо, ки ба як зерфамилия тааллуқ доштанд, шабоҳати бештаре доштанд. Шахсияти ҳамоҳангшуда байни DcEXP20 ва DcEXP22, ки ҳарду ба зероилаҳои EXPB тааллуқ доранд, 74,6% буд. Аксарияти протеинҳои экспансин як пептиди сигналии 16 аминокислотаҳо доштанд. Аммо, чор сафеда, DcEXP26, DcEXP29, DcEXP16 ва DcEXP19 пептиди сигнал надоштанд (Ҷадвали иловагӣ S2, Маводи иловагии S1). Пас аз пептиди сигнал якчанд боқимондаҳои аминокислотаи аминокислотаҳо муайян карда шуданд. Дар зероилаҳои EXPA ва EXPB, ҳама экспансинҳо дорои як мотиви HFD буданд, ба истиснои DcEXP11 ва DcEXP10, ки мутаносибан як мотиви HFV ва QFD доранд. Умуман, ҳашт пасмондаҳои систеини (Cys) ҳифзшуда ҳам дар DcEXPA ва DcEXPB ва ҳам дар байни DcEXLA ва DcEXLB шаш муайян карда шуданд. Дар ҳамин ҳол, мутаносибан 11, 21 ва 14 глицин (Гли) нигоҳ дошта шуданд (Расми иловагӣ S4, Маводи иловагии S1).

Мотивҳо дар сафедаҳо ва пайдарпаии мотивҳои муфассали онҳо ба таври схематикӣ дар расми 6 оварда шудаанд. Даҳ сафеда дар зероилаҳои EXPA ҳамаи даҳ ҷузъи мотивро тақсим мекарданд ва дигарон як ё ду нақш надоштанд. Мотивҳо дар се зерфамилияи дигар аз он дар EXPA ба таври назаррас фарқ мекарданд. Аъзоёни зероила EXPB дорои motif 4 & # x20137, ба истиснои DcEXP19. Аммо, зерсохтори EXLA ва EXLB мутаносибан танҳо як ё ду мотив доранд. Умуман, мотиви 4 дар ҳама экспансинҳо мавҷуд буд.

Муайян кардани генҳои экспансин дар асоси транскриптом ҳангоми афзоиши решаи сабзӣ

Бо ёрии маълумоти транскриптомӣ аз омӯзиши пешакӣ дар лабораторияи мо (Ванг ва дигарон, 2015a), мо сатҳи транскриптҳои генҳои экспансинро ҳангоми афзоиши решаи сабзӣ тафтиш кардем. Дар маҷмӯъ 26 генҳои экспансин тавассути маълумоти транскриптомӣ тафтиш карда шуданд. Мо харитаи гармиро дар асоси арзишҳои як килобаза дар як миллион (RPKM) кашем, то профилҳои ифодаи онҳоро нишон диҳем (Расми 7). Қариб нисфи генҳои экспансин дар марҳилаи дуюм ифодаи баландтарин доштанд. Бо вуҷуди ин, мо мавҷудияти онро наёфтаем DcEXP17 ва DcEXP24 дар S2. Назар ба, DcEXP25 танҳо дар S2 ба ҷои S1 ва S3 вуҷуд дошт.

Расми 7. Профилҳои ифодаи генҳои экспансин сабзӣ.

Таҳлили профили ифодаи генҳои экспансин ҳангоми рушди решаи сабзӣ

Барои таҳқиқи механизми молекулавии танзими рушди решаи сабзӣ, даҳ генҳои гуногуни экспансин, аз ҷумла DcEXP20 ва DcEXP22 барои таҳлили экспресс аз ҳар як зероилаи экспансин ба таври тасодуфӣ интихоб карда шуданд (Расми 8). Сатҳи ифодаи нисбии ҳар як ген дар асоси ифодаи он ҳисоб карда шуд DcEXP24 дар S1, ки сатҳи пасттарини ифодаро нигоҳ медорад. Ба истиснои DcEXP9, ҳама генҳои экспансин сатҳи баландтарини ифодаро дар S2 нишон доданд. Дар байни ин генҳо сатҳи ифодаи DcEXP29 дар S2 назар ба S1 бештар аз 30 маротиба зиёд буд. Дар марҳилаи баркамол профилҳои экспрессии генҳои экспансин умуман коҳиш ёфтанд, баъзеҳо ҳатто аз марҳилаи аввал камтар буданд. Натиҷаҳои муқоисаи генҳои гуногуни экспансин нишон доданд, ки DcEXP20, DcEXP30, DcEXP13, ва DcEXP22 сатҳҳои баландтари ифодаро ифода мекарданд. Дар муқоиса бо натиҷаҳои iTRAQ, ду экспансинҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда, DcEXP20 ва DcEXP22, муносибати пайваста байни тамоюлҳои ифодаи mRNA ва фаровонии сафедаҳоро нишон доданд. Коэффисиенти таносуби байни сатҳи ифодаи DcEXP20, DcEXP22 ва дигар генҳои экспансин тавассути таҳлили Пирсон таҳлил карда шуданд (Ҷадвали 2). Профилҳои ифодаи DcEXP20 ва DcEXP22 бо ҳашт ва шаш генҳои экспансин мутаносибан мусбат доштанд.

Расми 8. Сатҳи ифодаи нисбии 10 генҳои сабзӣ экспансин. Ҳарфҳои хурд фарқияти назаррасро дар П < 0,05.

Ҷадвали 2. Таносуби байни сатҳҳои ифодаи DcEXP20, DcEXP22, ва дигар генҳои экспансин.


Чӣ тавр ман метавонам протеини худро муайян кунам?

Усулҳои дастрас барои LC-MS-и миқдорӣ асосан ба ду категория тақсим мешаванд: (i) миқдорбандии нисбӣ ва (ii) муайян кардани фаровонии пептидҳо тавассути калибркунӣ ба стандарти синтетикии устувори изотопӣ (Расми 1). Дар айни замон, аксарияти ҷомеаи илмӣ муносибати пешинаро ба масъалаҳои тадқиқотӣ татбиқ мекунанд. Аммо, охирин, махсусан дар барномаҳои клиникӣ нақши афзояндаи муҳимро мебозад.

Миқдори нисбии ба кашф асосёфта аз ҷониби LC-MS ба муҳаққиқон имкон дод, ки ҳамзамон тағиротро дар фаровонии сафедаҳо дар якчанд намуна муайян кунанд. Тавре Бернхард Кустер мегӯяд, "LC-MS махсусан қавӣ аст, ки он метавонад миқдори зиёди сафедаҳоро дар баробари ва бидуни донистани он муайян кунад. априори кадом протеинҳоро метавон таҳлил кард ». Барои воқеият дарк кардани вазифаи сафедаи инфиродӣ ва муносибате, ки сафеда бо дигарон дар заминаи як системаи мураккаби биологӣ дорад, тағирот дар фаровонии сафедаҳо нисбат ба системаи ибтидоӣ ё стандартӣ бояд чен карда шавад. Тавре ки аз ном бармеояд, миқдори нисбӣ муқоисаи миқдори сафедаҳо бо ҳолати муқарраршуда, яъне., дар ҳолати B, C, D чӣ миқдор пептид (ва аз рӯи экстраполяция, сафеда) мавҷуд аст ва гайра. дар муқоиса бо миқдори ҳамон пептид дар ҳолати А. Кустер инчунин қайд мекунад, ки "LC-MS инчунин ба он маъно қавӣ аст, ки барои сафедаҳое, ки антитело вуҷуд надоранд ё сифати паст доранд, таҳлилҳои миқдорӣ метавонанд таҳия карда шаванд".

Ба истилоҳи васеътар, асосан ду равиш барои миқдори нисбии сафедаҳо аз ҷониби LC-MS мавҷуданд. Инҳоянд: (i) тамғагузорӣ ва (ii) бидуни тамғакоғаз. Категорияи қаблӣ ба ду воситаи тамғагузории пептидҳо/протеинҳо дар протеом тақсим карда мешавад. Маҳз тавассути тамғагузории метаболикӣ, ки дар аввал дар соли 1999 пешрав шуда буд 3 ва баъдтар аз ҷониби ҷомеаи тадқиқотӣ дар шакли SILAC (сҷадвал iсотоп литоат кардан бо акислотаҳои мино дар вмаданият) 4. Протеинҳоро инчунин тавассути ҳосилсозии химиявӣ тағир додан мумкин аст ва чунин равишҳо фаро гирифта шудаанд iсотоп-вдод аназдикӣ тags (ICAT) 5 , 18 O тамғагузорӣ 6 , тамғагузории диметил 7 , ва барчаспҳои массаи изобарӣ, яъне., тандем мхар тag (TMT) ва iсобари тag барои ролӣ ва акомил quantitation (iTRAQ) 8,9 .

Бо SILAC, намунаҳои биологӣ нишонгузорӣ карда мешаванд in vitro бо версияи изотопи вазнини аминокислотаи мақсаднок. Ҳангоми синтези сафеда, аминокислотаи табиӣ ба версияи вазнинтаре иваз карда мешавад. Ҳуҷайраҳоеро, ки ба шароитҳои гуногуни таҷрибавӣ дучор шудаанд (дар васоити сабук, миёна ё вазнин парвариш карда мешаванд) пас аз омехта кардан мумкин аст ва ҳамаи қадамҳои коркард дар намунаи омехта иҷро карда мешаванд (Расми 1, тамғагузории метаболикӣ). Ин стратегия ҳама гуна тағирёбиро, ки ҳангоми тайёр кардани намуна рух дода метавонад, ба таври назаррас коҳиш медиҳад ва бартарии хоси ченкунии дақиқтарро дорад. Бо масалан., реагентҳои TMT 8, миқдори зиёди протеинҳои мултиплексии баландро ба даст овардан мумкин аст. Ҳангоми якҷоя кардан бо нармафзори LC-MS ва нармафзори протеомикӣ, дар айни замон то 16 намунаи гуногун, ки аз ҳуҷайраҳо, бофтаҳо ё моеъҳои биологӣ гирифта шудаанд, метавонанд ҳамзамон таҳлил карда шаванд, пептидҳо/протеинҳо муайян карда шаванд ва миқдори нисбии пептидҳо/протеинҳо ҳисоб карда шаванд (Расми 1). , тамғагузории кимиёвӣ).

Миқдори бидуни тамғакоғаз аз ҷониби LC-MS дубора эҳёи маъруфияти навро мушоҳида кард. Ин таваҷҷуҳи нав аз ҷониби ҷомеа пеш аз ҳама дар натиҷаи беҳтар шудани ҳалли массаи спектрометрҳои мавҷудаи масса, беҳтар шудани устувории вақти нигоҳдорӣ бо системаҳои нави HPLC ва алгоритмҳои такмилёфтаи таҳлили додаҳо, ки на танҳо аломатҳои сершумори хроматографиро мувофиқат мекунанд, балки инчунин метавонанд хусусиятҳои сершуморро аз пайҳо истихроҷ кунанд. . Дар баробари ин, ба даст овардани мустақили додаҳо (DIA) инчунин ҳамчун як равиши пурқувват барои миқдори амиқ ва бидуни аломати нисбии сафеда дар тамоми протеом пайдо шудааст. Умуман, равиши миқдории бидуни тамғакоғаз як алтернативаи хеле камхарҷ ба ҳам SILAC ва ҳам TMT мебошад ва бартарии асосии муқоисаи тағирот дар фаровонии сафеда дар байни намунаҳои сершумор бидуни истифодаи ягон тамғакоғазҳои изотопиро дорад. Намунаҳо аз ҷониби LC-MS ба таври инфиродӣ таҳлил карда мешаванд, ки ҷанбаи он дар таҳлили когортҳо, ки аз садҳо то ҳазорҳо намунаҳои бемор иборатанд, хеле муфид аст.Бо алгоритмҳои нармафзори мураккаб, ҳоло ҳамгиро кардани сигналҳое, ки ба ионҳои беназири пептидӣ дар тамоми миқёси вақти LC мувофиқат мекунанд, хеле осонтар аст. Пас аз LC-MS ба даст овардани маълумот, таҳлилҳои инфиродӣ метавонанд муқоиса карда шаванд ва хусусиятҳои хроматографии барои ҳама намунаҳо мувофиқат карда шаванд (Расми 1, тамғаи ройгон). Бартариҳои асосии миқдори протеомҳо тавассути LC-MS-и бе тамғагузорӣ қобилияти муқоиса кардани шумораи номаҳдуди намунаҳо ва кӯҳна шудани стратегияҳои гаронбаҳои тамғагузорӣ мебошанд. Аммо камбудии асосӣ дар он аст, ки вақти ба даст овардани LC-MS зиёд мешавад (чун ҳар як намуна пай дар пай иҷро карда мешавад). Бо вуҷуди ин, дар бозор системаҳои нав пайдо мешаванд, ки метавонанд градиентҳои хеле зуд ва кӯтоҳи LC-ро таъмин кунанд, то вақти таҳлили ҳазорон намунаҳои клиникиро кам кунанд.

Консепсияи истифодаи пептидҳои синтезшудаи устувори изотопӣ ҳамчун стандартҳои дохилӣ барои миқдори сафедаҳо аз ҷониби LC-MS бори аввал аз ҷониби Desiderio ва Kai 10 пешравӣ карда шудааст (Расми 1, стандартҳои баланд). Инҳо пептидҳои триптии синтетикӣ мебошанд, ки ҳамон як пайдарпаии аминокислотаҳо бо пептидҳои табиатан пайдошуда доранд. Аммо пептидҳои синтезшуда ҳадди аққал як аминокислотаи устувори изотопӣ доранд, ки ба афзоиши каме (6-10 Да) массаи молекулавӣ оварда мерасонанд. Миқдори "маълум" -и эквиваленти пептидҳои синтетикӣ ба ҳазми протеомикӣ ворид карда мешавад ва тамоми намуна аз ҷониби LC-MS таҳлил карда мешавад. Пептиди ватанӣ ва стандарти пептидҳои хӯшадор дар масс-спектрометр хроматографӣ якҷоя ва ионизатсия мешаванд. Дар м/з аз ду пептид, аммо ба осонӣ фарқ кардан мумкин аст. Аз хроматограммаҳои ионҳои истихроҷшуда ва ҳисобкунии майдони зери каҷ барои ҳарду пептидҳо, тахминии миқдори пептидҳои ватаниро тавассути муқоисаи таносуби қуллаҳо ҳисоб кардан мумкин аст. Тавсияи аз ҷониби умум қабулшуда синтез кардани ҳадди аққал се пептидҳои триптӣ дар як сафеда мебошад. Агар барои як таҷриба миқдори якчанд сафеда талаб карда шавад, нарх ба зудӣ боло меравад. Илова бар ин, гарчанде ки пошидани стандартҳои пептидҳо як равиши оддӣ аст, калибркунии фаровонии пептидҳо барои инъикоси сатҳи сафедаҳо мушкил боқӣ мемонад 11. Усулҳои алтернативии калибрченкунӣ барои рафъи ин мушкилот пешниҳод шудаанд ва иборатанд аз: масалан., истифодаи як ҳавзи истинод як нуқтаи умумӣ 12,13.


3. ГУМШУДАНИ ТАСОДУФАН

Луо ва дигарон. [17] маҳдудиятҳои моделҳои ANOVA тавассути чаҳорчӯбаи Bayesian, ки гум шудани ғайритасодуфӣ дар маҷмӯи додаҳои iTRAQ-ро дар бар мегирад, бартараф мекунад. Модели онҳо тахмин мекунад, ки шиддатнокии пептидҳои ченшуда ҳам аз сатҳи ифодаи сафедаҳо ва ҳам таъсири мушаххаси пептидҳо таъсир мерасонанд. Қиматҳои ин ду таъсир дар таҷрибаҳои сершумор ҳамчун эффектҳои тасодуфӣ модел карда мешаванд. Вақте ки намуна дар як таҷриба бо барчаспҳои сершумор нишон дода мешавад, тағирот дар барчаспҳои гуногуни изобарӣ низ ҳамчун эффектҳои тасодуфӣ модел карда мешаванд. Норасоии тасодуфии маълумоти пептидӣ бо регрессияи логистикӣ модел карда мешавад, ки эҳтимолияти гум шудани пептидро бо сатҳи ифодаи сафеда, ки ин пептидро тавлид мекунад, алоқаманд мекунад. Усули занҷири Марков Монте Карло, ки барои ин модел таҳия шудааст, барои хулосабарории сатҳҳои ифодаи нисбӣ дар намунаҳои гуногун таҳия шудааст.

3.1 Модели

Мо ба тавсифи модели маълумоти iTRAQ аз таҷрибаҳои сершумор ва баҳодиҳии сатҳи ифодаи нисбии сафедаҳо тамаркуз мекунем. Вақте ки маълумоти iTRAQ аз таҷрибаҳои сершумор ба даст оварда мешавад, [17] модели иерархияи Байесиро ба маънои он истифода мебарад, ки модел як ҷузъи мушоҳида дорад, ки шиддатнокии пептидҳои мушоҳидашударо ҳамчун эффектҳои тасодуфӣ модел мекунад, ки тақсимоти шартии онҳо аз сатҳи пешбинишудаи ифодаи сафедаҳо ва таъсири пептидҳо вобаста аст. , ва ҷузъи дуюм (иерархӣ), ки тақсимоти ин арзишҳои интизориро муайян мекунад.

Дар Луо ва дигарон. [17], тахмин карда мешавад, ки эффектҳои тамғагузорӣ бо усулҳои нормализатсия, ба монанди нормализатсияи квантӣ бартараф карда мешаванд. Тасаввур кунед, ки вуҷуд доранд С (& # x022652) намунаҳои биологӣ омӯхта дар К (& # x022652) таҷрибаҳо. Азбаски тегҳои изобарӣ метавонанд як намунаро дар як таҷриба нишон диҳанд, бигзор Лс ≥ 1 шумораи барчаспҳои тамғагузориро нишон медиҳад с- намуна. Сипас & # x02211с Лс = М шумораи барчаспҳои изобарӣ дар як таҷриба истифода мешавад, ки ҳангоми истифодаи реагентҳои изобарии 4-плексӣ 4 ва дар версияи 8-плексӣ 8 аст. Тасаввур кунед, ки вуҷуд доранд И сафедањо дар намуна ва Ҷi пептидҳо барои iпротеин th. Барои лтамғаи уми снамунаи ум дар козмоиш, бигзор йкижслн арзиши табдилшудаи журнали шиддатнокии мушоҳидашудаи ченшударо барои jпептиди уми iсафедаи ум аз нспектри ум. Дар назар гиред, ки j бояд ба таври бояду шояд ифода карда шавад j(i) барои ба таври возеҳ нишон додани он, ки пептидҳо дар дохили сафедаҳо ҷойгиранд ва л бояд ҳамчун ифода карда шавад л(с) нишон додани луми нишонгузорӣ аз снамунаи уми. Барои содда кардани аломатҳо мо қавсҳоро тарк мекунем. Шиддати ченкунии пептид аз сатҳи ифодаи сафеда ва таъсири пептид вобаста аст. Бигзор хкисл сатҳи ифодаи тағирёфтаи сабтро нишон диҳед iсафедаи уми снамунаи уми бо лтеги тамғагузорӣ дар куми озмоиш. Бигзор зкиж Таъсири пептидҳои тағирёфтаро барои jпептиди уми iсафеда дар ктаҷриба. Луо ва дигарон. [17] модели иловагии барои йкижслн (к = 1, …, К i = 1, …, И j = 1, …, Ҷi с = 1, …, С л = 1, …, Лс н = 1, …, Нкижсл):

ки дар миқёси аслӣ ба модели мултипликативӣ мувофиқат мекунад. Дар (3), εкижслн тахмин карда мешавад, ки мустақилона маъмулан бо миёнаи 0 ва дисперсия σ ε 2: ε k i js l n тақсим карда мешавад.

3.1.1 Механизми гумшудаи маълумот

Модели оморӣ барои набудани пептидҳо дар [17] аз ҷониби таҳқиқот дар маҷмӯи маълумоте, ки аз омӯзиши нақшҳои Caveolae барои функсияи баъдинаталии дилу рагҳо гирифта шудааст, асос ёфтааст. Дар ин тадқиқот, се таҷриба гузаронида шуд, ки дар он профилҳои сафедаи ду муши навъи ваҳшӣ ва ду муши нокаут Cav-1 аз ҷониби iTRAQ бо чор тегҳои изобарӣ дар ҳар як озмоиш таҳлил карда шуданд. Луо ва дигарон. [17] таносуби пептидҳои дар як таҷриба мушоҳидашуда, вале дар озмоиши дигар нопадидшударо омӯхта, муайян кард, ки байни эҳтимолияти гумшуда ва шиддатнокии пептид таносуби манфӣ вуҷуд дорад. Ба ибораи дигар, пептидҳои камтар фаровон эҳтимоли гум шудан доранд, зеро ошкор кардани онҳо аз сабаби ба даст овардани раванди таҳлил аз маълумот мушкилтар аст. Бо мушоҳидаи он, ки байни эҳтимолияти гумшудаи пептид ва шиддатнокии мушоҳидашуда дар миқёси логит муносибати тахминии хатӣ вуҷуд дорад, Луо ва дигарон. [17] эҳтимолияти гумшударо тавассути модели оддии регрессияи логистикӣ модел кардааст:

дар куҷо Икижслн = 1 нишон медиҳад, ки jпептиди уми iсафеда дар чен карда мешавад ктаҷриба, лнусхаи уми снамуна ва нспектри ум. Формула (4) маънои онро дорад, ки мантиқи эҳтимолияти гум шудани пептид аз шиддатнокии он хаттӣ вобаста аст. Интизор меравад, ки б > 0, зеро пептидҳои дорои шиддатнокии пасттар эҳтимоли зиёд нестанд.

3.1.2 Пештар

Чаҳорчӯби иерархияи Байесӣ дар [17] тағирёбандаҳоро дар байни таҷрибаҳо ва намунаҳо ба назар мегирад ва тахмин мекунад, ки хкисл ва зкиж мустақилона одатан дар таҷрибаҳои гуногун тақсим карда мешаванд, яъне:

дар куҷо хисл ва зij таъсироти сафеда ва пептидро мутаносибан дар таҷрибаҳои сершумор ба ҳисоби миёна нишон медиҳанд. Сатҳи ифодаи сафеда дар репликаҳои гуногун (бо барчаспҳои гуногун нишонгузорӣ шудааст) аз як намуна низ маъмулан тақсим карда мешавад:

дар куҷо хаст сатҳи ифодаи онро ифода мекунад iсафеда дар снамунаи уми. Фарзҳо (5) & # x02013 (7) ба шакли муодили (3) оварда мерасонанд:

N (0, σ x 2) ва e k i j z

N ( 0 , σ z 2 ) таъсири тасодуфиро дар таҷрибаҳо нишон медиҳад ва e i s l t

N (0, σ δ 2) тағиротро дар байни такрорҳои сершумори як намуна ифода мекунад. Вақте ки намуна дар таҷриба бо теги изобарии беназир нишон дода мешавад, дар дохили намуна ҷузъи варианти такрорӣ вуҷуд надорад. Формула (8) модели таъсири омехта мебошад. Барои таъмини муайянкунии модел, маҳдудият хi1 = 0 илова карда мешавад. Баъд хаст сатҳи ифодаи онро ифода мекунад iсафеда дар снамунаи ум нисбат ба намунаи аввал.

Сатҳи дуюми афзалиятҳо тақсимоти муқаррарӣ барои хаст ва зij:

Модели иерархӣ бо назардошти тақсимоти баръакси гамма ҳамчун пешакӣ барои гиперпараметрҳои дисперсия анҷом дода мешавад: σ x − 2

Гамма (γ 7, γ 8), ки дар он γ1 ва & # x003b32 шакл ва миқёси параметрҳои тақсимоти гаммаро мутаносибан нишон диҳед ва фарз кунед а

Н(0, ν 2). Тақсимоти паси параметрҳои мувофиқ тавассути моделиронии MCMC тақлид карда мешаванд ва сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда тавассути таҳлили тақсимоти паси хаст.

3.2 Муқоиса бо таҳлили ANOVA

Муҳимтарин фарқият байни ин модели Байесӣ дар [17] ва модели ANOVA, ки аз ҷониби Ҳилл ва дигарон пешниҳод шудааст. [7] ва Оберг ва дигарон. [19] он аст, ки [17] бедаракии беэътиборро дар маълумоти iTRAQ ба таври возеҳ модел кардааст. Оберг ва дигарон. [19] дар охири мақолаи худ қайд карданд, ки истифодаи механизми сензура барои мувофиқ кардани модел як қадами табиии оянда хоҳад буд. Ба ҷои сензура кардани маълумот бо арзиши ҳадди номаълум, [17] эҳтимолияти бештари набудани пептидҳоро барои шиддатнокии пасти пептидҳо моделсозӣ кард. Ин ду усул инчунин аз рӯи вариантҳои ба модел дохилшуда фарқ мекунанд. Таъсири таҷрибавӣ ва эффекти репликативӣ (вақте ки тегҳои сершумор намунаро нишон медиҳанд) барои ҳама сафедаҳо дар модели ANOVA доимӣ ҳисобида мешаванд. Баръакси ин, [17] онҳоро ҳамчун эффектҳои тасодуфӣ, ки хоси пептидҳо ва (ё) сафедаҳо буданд, модел кардааст. Ғайр аз он, таҳлили ANOVA эффектҳои иловагиро дар бар мегирад, ба монанди эффекти тамғагузорӣ ва таъсири мутақобилаи байни тамғагузорӣ ва таъсири таҷрибавӣ гj(i),с, ки дар [17] модел карда нашудаанд. Дохил кардани таъсири тамғагузорӣ бо тарҳи таҷриба муайян карда мешавад. Вақте ки барчаспҳои якхела барои тамғагузории як намунаҳо дар таҷрибаҳои сершумор истифода мешаванд, таъсири тамғагузорӣ муайян карда намешавад, зеро он бо эффекти интихоб омехта мешавад. Дохил кардани эффекти тамғагузорӣ танҳо он вақт муҳим аст, ки тегҳои гуногун барои тамғагузории як намунаҳо дар таҷрибаҳои сершумор истифода мешаванд. Барои ҳамкории байни тамғагузорӣ ва таъсири таҷрибавӣ гj(i),с, гарчанде ки дар модел мавҷудияти он аз ҷиҳати назариявӣ мувофиқ аст, дар арзёбии он номуайянии калон вуҷуд дорад. гj(i),с аз сабаби шумораи ками такрорҳо (ё ҳеҷ такрорӣ) барои ҳар як намуна.

Фарзияи умумӣ ҳам дар усули Bayesian ва ҳам таҳлили ANOVA ин аст, ки ҳама мушоҳидаҳои пептидӣ сафедаҳои солимро дақиқ инъикос мекунанд. Мо имкони пайдоиши генҳои гомологиро, ки боиси ду ё зиёда сафедаҳое мешаванд, ки пептидҳои якхела ва ғайришахсиро мубодила мекунанд ва инчунин имкони тағироти пас аз транскрипсияро нодида мегирем. Гарчанде ки (1) таъсири байни таъсири пептидҳо ва табобатро дар бар мегирад (гj(i),с), дар таҳлили [19] хориҷ карда шудааст. Ин истилоҳ дар [17] низ дохил карда нашудааст. Ҳамин тавр, ҳарду [17] ва [19] тахмин мекунанд, ки сафедаҳои муайян дар байни намунаҳо дар зери табобатҳои гуногун ифодаҳои дифференсиалӣ доранд, аммо ҳама гуна тағирот дар ифодаи сафеда ба ҳамаи пептидҳои ин сафеда баробар таъсир мерасонад.

3.3 Норасоии ғайритасодуфӣ дар маълумоти масс-спектрометрия

Ҳадаф барои маълумоти масс-спектрометрӣ, модели (пешниҳодкардаи Ванг ва дигарон [31]), ки дар ин зерфасл тавсиф шудааст, барои маълумоти iTRAQ мутобиқ карда нашудааст. Аммо азбаски маълумоти iTRAQ тавассути иҷро кардани пептидҳои ҷудошуда тавассути MS/MS ба даст оварда мешавад, ин модели эҳтимолият роҳи алтернативии омӯзиши гумшавиро дар iTRAQ пешниҳод мекунад. Ван ва дигарон. [31] пешниҳод кард, ки аввал манбаъҳои тағирёбии систематикӣ байни профилҳои MS тавассути нормализатсияи глобалӣ бартараф карда шаванд ва сипас нопадидшавии аз шиддат вобаста ва ба ҳисоб гирифтани шиддатнокии пептидҳои аз даст додашуда.

3.3.1 Ба эътидол овардани глобалӣ

Дар нормализатсияи глобалии худ, [31] фарз кард, ки шиддатнокии намуна ҳама бо як омили доимӣ, ки бояд интихоб карда шавад, алоқаманд аст. Барои пешгирӣ кардани ғарази эҳтимолӣ аз сабаби гум шудани ғайритасодуфӣ дар маълумоти масса, Ванг ва дигарон. ба истифода додани боло таклиф кард Л омори фармоишӣ (масалан, медианҳо) шиддатнокии пептидҳо дар ҳар як намуна барои тағир додани миқёс, ки дар он ҷо Л параметрест, ки аз ҷониби корбар муайян карда шудааст. Бигзор К (К > 2) шумораи профилҳои MS бошад. Шиддати мушохидашудаи онро ифода кунед к-профил ҳамчун Y ( k ) = ( y 1 ( k ), y 2 ( k ), … , y n k ( k ) ), ки дар он нк шумораи пептидҳоест, ки дар к- профили. Барои рақами додашуда Л ( L < min ( < n k >k = 1 K ) ), миёнаравии аҳолӣ ҳамчун муайян карда мешавад

ва коэффициенти миқёс барои ба эътидол овардани к- профили

3.3.2 Набудани ғайритасодуфӣ ва баҳогузорӣ

Барои ҳисоб кардани гумшавии тасодуфӣ, Ванг ва дигарон. [31] пешниҳод кардааст, ки шиддатнокии пептидҳои аз даст додашуда дар як намуна бо таносуби шиддати мушоҳидашуда дар намунаи дигар ба коэффисиенти шкала тақсим карда шавад, ки аз шиддатнокии пептидҳои дигар дар ҳарду намуна мушоҳида шудааст. Фарз мекунем, ки сатҳи ҳадди ақали муайяншавандаи асбоб аст г. Бигзор x j ( k ) фаровонии аслии он бошад j- пептид дар к-намуди профили мувофиқи арзиши мушоҳидашуда y j ( k ). Пептид метавонад дар профил вуҷуд дошта бошад ё набошад. Бигзор z j ( k ) як тағирёбандаи ниҳонӣ бошад, ки мавҷудияти j- пептид дар к-профили -ум, бо z j ( k ) = 1 агар j- пептид дар он мавҷуд аст кпрофили -ум, ва z j ( k ) = 0 тартиби дигаре. Пас x j ( k ) = 0 агар z j ( k ) = 0 бошад. Бигзор f j ( k ) функсияи зичии x i ( k ) бошад, вақте ки z i ( k ) = 1 аст, мо дорем

I 0 ( · ) P ( z j ( k ) = 0 ) + f j ( k ) ( · ) P ( z j ( k ) = 1 ),

дар куҷо И0(& # x000b7) нишон медиҳад, ки нуқтаи-массаи дар сифр. Бо (12), Ванг ва дигарон. [31] фарз кард, ки фаровонии воқеии пептид тақсимоти омехта дорад. Бо эҳтимолияти P (z j (k) = 0), пептид дар кпрофили -ум, ва фаровонӣ сифр аст. Бо эҳтимолияти P (z j (k) = 1), пептид вуҷуд дорад ва тақсимоти фаровонӣ бо f j (k) тавсиф карда мешавад.

Қимати аз даст рафтаи сатҳи шиддатнокии j- пептид, ки дар он мавҷуд аст к- профили -ум бо арзиши интизории E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) ҳисоб карда мешавад, ки ҳамчун ҳисоб карда мешавад

ки дар он баробарии якум аз сабаби он аст, ки E ( x j ( k ) | y j ( k ) = 0 , z j ( k ) = 0 ) = 0 ва баробарии дуюм аз сабаби он аст, ки вақте ки j- пептид дар он мавҷуд аст к-намуди профили (z j (k) = 1), нест ошкор сигнал (y j (k) = 0) ба шиддати паст баробар аст (x j (к) & # x0003c d). Истилоҳи E ( x j ( k ) | x j ( k ) < d , z j ( k ) = 1 ) дар (13) мумкин аст, вақте ки f j ( k ) ва г муайян шудаанд ва P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ), эҳтимолияти j- пептид дар он мавҷуд аст к-намуди профили вақте ки ягон сигнал ошкор нест, мумкин аст ҳамчун ҳисоб

ки дар он баробарии сеюм амал мекунад, зеро P d ( yj ( k ) = 0 | zj ( k ) = 1 ) = P d ( xj ( k ) < d | zj ( k ) = 1 ) ва P d ( yj ( k ) ) = 0 | zj ( k ) = 0 ) = 1 . Истилоҳи P d ( x j ( k ) < d | z j ( k ) = 1 ) дар (14) метавонад аз функсияи зичии f j ( k ) ҳангоми муайян шудани охирин ба даст оварда шавад ва

Пас, вакте ки зичии шартй f j ( к ) ва г муайян карда шудаанд, шиддатнокии пептидҳои беҷавобро метавон бо (13) & # x02013 (15) ҳисоб кард.

Параметри ҳадди ақали сатҳи муайяншавандаи асбоб г аз рӯи сатҳи садои заминавӣ дар ҳама профилҳои хоми MS аз як асбоб ҳисоб карда мешавад, ки ҳамчун d ̂ . Он гоҳ сатҳи муайяншавандаи к- профили d ̃ (к) = d ̂ /λ (к), дар куҷо λ (к) коэффисиенти миқёси нормализатсия дар (11) мебошад. Ван ва дигарон. [31] тахмин кунед

мустақилона барои к = 1, 2, …, К. Ин ба фарзияи он баробар аст, ки функсияи зичии x j ( k ) ҳангоми z j ( k ) = 1 , f j ( k ) аст. Н(λ (к) μj, (λ (к) σj) 2). Дар ҳолати махсус, ки & # x003c3j ≪ | d ̃ (к) & # x02212 & # x003bcj| ва репликатсияҳои биологӣ мавҷуданд, Ванг ва дигарон. [31] ҳисобкунакҳои эҳтимолии гумшудаи P d ( z j ( k ) = 1 | y j ( k ) = 0 ) ва арзиши ҳисобшудаи E ( X j ( k ) | y j ( k ) = 0 ) ба таври зерин пешниҳод кардааст:

Маълумоти ҳисобшуда барои таҳлили минбаъда, ба монанди ҳисобкунӣ, кластер кардани сафедаҳо ва муайянкунии дифференсиалии сафедаҳо истифода мешавад.

Модели пешниҳодкардаи Ванг ва дигарон. [31] аз модели Bayesian, ки Луо ва дигарон пешниҳод кардааст, фарқ мекунад. [17] бо се роҳи зерин. Аввалан, дар [31], шиддатнокии пасттар аз сатҳи муайян сензура карда мешавад ва параметри сензура дар асоси сатҳҳои садои пасзамина дар [17] ҳисоб карда мешавад, модели регрессионии логистикӣ барои алоқаманд кардани эҳтимолияти гумшуда бо шиддатнокии воқеии эҳтимолӣ сохта шудааст. Бо мушоҳидаи он, ки пептидҳои кам фаровон эҳтимоли гум шудан доранд, механизми гумшудаи модел дар [17], ки эҳтимолияти гум шуданро бо шиддатнокии пептидҳо мепайвандад, нисбат ба механизми сензура дар [31] оқилонатар аст. Дуюм, [31] ҳисобкунии арзиши ягонаро анҷом медиҳад ва шиддатҳои аз даст додашударо бо арзишҳои пешбинишуда ҳисоб мекунад, дар ҳоле ки [17] ҳисобкунии сершуморро анҷом медиҳад ва тақсимоти паси арзишҳои аз даст рафтаро тақлид мекунад. Сеюм, [31] барои таҳлили iTRAQ мутобиқ карда нашудааст ва ҳангоми татбиқи идея дар [31] ба маълумоти iTRAQ, манбаъҳои тағирот бояд хориҷ карда шаванд. Қувваи [31] дар бори камтари ҳисобкунӣ вобаста аст. Вақте ки зичии f j ( k ) муайян карда мешавад, шиддатнокии пептидҳои аз даст рафтаро бо арзиши интизоршуда аз формулаи (13) ба осонӣ ҳисоб кардан мумкин аст.


2. Протеомика

Пеш аз ҷамъбасти стратегияҳои гуногуни протеомикӣ (Расми 1), чанд нуктаро бояд таъкид кард 4:

Ҳеҷ як технологияи протеомикӣ ҳоло тамоми мураккабии протеоми ширхӯронро ҳал карда наметавонад.

Бо ҳама гуна техникаи протеомикӣ, нисбат ба сафедаҳои фаровон майл вуҷуд дорад.

Дар маҷмӯъ, байни чанд сафеда муайян кардан мумкин аст ва то чӣ андоза дуруст муайян кардани онҳо муомила вуҷуд дорад.

Ногузир, иттилоот тавассути паҳн кардани иттилооти пептидҳои миқдорӣ ба тағирёбии сафедаҳо гум мешавад.

Муқоисаи усулҳои протеомика

Ихтисорот. Номи пурра ва шарҳ. Афзалиятҳо. Камбудиҳо.
ДИГЕ Фарқи электрофорези гел Миқдор дар сатҳи сафеда Ҳассосияти паст
Визуалии тағиротҳои посттранслятсионӣ ва изоформҳои сафеда Танҳо сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодаёфта аз ҷониби MS/MS муайян карда мешаванд
Дурустии хуби миқдорӣ Протеинҳои дорои pI ё Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
Gel-LC-MS/MS Ҷудокунӣ бо SDS–PAGE пеш аз таҳлили LC-MS/MS Осонии истифода Prefractionation талаботи вақтро барои таҳлили MS/MS зиёд мекунад
Пеш аз таҳлили LC-MS/MS ҳассосиятро зиёд мекунад Дақиқии ками миқдорӣ дар омехтаҳои мураккаб бидуни тамғагузории пептид
"Нардбон" ҳамчун нишонаи таназзули протеолитикӣ Протеинҳои дорои Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
СИЛАК Нишондиҳии изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра Варианти ҳадди ақали таҷрибавӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Дақиқии бузурги миқдорӣ Барои ҳуҷайраҳое, ки дар фарҳанг паҳн намешаванд, яъне кардиомиоцитҳо мувофиқ нестанд
Осонии истифода барои ҳуҷайраҳои фарҳанг, ки иловаҳои хунобаи филтршударо афзоиш медиҳанд ва таҳаммул мекунанд Тамғагузории метаболикии ҳайвонот қимат аст
iTRAQ, барчаспҳои TMT Тамғагузории изотопии пептидҳо Дурустии хуби миқдорӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Онро бо бофтаҳо ва инчунин фарҳангҳои ҳуҷайра истифода бурдан мумкин аст Спектрҳои омехтаи MS/MS дорои ионҳои репортер аз пептидҳои гуногун мебошанд
Ихтисорот. Номи пурра ва шарҳ. Афзалиятҳо. Камбудиҳо.
ДИGE Фарқи электрофорези гел Миқдор дар сатҳи сафеда Ҳассосияти паст
Визуалии тағиротҳои посттранслятсионӣ ва изоформҳои сафеда Танҳо сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодаёфта аз ҷониби MS/MS муайян карда мешаванд
Дурустии хуби миқдорӣ Протеинҳои дорои pI ё Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
Gel-LC-MS/MS Ҷудокунӣ бо SDS–PAGE пеш аз таҳлили LC-MS/MS Осонии истифода Prefractionation талаботи вақтро барои таҳлили MS/MS зиёд мекунад
Пеш аз таҳлили LC-MS/MS ҳассосиятро зиёд мекунад Дақиқии ками миқдорӣ дар омехтаҳои мураккаб бидуни тамғагузории пептид
"Нардбон" ҳамчун нишонаи таназзули протеолитикӣ Протеинҳои дорои Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
СИЛАК Нишондиҳии изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра Варианти ҳадди ақали таҷрибавӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Дақиқии бузурги миқдорӣ Барои ҳуҷайраҳое, ки дар фарҳанг паҳн намешаванд, яъне кардиомиоцитҳо мувофиқ нестанд
Осонии истифода барои ҳуҷайраҳои фарҳанг, ки иловаҳои хунобаи филтршударо афзоиш медиҳанд ва таҳаммул мекунанд Тамғагузории метаболикии ҳайвонот қимат аст
iTRAQ, барчаспҳои TMT Тамғагузории изотопии пептидҳо Дурустии хуби миқдорӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Онро бо бофтаҳо ва инчунин фарҳангҳои ҳуҷайра истифода бурдан мумкин аст Спектрҳои омехтаи MS/MS дорои ионҳои репортер аз пептидҳои гуногун мебошанд

Муқоисаи усулҳои протеомика

Ихтисорот. Номи пурра ва шарҳ. Афзалиятҳо. Камбудиҳо.
ДИГЕ Фарқи электрофорези гел Миқдор дар сатҳи сафеда Ҳассосияти паст
Визуалии тағиротҳои посттранслятсионӣ ва изоформҳои сафеда Танҳо сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда аз ҷониби MS/MS муайян карда мешаванд
Дурустии хуби миқдорӣ Протеинҳои дорои pI ё Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
Gel-LC-MS/MS Ҷудокунӣ бо SDS–PAGE пеш аз таҳлили LC-MS/MS Осонии истифода Prefractionation талаботи вақтро барои таҳлили MS/MS зиёд мекунад
Пеш аз таҳлили LC-MS/MS ҳассосиятро зиёд мекунад Дақиқии ками миқдорӣ дар омехтаҳои мураккаб бидуни тамғагузории пептид
"Нардбон" ҳамчун нишонаи таназзули протеолитикӣ Протеинҳои дорои Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
СИЛАК Нишондиҳии изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра Варианти ҳадди ақали таҷрибавӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Дақиқии бузурги миқдорӣ Барои ҳуҷайраҳое, ки дар фарҳанг паҳн намешаванд, яъне кардиомиоцитҳо мувофиқ нестанд
Осонии истифода барои ҳуҷайраҳои фарҳанг, ки иловаҳои хунобаи филтршударо афзоиш медиҳанд ва таҳаммул мекунанд Тамғагузории метаболикии ҳайвонот қимат аст
iTRAQ, барчаспҳои TMT Тамғагузории изотопии пептидҳо Дурустии хуби миқдорӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Онро бо бофтаҳо ва инчунин фарҳангҳои ҳуҷайра истифода бурдан мумкин аст Спектрҳои омехтаи MS/MS дорои ионҳои репортер аз пептидҳои гуногун мебошанд
Ихтисорот. Номи пурра ва шарҳ. Афзалиятҳо. Камбудиҳо.
ДИGE Фарқи электрофорези гел Миқдор дар сатҳи сафеда Ҳассосияти паст
Визуалии тағиротҳои посттранслятсионӣ ва изоформҳои сафеда Танҳо сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда аз ҷониби MS/MS муайян карда мешаванд
Дурустии хуби миқдорӣ Протеинҳои дорои pI ё Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
Gel-LC-MS/MS Ҷудокунӣ бо SDS–PAGE пеш аз таҳлили LC-MS/MS Осонии истифода Prefractionation талаботи вақтро барои таҳлили MS/MS зиёд мекунад
Пеш аз таҳлили LC-MS/MS ҳассосиятро зиёд мекунад Дақиқии ками миқдорӣ дар омехтаҳои мураккаб бидуни тамғагузории пептид
"Нардбон" ҳамчун нишонаи таназзули протеолитикӣ Протеинҳои дорои Mw хеле баланд ё паст дар гел ҳал намешаванд
СИЛАК Нишондиҳии изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра Варианти ҳадди ақали таҷрибавӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Дақиқии бузурги миқдорӣ Барои ҳуҷайраҳое, ки дар фарҳанг паҳн намешаванд, яъне кардиомиоцитҳо мувофиқ нестанд
Осонии истифода барои ҳуҷайраҳои фарҳанг, ки иловаҳои хунобаи филтршударо афзоиш медиҳанд ва таҳаммул мекунанд Тамғагузории метаболикии ҳайвонот қимат аст
iTRAQ, барчаспҳои TMT Тамғагузории изотопии пептидҳо Дурустии хуби миқдорӣ Миқдор дар сатҳи пептидҳо
Онро бо бофтаҳо ва инчунин фарҳангҳои ҳуҷайра истифода бурдан мумкин аст Спектрҳои омехтаи MS/MS дорои ионҳои репортер аз пептидҳои гуногун мебошанд

Равишҳои протеомикӣ. Экстрактҳои сафеда метавонанд дар сатҳи сафеда пеш аз ҳозима ё пас аз ҳазми сафеда дар сатҳи пептидҳо тақсим карда шаванд. Дар DIGE, иқтибосҳои сафеда бо рангҳои гуногуни флуоресцентӣ пеш аз ҷудо кардани онҳо бо 2-DE нишонгузорӣ карда мешаванд. Барои SILAC, ҳуҷайраҳо дар фарҳанг бо ворид кардани аминокислотаҳои вазнин ё сабук ба таври метаболикӣ нишон дода мешаванд. Интихобан, тамғагузорӣ дар сатҳи пептид бо истифода аз барчаспҳои iTRAQ ё TMT изобарӣ анҷом дода мешавад. Пас аз он пептидҳо аз ҷониби MS/MS таҳлил карда мешаванд. 2-DE, электрофорези гелии дученака DIGE, электрофорези гелии фарқият 1-DE, электрофорези гели якченака SILAC, тамғагузории изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра AA, аминокислотаи iTRAQ, теги изобарӣ барои миқдори нисбӣ ва мутлақ TMT, тандем теги оммавӣ.

Равишҳои протеомикӣ. Экстрактҳои сафеда метавонанд дар сатҳи сафеда пеш аз ҳозима ё пас аз ҳазми сафеда дар сатҳи пептидҳо тақсим карда шаванд. Дар DIGE, иқтибосҳои сафеда бо рангҳои гуногуни флуоресцентӣ пеш аз ҷудо кардани онҳо бо 2-DE нишонгузорӣ карда мешаванд. Барои SILAC, ҳуҷайраҳо дар фарҳанг бо ворид кардани аминокислотаҳои вазнин ё сабук ба таври метаболикӣ нишон дода мешаванд. Интихобан, тамғагузорӣ дар сатҳи пептид бо истифода аз барчаспҳои iTRAQ ё TMT изобарӣ анҷом дода мешавад. Пас аз он пептидҳо аз ҷониби MS/MS таҳлил карда мешаванд. 2-DE, электрофорези дученакаи гел DIGE, электрофорези гелии фарқият 1-DE, электрофорези гелии якченака SILAC, тамғагузории изотопи устувор бо аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра AA, аминокислотаи iTRAQ, теги изобарӣ барои миқдори нисбӣ ва мутлақ TMT, тандем теги оммавӣ.

2.1 Электрофорези ду-ченака гел

Электрофорези дученакаи гелӣ (2-DE) имкон медиҳад, ки сафедаҳо аз рӯи нуқтаи изоэлектрикӣ (pI) ва вазни молекулавӣ (Mw) ҷудо карда шаванд. 5 Андозаи аввал ҷудо кардани сафедаҳо аз рӯи pI-ро дар бар мегирад. Омехтаи сафеда ба рахи дорои градиенти рН беимбил гузошта мешавад. Пас аз ба кор андохтани майдони электрикӣ, сафедаҳо ба pI-и худ муҳоҷират мекунанд, ки дар он ҷо онҳо звитерионӣ мешаванд, яъне онҳо заряди холиси худро гум мекунанд ва муҳоҷиратро қатъ мекунанд (фокуси изоэлектрикӣ). Пас аз ба итмом расидани фокуси изоэлектрикӣ, тасмаҳои градиенти беимбилизатсияшудаи рН ба гелҳои формати калон барои ҷудокунӣ дар андозаи дуюм интиқол дода мешаванд, ки дар он сафедаҳо мувофиқи массаи молекулавии онҳо тавассути SDS-PAGE ҳал карда мешаванд.

Баръакси SDS-PAGE, гелҳои 2-DE харитаҳои мураккаби протеомаҳоро ба вуҷуд меоранд, ки ҳамчун "нуқтаҳои" сафедаи дискретӣ тасвир карда мешаванд. Азбаски pI ва Mw хосиятҳои мустақил мебошанд, гелҳои 2-DE метавонанд сафедаҳои бештарро аз SDS-PAGE ҳал кунанд. Муҳим он аст, ки як сафеда метавонад дар якчанд нуқтаҳои гел мавҷуд бошад. Гузаришҳо дар pI ё Mw мавҷудияти тағиротҳои пас аз трансляция, таназзули сафедаҳо ё изоформҳои сафедаро нишон медиҳанд. 6, 7 Хусусиятҳои сафеда бо рангкунии Coomassie ё нуқра тасвир карда мешаванд ва ифодаи дифференсиалии байни намунаҳо бо истифода аз миқдори нисбии денситометрӣ муайян карда мешавад. Бо вуҷуди ин, тағирёбии гел ба гел метавонад дақиқии миқдорӣро маҳдуд кунад ва ошкор кардани фарқиятҳои ночизро дар ифода манъ кунад.

Техникаи мураккабтари 2-DE ин электрофорези фарқкунандаи гел мебошад (DIGE, Расми 2А). 8 DIGE тамғагузории флюоресцентии омехтаҳои сафеда бо Cy-рангҳоро барои муайян кардани фарқиятҳои нисбии ифодаи сафедаҳо дар бар мегирад. Стандарти дохилӣ, ки намунаҳои таҷрибавии ҷамъшударо дар бар мегирад, ки намояндаи ҳамаи намунаҳо мебошад. Ҳассосияти ошкор кардани DIGE бо ҳассосияти рангкунии нуқра 9 муқоиса карда мешавад ва рангҳо барои pI ва Mw мувофиқанд. Бартарии асосии DIGE нисбат ба гелҳои анъанавии 2-DE дар он аст, ки намунаҳоро метавон дар як гел мултипликатсия кард ва ҳамин тариқ шумораи гелҳои лозимиро кам мекунад ва варианти таҷрибавиро маҳдуд мекунад. DIGE, ки бо стандарти дохилӣ истифода мешавад, фарқиятро то 10% дар ифодаи сафеда ба таври эътимодбахш муайян мекунад. 10 Гелҳо бо истифода аз сканери флуоресцентӣ скан карда мешаванд, ки он махсусан дарозии мавҷи партобҳои ҳар як Cy-dye-ро чен мекунад. Бастаҳои нармафзори тиҷоратӣ бо хусусиятҳои сафеда мувофиқат мекунанд ва ифодаи дифференсиалиро аз тасвирҳои гели сканшуда ҳисоб мекунанд. Нормализатсияи сатҳи сафедаҳо дар гелҳо бо роҳи муқоисаи таносуби сафедаҳо бо стандарти дохилӣ, ки дар ҳар як гел якҷоя муайян карда мешавад, анҷом дода мешавад.

Протеомика дар асоси гел. Ҷудо кардани протеомаи дилҳои мурин аз ҷониби DIGE дар градиентҳои гуногуни immobilized pH: pH 3-10 NL (А) ва рН 4–7 (Б). Қуттии сафед ҳалли беҳтари ҳамон минтақаро дар градиенти танги рН таъкид мекунад. (C) Тақсимоти Mw шаш гликопротеинҳои берун аз ҳуҷайра тавассути SDS-PAGE. "Нардбони" хос дар аневризмаҳои аорти шикам (AAA) дар муқоиса бо бофтаи муқаррарии аорта (CON) нишонаи протеолиз аст. Тафовут дар ҳисобҳои спектрӣ бо рангҳо (сурх баланд, кабуд паст) мебошанд. (Д) Инкубатсияи бофтаҳои солими аорта бо матритсаи металлопротеиназа-12 (MMP-12) як шакли тақсимшавии фибронектинро, ки дар ААА мушоҳида шудааст, ба вуҷуд овард. Дар муқоиса, таназзул аз ҷониби матритсаи металлопротеиназаҳо-9 (MMP-9) камтар ба назар мерасид (бо иҷозати Дидангелос дубора тавлид шудааст) ва дигарон. 15 ).

Протеомика дар асоси гел. Ҷудо кардани протеомаи дилҳои мурин аз ҷониби DIGE дар градиентҳои гуногуни immobilized pH: pH 3-10 NL (А) ва рН 4–7 (Б). Қуттии сафед ҳалли беҳтари ҳамон минтақаро дар градиенти танги рН таъкид мекунад. (C) Тақсимоти Mw шаш гликопротеинҳои берун аз ҳуҷайра тавассути SDS-PAGE. "Нардбони" хос дар аневризмаҳои аорти шикам (AAA) дар муқоиса бо бофтаи муқаррарии аорта (CON) нишонаи протеолиз аст. Тафовут дар ҳисобҳои спектрӣ бо рангҳо (сурх баланд, кабуд паст) мебошанд. (Д) Инкубатсияи бофтаҳои солими аорта бо матритсаи металлопротеиназа-12 (MMP-12) як шакли тақсимшавии фибронектинро, ки дар ААА мушоҳида шудааст, ба вуҷуд овард. Дар муқоиса, таназзул аз ҷониби матритсаи металлопротеиназаҳо-9 (MMP-9) камтар ба назар мерасид (бо иҷозати Дидангелос дубора тавлид шудааст) ва дигарон. 15 ).

Баръакси дигар усулҳои протеомикӣ, миқдор аз ҷониби 2-DE дар сатҳи сафеда анҷом дода мешавад, на дар сатҳи пептид ва миқдор аз муайянкунӣ тавассути масс-спектрометрия (MS) ҷудо карда мешавад. Рангҳои нуқраро барои визуализатсияи хусусиятҳои сафеда дар гел истифода бурдан мумкин аст, то буридани нуқтаҳои дахлдори MS-ро осон кунад. Алтернативӣ, доғҳо мустақиман аз гелҳои флуоресцентӣ бо истифода аз дастгоҳи роботии спот интихоб карда мешаванд. Пас аз муайян кардани сафеда, доғҳо ба ҳазми триптикии гелӣ дучор мешаванд.

Яке аз огоҳиҳои асосии равиши 2-DE дар он аст, ки сафедаҳои фаровон сафедаҳои камтарро ниқоб мекунанд. Инро метавон қисман бо истифода аз градиентҳо бо диапазони танги рН ҳал кард (Расми 2B). Аммо ҷудоӣ дар андозаи аввал, махсусан гузаштан аз андозаи якум ба андозаи дуюм бе талаф нест ва сафедаҳои хеле калон, хурд ва гидрофобӣ ҳалли мушкил боқӣ мемонад.

2.2 Моеъ-хроматографияи тандеми масс-спектрометрия

Масс-спектрометрияи тандеми моеъ-хроматография (LC-MS/MS) стандарти тиллои кунунӣ дар протеомика мебошад. Принсипи асосии MS ченкунии таносуби масса ба зарядро дар бар мегирад (м/з) пептиди ионизатсияшуда ва маҳсулоти фрагментатсияи он. Протеинҳо дар аввал тавассути ферментҳо ба монанди трипсин ҳазм карда мешаванд, то порчаҳои пептидҳоро ба вуҷуд оранд, ки онҳоро тавассути LC марҳилаи баръакс ҳал кардан осонтар ва тавассути электроспрей MS ионизатсия мекунанд. 11 Вобаста аз гидрофоб будани худ, пептидҳо дар нуқтаҳои гуногуни вақт аз сутуни фазаҳои баръакс (вақти нигоҳдорӣ) ҷудо мешаванд. Ҷараёни маъмулии кор бо истифода аз LC-MS/MS скани мунтазами тадќиќотро барои сабти масса ва шиддатнокии пептидњои гузаранда дар бар мегирад. Ионҳои пешгузаштаи фаровоне, ки аз сутун ҷудо мешаванд, барои фрагментатсия интихоб карда мешаванд (MS/MS). Маълумот дар бораи пайдарпайии аминокислотаҳо, ки аз маълумоти MS/MS гирифта шудааст, имкон медиҳад, ки сафеда муайян карда шавад. Параметрҳои пептидҳо, ба монанди ҳисобҳои спектрӣ, шиддатнокии ионҳо ва минтақаи қуллаи хроматографӣ, метавонанд шохиси миқдорӣ барои фаровонии сафедаҳоро таъмин кунанд (миқдори бидуни нишона). 12 Гуногунии технологияи масс-спектрометрӣ шумораи зиёди спектрометрҳои массаи гуногунро ба вуҷуд овард, ки MALDI-TOF-TOF, Q-TOF ва Orbitrap 13 аз ҷумлаи маъмултаринҳое мебошанд, ки ҳоло барои кашфи протеомика истифода мешаванд.

2.3 Таҳлили Gel-LC-MS/MS

Пеш аз фраксия аз ҷониби SDS-PAGE пеш аз MS дар тавсифи намунаҳое, ки барои ҷудо кардани 2-DE қобилият надоранд, муфид буд. Он инчунин барои бартараф кардани як сабаби бузургтарини ғараз дар муқобили сафедаҳои кам-фаров кӯмак мекунад - стохастикӣ дар зери намунаи пептидҳои фаровон, ки аз сабаби пептидҳои фаровони фаровон дар давраи вазифаи масс-спектрометр бартарӣ доранд. Барои таҳлили gel-LC-MS/MS, сафедаҳо бо SDS–PAGE ҷудо карда мешаванд, тамоми хати гел ба як қатор бандҳо тақсим карда мешавад, бандҳо бе гузоштани пораҳои гели холӣ бурида мешаванд, бо трипсин ҳазм карда мешаванд ва LC-MS/ Таҳлили MS дар ҳар як гурӯҳ гузаронида мешавад. 14, 15 Азбаски бандҳои gel одатан омехтаи сафедаҳо мебошанд, ҷудокунии LC барои муайян кардани сафедаҳо ва миқдор муҳим аст, яъне тавассути ҳисобкунии спектр. 16 Ҳисобкунии спектралӣ як стратегияи маъмул барои муайян кардани миқдори нисбии сафеда шудааст, аммо барои омехтаҳои мураккаб камтар эътимоднок аст. Умуман, ҳар қадар сафеда фаровон бошад, ҳамон қадар эҳтимоли он аз ҷониби MS/MS муайян карда мешавад. Ҳисобҳои спектралӣ аз шумораи спектрҳои MS/MS, ки ба сафедаи мушаххас мувофиқанд, гирифта мешаванд.

Дар равиши gel-LC-MS/MS, маълумот дар бораи Mw модарии сафеда нигоҳ дошта мешавад. Агар деградатсияи сафеда пеш аз ҳозими триптӣ рух дода бошад, пептидҳо аз ҷониби MS дар сегментҳои гелӣ аз Mw пешбинишудаи сафедаҳои ватанӣ камтар муайян карда мешаванд (Расми 2C). Ҳамин тариқ, тафтиш дар бораи он, ки оё сафедаҳои ба таври дифференсиалӣ ифодашуда дар як бандҳои гелӣ маҳдуданд, муҳим аст. Дар акси ҳол, сафедаи таназзулшуда метавонад аз сабаби "нардбон" хоси он дар SDS-PAGE (Расми 2D). Интихобан, порчаҳои сафеда метавонанд хеле хурд бошанд ва аз ошкор гурезанд, зеро онҳо пеш аз фронти буферӣ муҳоҷират кардаанд. Аз тарафи дигар, маълумот дар бораи маҳсулоти таназзули протеолитикӣ муҳим аст ва дар протеомикаи оддии тирандозӣ, ки пептидҳои триптиро бидуни ҷудошавии пешакӣ дар сатҳи сафедаҳо таҳлил мекунанд, гум мешавад.

2.4 Протеомикаи тирандозӣ

Ба ғайр аз равишҳои ба гел асосёфта, усулҳои бидуни гел барои муайян кардани фарқияти ифодаи сафеда дар асоси фаровонии пептидҳо мавҷуданд. Гарчанде ки ин усулҳои протеомикии тирандозӣ метавонанд ба протеом амиқтар ворид шаванд, агар намунаҳо хеле мураккаб бошанд, бо миқдор мушкилот ба миён меоянд. MS аз сабаби фарқияти самаранокии ионизатсия табиатан миқдорӣ нест. Ионҳои фаровонтарин ҳангоми ионизатсияи электроспрей зарядҳои бештарро ҷалб мекунанд ва эҳтимолияти ионизатсия шудани пептидҳои сатҳи пастро коҳиш медиҳанд. Барои пешгирӣ кардани тағироти бардурӯғи мусбати сафеда дар натиҷаи якҷояшавии пептидҳои фаровон, усулҳои тамғагузорӣ бояд барои ченкунии боэътимод истифода шаванд. Усулҳои маъмули тамғагузорӣ иборатанд аз теги изобарӣ барои миқдори нисбӣ ва мутлақ (iTRAQ), тегҳои массаи тандемӣ (TMT) ва тамғагузории изотопи устувор аз ҷониби аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра (SILAC). 17 iTRAQ дар айни замон ҳамчун чор-плекс ва ҳашт-плекс дастрас аст, ки имкон медиҳад миқдори нисбии то ҳашт намунаро муайян кунад, дар ҳоле ки тамғагузории TMT ва SILAC метавонад мутаносибан бо шаш ва се намуна истифода шавад. 18 Бо вуҷуди ин, пептидҳо танҳо як ченаки суррогатӣ мебошанд ва на ҳамеша барои миқдори сафедаҳо боэътимоданд, яъне агар онҳо ба тағирёбии пас аз трансляция ё протеолиз дучор шаванд.

2.4.1 Тамғагузории изотопҳои устувори аминокислотаҳо дар фарҳанги ҳуҷайра

SILAC тамғакоғазҳои изотопҳои радиоактивиро барои нишон додани сафедаҳо бо изотопҳои сабук (масалан, 12 C) ва изотопҳои вазнин (масалан, 13 C) истифода мебарад. 18 Намунаҳоро дар давоми як MS мултиплекс кардан ва таҳлил кардан мумкин аст ва ба ин васила хатои таҷрибавӣ кам карда мешавад. 19 Ҷуфтҳои SILAC ҳангоми хроматография якҷоя мешаванд, аммо пептидҳои мувофиқи изоформаи вазнин ва сабук бо тағирёбии хоси масса пайдо мешаванд. Миқдори нисбии ҳар як сафеда метавонад бо фарқияти шиддатнокии қуллаи пептидҳои бо аломати SILAC гузошташуда ҳисоб карда шавад. Истифодаи SILAC барои муайян кардани сатҳи дифференсиалии сафедаҳо аз истифодаи ҳуҷайраҳо дар фарҳанг фаротар аст. Мушҳои бо аломати SILAC бо тамғагузории қариб пурраи ҳамаи сафедаҳо тавсиф карда шудаанд, гарчанде парҳези SILAC гарон аст. 20 Тамғагузории метаболикӣ инчунин маълумотро дар бораи синтез ва манбаи кислотаи аминокислотаҳо, маҷмӯи сафедаҳо ва кинетикаи гардиш пешниҳод мекунад.

2.4.2 Барчаспкунии изобарӣ барои тегҳои массаи нисбӣ ва мутлақи миқдор/тандем

Дар ҳолатҳое, ки бофтаи инсон истифода мешавад, iTRAQ ё TMT як вариант барои мултиплекс кардани намунаҳои клиникӣ барои омӯзиши дифференсиалии экспрессия аз ҷониби LC-MS/MS мебошад, 21, аммо ин усулҳо бидуни огоҳӣ нестанд. 22 (i) Як нуқсони системаи iTRAQ ва TMT нисбат ба SILAC он аст, ки тамғагузорӣ дар сатҳи пептид анҷом дода мешавад ва дер дар раванди таҷрибавӣ рух медиҳад.Пеш аз тамғагузорӣ, сафедаҳо аввал аз ҳуҷайраҳо ё бофтаҳо истихроҷ карда, ба пептидҳо ҳазм карда мешаванд. Ин як манбаи эҳтимолии тағирот аст. (ii) Баръакси SILAC, миқдор дар сатҳи MS/MS анҷом дода мешавад, на дар сатҳи MS. Пептидҳои намунаҳои гуногун якхелаи худро нигоҳ медоранд м/з таносуби пас аз тамғагузорӣ (MS). Танҳо ҳангоми тақсимшавӣ (MS/MS), тегҳои массаи изобарӣ ионҳои гуногуни гузоришгари худро бо ивазкунии ягонаи изотопӣ барои ҳар як тег мебароранд ва барои ҳар як намунаи инфиродӣ маълумоти миқдорӣ медиҳанд. Мушкилоте, ки дар таҷрибаҳои iTRAQ маъмулан мушоҳида мешавад, ин аст, ки заминаи мураккаб метавонад ба нодида гирифтани тағироти қабати сафеда оварда расонад. Ҳангоми интихоби ионҳои прекурсор, зиёда аз як пептидҳо метавонанд дар дохили равзанаи оммавӣ, ки барои тақсимшавӣ интихоб шудаанд, бошанд. Дар чунин спектрҳои омехтаи MS/MS, ионҳои репортерӣ, ки аз пептидҳои сафедаҳои гуногун сарчашма мегиранд, барои муайян кардани миқдор иштибоҳан муттаҳид карда мешаванд.

2.5 Муайянкунии сафедаҳо

Гарчанде ки барои ҳар як соҳаи '-омикс' базаҳои дақиқ ва дастрас лозиманд, протеомика шояд аз ин захираҳо бештар вобаста бошад. Технологияҳои муайян кардан ва муайян кардани миқдори сафедаҳо ба пойгоҳи додаҳои ҳамаҷониба барои муайян кардани сафедаҳо ва миқдори пептидҳо такя мекунанд. Ин пойгоҳи додаҳо мустақиман дар доираи биологияи системавӣ нестанд, аммо онҳо барои таҳлилҳои охирин замина фароҳам меоранд, зеро мураттабсозӣ ва нигоҳдории ин пойгоҳҳо барои дуруст муайян кардан ва муайян кардани миқдори сафедаҳои тафтишшуда муҳиманд.

Барои пойгоҳи додаҳои функсионалӣ ва пайдарпай, UniProt яке аз ҳама фарогиртарин мебошад. UniProt аз якчанд таснифҳо иборат аст: Swiss-Prot ва TrEMBL дорои пайдарпайӣ ва функсионалӣ дар бораи сафедаҳо мебошанд, UniRef ва UniParc сабтҳои пайдарпайӣ ва бойгонии пайдарпайро дар бар мегиранд ва дар сурати мавҷуд будани маълумоти дастгирӣ ба монанди истинодҳои адабиёт ва пойгоҳи додаҳои истинодшуда. 23 Барномаҳо ба монанди Mascot, SEQUEST ё X!Tandem пайдарпайии сафедаи FASTA-ро ҷустуҷӯ мекунанд, ки аз пойгоҳи додаҳои ҷамъиятӣ ба монанди UniProt гирифта шудаанд. Пас аз иҷрои як 'дар кремний фрагментатсия' бо хосияти маълуми фермент, рӯйхати баландтарин масса бо шиддатнокӣ (маълумоти таҷрибавӣ) бар зидди дар кремний- пойгоҳи додаҳои тақсимшуда. Массаҳои ионҳои волидайн бар зидди массаҳои аз пайдарпаии пойгоҳи додаҳо гирифташуда скан карда мешаванд. Агар дар доираи таҳаммулпазирии муайяни омма мувофиқат мавҷуд бошад, пас спектрҳои мушоҳидашудаи MS/MS бо силсилаи ионҳои пайдарпайи назариявӣ муқоиса карда мешаванд. Гарчанде ки дар ин ҷо ба таври возеҳ фаро гирифта нашудааст, барраси ва шарҳи Нобл ва МакКосс 24 дар бораи ин методология ва усулҳо фаҳмиш медиҳад. Алгоритмҳои баҳогузорӣ метавонанд натиҷаҳои гуногун ба даст оранд ва такя ба идентификацияҳои якпептидӣ дар маҷмӯаҳои маълумотии калон сабаби эҳтимолии мушаххасоти бардурӯғ аст. Аксари тадқиқотҳои протеомикӣ танҳо дар бораи идентификация бо ҳадди аққал ду пептидҳои беназир гузориш медиҳанд ё спектрҳои MS/MS барои идентификацияи якпептидиро дар бар мегиранд.


Усулҳо

Маводи растанӣ ва гирифтани намуна

Дар ин тадқиқот навъи элитаи ҷуворимаккаи чинии Denghai 661 (DH351/DH372) истифода шудааст. Тухми аз Shandong Denghai Seeds Co., Ltd (Лайчжоу, Чин) гирифта шудааст. Растаниҳо дар мавсими парвариши ҷуворимакка дар хоҷагии таҷрибавии Донишгоҳи кишоварзии Шандун, Тайан (36°10′E, 117°04′N), Хитой парвариш карда шуданд. Растанихое, ки дар як руз шукуф-танд, тег зада, ба таври сунъй гардолуд карда мешуданд. Дар ҳар як марҳилаи 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ва 50 DAP нӯҳ гӯша ҷамъоварӣ карда шуд. Бо максади зиёд кардани якхела будани масолех аз кисми миёнаи хар як хӯша донаҳои бордоршуда намуна гирифта шуданд. Барои ҳар як марҳила, се намуна бо омехта кардани миқдори баробари донаҳои се дона омода карда шуд, намунаҳо фавран дар -80 °C то истихроҷи сафеда нигоҳ дошта шуданд. Вазни тару тоза ва вазни хушк дар ҳар як марҳилаи ғалла чен карда шуд. Донаҳои 10-50 DAP ва 3-30 DAP барои муайян кардани миқдори умумии крахмал ва шумораи ҳуҷайраҳои эндосперм, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ҷамъоварӣ карда шуданд [83].

Истеҳсоли протеин

Намунаҳои ғалладона бо истифода аз як миномет ва петле ба хокаи майда дар нитрогени моеъ хок карда шуданд, хока дар ҳаҷми 10-каратаи ацетони қаблан хунукшуда (-20 °C), ки дорои 10% (ҳ/в) кислотаи трихлорассусӣ (TCA) аст, боздошта шуд. Пас аз омезиши ҳамаҷониба гомогенат барои 2 соат дар -20 °C борик карда шуд. Сипас гомогенат барои 30 дақиқа дар 20,000 центрифуга карда шуд г дар 4 °C ва супернатант бодиққат хориҷ карда шуд, пеллетро се маротиба бо ацетони хунук шуста, дар -20 °C барои 30 дақиқа гузошта, сипас дар 20,000 центрифуга кард. г барои 30 дақиқа дар 4 ° C. Пеллетҳои ҳосилшуда дар буфери лизис, ки дорои 8 М мочевина, 30 мм HEPES, 1 мм поливинилполипирролидон (PMSF), 2 мм EDTA ва 10 мм дитиотреитол (DTT) мебошанд, гудохта шуда, сипас барои 5 дақиқа соникатсионӣ карда шуданд. Иқтибоси сафедаи гудохташуда дар 20,000 центрифуга карда шуд г барои 30 дақиқа дар 4 °C, супернатант ҷамъоварӣ карда шуд ва бо 10 мм DTT дар 56 °C барои 1 соат кам карда шуд ва сипас бо 55 mM йодоацетамид (IAM) барои 1 соат дар торикӣ алкилизатсия карда шуд. Омехта бо истифода аз ҳаҷми 5-каратаи ацетони хунук дар -20 °C барои 3 соат боришот ва пас аз центрифуга дар 20,000 г барои 30 дақиқа. Пелети ҳосилшуда дар буфери 0,5 М триэтиламмоний бикарбонати (TEAB) бо 0,1% SDS гудохта шуд, дар тӯли 5 дақиқа сонификатсия карда шуд ва дар 20,000 центрифуга карда шуд. г барои 30 дақиқа. Дар супернатант барои ҳазми моеъ истифода шуд ва консентратсияи сафеда бо истифода аз таҳлили Брэдфорд (Bio-Rad, Hercules, CA, ИМА) бо BSA ҳамчун стандарт муайян карда шуд.

Дар ҳазми маҳлул ва тамғагузории iTRAQ

Барои ҳар як намуна, 3,3 мкл трипсин (1 мкг/мкл) (Промега, Мадисон, WI, ИМА) ба 100 мкг протеин дар буфери TEAB илова карда шуд ва сафедаҳо дар 37 °C барои 24 соат ҳазм карда шуданд. Як аликвоти тару тозаи трипсин (1 мкл) илова карда шуд ва намуна дубора барои 12 соат ҳазм карда шуд. Преципитат дар 30 мкл 0,5 М TEAB гудохта ва бо 70 мкл изопропанол омехта карда шуд. Сипас, пептидҳои ҳазмшуда мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо реагентҳои iTRAQ (AB SCIEX, Framingham, MA, ИМА) нишонгузорӣ карда шуданд. Намунаҳои ғалладона, ки аз 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ва 50 DAP гирифта шудаанд, мутаносибан бо реагентҳои iTRAQ 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ва 121 нишонгузорӣ карда шудаанд. Се озмоиши мустақили биологӣ гузаронида шуд.

SCX ва LC-MS/MS

Пептидҳои ҷамъшуда дар буфери A (10 мМ фосфати калийи монобазивӣ (KH) мубодилаи катионҳои қавӣ (SCX) гудохта шуданд.2PO4) дар 25% ацетонитрил, рН 2,8). Омехта бо истифода аз кислотаи фосфорӣ ба pH 3 танзим карда шуд ва сипас бо истифода аз системаи хроматографияи моеъи баландсифат (HPLC) (Шимадзу, Киото, Ҷопон) бо сутуни кремнийи SCX (250 × 4,6 мм, 5 мкм, 100) муҷаҳҳаз карда шуд. Å, Phenomenex, Torrance, CA, ИМА). Дар маҷмӯъ, 36 фраксия бо суръати ҷараёни 1 мл/дақ бо буфери B (10 mM KH) ҷамъоварӣ карда шуд.2PO4 ва 2 М хлориди калий (KCl) дар 25% ацетонитрил, рН 2.8) бо градиенти зерин: 0% барои 45 дақиқа, 0-5% барои 1 дақиқа, 5-30% барои 20 дақиқа, 30-50% барои 5 дақиқа ва дар давоми 5 дақиқа ва 50-100% барои 5 дақиқа нигоҳ дошта, барои 10 дақиқа нигоҳ дошта мешавад. Фраксияҳо бо қабати-X 33 мкм PolyRevStage SPE (Phenomenex) пас аз дастурҳои истеҳсолкунанда намакин карда шуданд ва дар консентраттори вакууми суръати центрифуга лиофилизатсия карда шуданд. Сипас, ба ҳар як найчаи фраксияи хушкшуда 30 мкл кислотаи 0,1% формикӣ илова карда шуд ва 0,1 мкл маҳлули аз нав гудохташуда дар чоҳи мавриди ҳадафи лавҳаи Anchor-chip барои санҷиши MALDI-TOF пайдо шуд. Пас аз санҷиши MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Олмон), 36 фраксияҳо мувофиқи минтақаи қулла ба 16 фраксияи ниҳоӣ муттаҳид карда шуданд.

Таҳлили масс-спектрометрӣ дар системаи Dionex Ultimate 3000 Nano LC, ки ба спектрометри массаи Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific, MA, ИМА) пайваст карда шудааст, анҷом дода шуд. Омехтаҳои пептидҳо ба сутуни фазаи баръакси Acclaim PePmap C18 (75 мкм × 2 см, 3 мкм, 100 Å, Thermo Scientific) бор карда шуданд ва бо сутуни баръакси фазаи C18 (75 мкм × 10 см, 5 мкм, 300) ҷудо карда шуданд. , Agela Technologies) бо истифода аз градиенти 5-80% (v/v) ацетонитрил дар кислотаи формикии 0,1% дар тӯли 45 дақиқа бо суръати ҷараёни 300 нЛ/дақ. Маҳлулкунандаи А 0,1% кислотаи формин дар об буд. Сканкунии пурраи масс-спектрометрӣ (MS) (350–2000 м/з) дар резолюцияи 70,000 (дар 200 м/з), арзиши ҳадафи AGC 3–6, вақти максималии ҷамъшавии ионҳо дар ҳолати ионҳои мусбат ба даст оварда шуд. 50 мс, шумораи диапазони скан 1 ва истиснои динамикӣ 15 сония. Маълумот дар бораи пептидҳо ва порчаҳои пептидҳо m/z бо истифода аз шартҳои зерин ба даст оварда шуданд: 20 файли порчаҳо пас аз ҳар як скан пурра ҷамъоварӣ карда шуданд (скани MS2), порашавии баландтари бархӯрди энергия (HCD), равзанаи изолятсияи 2 м/з, скан пурра бо қарори 17,500 (дар 200 м/з), микросканҳои 1, вақти максималии ҷамъшавии ионҳо 100 мс, энергияи бархӯрди нормалшуда 28 эВ ва коэффитсиенти камобӣ 1%.

Таҳлили маълумот

Барои муайян кардани сафеда, файлҳои хоми MS бо Proteome Discoverer 1.3 (Thermo Fisher Scientific) коркард ва бо нармафзори дохилии MASCOT 2.3.01 (Matrix Science, Лондон, Британияи Кабир) ҷустуҷӯ карда шуданд. Спектрҳои ба даст овардашудаи MS/MS ба таври худкор бар зидди UniProt- ҷустуҷӯ карда шуданд.Зеамаихо махзани сафеда (86,922 пайдарпаии дар моҳи декабри соли 2014). Параметрҳои ҷустуҷӯ инҳо буданд: трипсин ҳамчун фермент бо як пораи пазмон интихоб карда шуд, имкон дод, ки тағироти собитшудаи карбамидометилизатсияи боқимондаҳои систеин iTRAQ 8-плекси модификацияи N терминал, K ва Y, Gln → Pyro-Glu аз терминали N ва оксидшавӣ. Метионин ҳамчун таҳаммулпазирии пептидҳои тағирёбанда дар 15 ppm ва таҳаммулпазирии MS/MS 20 мму муқаррар карда шуданд. Барои муайян кардани сафедаҳо ва таҳлили маълумоти миқдорӣ ҳадди аққал як пептиди беназир бо суръати кашфи бардурӯғ (FDR) ≤1% лозим буд.


Видеоро тамошо кунед: Thermo Orbitrap Fusion Animation (Сентябр 2022).


Шарҳҳо:

  1. Guzilkree

    Ором бошед!

  2. Marzuq

    Идеяи зебо

  3. Vonris

    Ман табрик мекунам, тафаккури шумо олиҷаноб аст

  4. Jayron

    Mudrenee morning evening.



Паём нависед