Маълумот

Клон кардани як гени рамзгузорӣ ба вектори ғайрифаъол


Оё клон кардани гени CODING ба вектори ҒАЙРИИ ифода ягон маъно дорад? Ин кор ба мо танҳо нусхаҳои сершумори генро медиҳад, дар ҳоле ки мо метавонем ба ҷои он PCR-ро иҷро кунем (биёед, ки мо пайдарпайии генро медонем)


Аслан, шумо метавонед ҳама гуна генро бо PCR тақвият диҳед ва сипас онро ба вектори интихоб клон кунед. Бо вуҷуди ин, ин аксар вақт осон нест. Аксари корҳоро бо векторҳои ифода кардан мумкин аст, аммо баъзан аввал клон кардани пайдарпай ва сипас зерклон кардани он осонтар аст.

Баъзе пайдарпайҳоро тақвият додан душвор аст, хусусан вақте ки онҳо дароз ё хеле дароз мешаванд. Баланд бардоштани 2,5 кб метавонад душвор бошад, ҳазм кардан ва зерклон кардани чунин порча метавонад осонтар бошад. Илова бар ин, ҳосили PCR метавонад паст бошад, дар ҳоле ки шумо аз як минипреппер ДНК-и зиёде мегиред.

Шумо метавонед сайтҳои иловагии шинохти ферментҳои маҳдудкунандаро ҷорӣ кунед (якеро метавон тавассути PCR ба осонӣ анҷом дод, аммо боз ҳам мушкилтар аст), пайвандкунанда ё барчаспҳои иловагӣ, ки дар ҳама векторҳои ифода мавҷуд нестанд. Пас аз он осонтар аст, ки қадами аввалини клонкуниро ба вектори ифоданашуда анҷом диҳед ва сипас воридкунии пурраро ба вектори ифода кунед.


Раванди клонкунии ген

Клонкунии генҳо ин раванди сохтани нусхаҳои сершумори якхелаи як пораи муайяни ДНК мебошад. Бо истифода аз ин усул мо метавонем як нусхаи як ген ё сегменти ДНК-ро ба шумораи номуайяни нусхаҳо ҷудо ва клон кунем, ки ҳамаашон якхелаанд.

Клонкунии ген ё клонкунии молекулавӣ як истилоҳи чатрест, ки як қатор протоколҳои таҷрибавиро дар бар мегирад, ки ба интиқоли иттилооти генетикӣ аз як организм ба организми дигар оварда мерасонад.

Қадамҳои клонкунии ген:

Қадамҳои клонкунии генҳо инҳоянд:

2. Буридани ДНК дар ҷойҳои мушаххас

3. Амплификацияи гени манфиатдор

4. Дохил кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба ҳуҷайраи мизбон

5. Интихоби рекомбинантҳо

Расм: Қадамҳои клонкунии ген

Изолятсияи маводи генетикӣ (ДНК)

Барои клонкунии молекулавӣ ҳам ДНК-и манбаъ, ки пайдарпаии ҳадафро дар бар мегирад ва вектори клонкунӣ бояд пайваста ба порчаҳои дискретӣ ва такроршаванда бурида шаванд. Якчанд усулҳо, аз қабили буридани механикӣ, ҳазми маҳдудкунанда, синтези c-дна, синтези кимиёвӣ ва ғайра, дар ҷудо кардани порчаҳои ДНК муфиданд.

Буридани ДНК дар ҷойҳои мушаххас

Вектор ва порчаи ДНК-и мақсаднокро бо як ферменти маҳдудкунанда алоҳида ҳазм кардан мумкин аст. Пас аз он вектори ҳазмшуда ва порчаи ДНК-и мақсаднок дар ҳузури ферментҳои ДНК лигаза якҷоя карда мешаванд. Инкубатсия боиси пайваст шудани ду намуди ДНК тавассути пайвандҳои фосфодиэстерӣ дар байни онҳо мегардад. Ҳамин тариқ, устухонҳои дезоксирибоза-фосфати молекулаи векторӣ ва порчаи ДНК мақсаднок ба таври ковалентӣ пайваст шуда, молекулаи рекомбинатии ДНК-ро ташкил медиҳанд.

Имконияти дигар дар ин таҷриба дубора пайвастани нӯгҳои часпаки худи молекулаи векторӣ мебошад, ки молекулаи даврии ДНК-и векториро ташкил медиҳад, ки бе молекулаи ДНК хориҷӣ аст. Коркарди вектори ҳазмшуда бо фосфатазаи сілтӣ ё истифодаи ферментҳои гуногуни маҳдудкунанда имкони дар боло зикршударо бартараф мекунад.

Ампификацияи генҳои манфиатдор бо истифода аз PCR

Ин раванди зарбкунии интихобии як минтақаи мушаххаси молекулаи ДНК мебошад. Амплификация бо усули махсусе ба даст меояд, ки онро реаксияи занҷири полимеразӣ меноманд. Принсипи асосии техника ин гарм кардани молекулаи дуқабата ДНК ба ҳарорати баланд аст, то ки ду риштаи ДНК ба молекулаҳои ягонаи ДНК ҷудо шаванд. Чунин молекулаҳои якқатор ДНК праймерҳои аз 10-18 олигонуклеотидҳоро барои гибридизатсияи ҳар як тори спирали дугона талаб мекунанд. Он инчунин ферментҳои ДНК полимеразаро талаб мекунад. Он як ферменти термостабист, ки онро низ меноманд Так полимераз. Давраи амплификацияи ПТР се марҳилаи асосиро дар бар мегирад - денатуратсия, тозакунӣ ва васеъшавӣ. Дар охири раванд он боиси истеҳсоли 2n шумораи молекулаҳои ДНК барои n шумораи давраҳои анҷомшуда мегардад.

Ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба ҳуҷайраи мизбон:

Қадами навбатӣ дар таҷрибаи рекомбинатии ДНК гирифтани ДНК-и клоншуда аз ҷониби E. coli талаб мекунад. Пас аз омода кардани r-ДНК-и вектор, он ба ҳости мувофиқ барои ифодаи ДНК-и хориҷӣ дохил мешавад. Раванди ворид кардани ДНК-и тозашуда ба ҳуҷайраи бактериявӣ трансформатсия номида мешавад.

Барои E.coli яке аз усулҳои табдилдиҳӣ талаб мекунад, ки ҳуҷайраҳо бо ҳарорати баланд ва хлориди калсий коркард карда шаванд. Штаммҳои E.coli дорои ферментҳои маҳдудкунанда мебошанд, аз ин рӯ онҳо ДНК-и хориҷиро вайрон мекунанд. Барои раҳоӣ аз таназзул, ҳуҷайраҳои экспоненсиалӣ афзоишёбанда бо хлориди калсий дар ҳарорати паст пешакӣ коркард карда мешаванд. ДНК-и векторӣ ба ҳуҷайраҳои бактерия дохил мешавад.

Интихоби рекомбинантҳо

Пас аз ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба ҳуҷайраи мизбон, қадами навбатӣ интихоб ё муайян кардани рекомбинантҳо мебошад. Усулҳое, ки барои ин кор истифода мешаванд, ифодаро дар бораи ифода накардани аломатҳои муайян, махсусан гени муқовимати антибиотик (масалан, гени муқовимати ампициллин) дар вектори плазмидӣ баррасӣ мекунанд. Маркери интихобшаванда одатан ба муқобили субстрат муқовимат мекунад, ки ҳангоми илова кардан ба муҳити фарҳанг афзоиши ҳуҷайраҳо ё бофтаҳои муқаррариро дар фарҳанг бозмедорад ва дар натиҷа танҳо бофтаҳои табдилёфта ба воя мерасанд.

Усули соддатарин барои муайянкунӣ парвариши ҳуҷайраҳои табдилшуда (бо гени муқовимати ампициллин) дар муҳити дорои ампициллин мебошад. Ин имкон медиҳад, ки ҳуҷайраҳои дорои ин плазми табдилёфта афзоиш ёбанд ва колонияҳо ташкил кунанд. Усулҳои дигари муайян кардани рекомбинантҳо вуҷуд доранд, ки дар асоси он, ки порчаи клоншудаи ДНК пайдарпайии рамзгузории генро халалдор мекунад. Ин ҳамчун ғайрифаъолкунии воридшавӣ номида мешавад.

Инсертиционалии гени маркер

Дар ин усул ғайрифаъолкунии гени маркери вектор бо иловаи ДНК хориҷӣ барои фарқ кардани рекомбинантҳо аз рекомбинантҳои ғайриманқул муфид аст.

Биёед як плазмиди дорои генҳои тобовар ба ду антибиотикҳои гуногун, яъне ампициллин ва тетрациклинро баррасӣ кунем. Вектори оддӣ ё муқаррарии pBR322 дорои ду гени маркери муқовимати антибиотик аст (яъне ампициллин ва тетрациклин).

Ворид кардани порчаи ДНК-и мақсаднок ба гени муқовимати ампициллин боиси ғайрифаъол шудани ин ген мегардад. Ҳамин тариқ, ҳуҷайраҳои мизбон бо чунин плазми рекомбинантӣ ба ампициллин ҳассос, вале ба тетрациклин тобовар хоҳанд буд. Ин ҳуҷайраҳои мизбон ҳангоми парвариш дар муҳити дорои ампициллин мемиранд, аммо дар муҳити дорои тетрациклин ба воя мерасанд. Векторҳои худбасташуда (яъне, рекомбинант нестанд) дар муҳити дорои ампициллин ва тетрациклин ба онҳо тобовар мерӯянд.

Усули ташхиси визуалӣ:

Мисоли дигар, вале шабеҳ, ки ғайрифаъолкунии воридкуниро дар бар мегирад, ин гени lac z E. coli мебошад. Он инчунин ҳамчун интихоби сафеди кабуд номида мешавад. Ин зудтарин усули скрининг барои интихоб аст, ки ба амали маҳсулоти ген (яъне фермент) ба моддаи хромогенӣ (дар гидролиз маҳсулоти ранги кабудро ба вуҷуд меорад) барои фарқ кардани байни рекомбинантҳо ва рекомбинантҳо такя мекунад.

Ин усулро бо ёрии вектори pUC хуб шарҳ додан мумкин аст. Ин вектор як гени маркерро дар бар мегирад, ки гени маркери lac z номида мешавад, ки барои фермент бо номи бета-галактозидаза рамзгузорӣ мешавад. Фермент ба як моддаи беранг X-gal амал карда, онро ба маҳсулоти ранги кабуд гидролиз мекунад. Илова кардани ДНК-и хориҷӣ ба гени lac z боиси ғайрифаъолшавии он мегардад. Ҳамин тариқ, он боиси ташаккули вектори рекомбинантӣ мегардад.

Рекомбинантҳое, ки вектори оддӣ доранд, дар муҳити ғизоӣ аз ҳисоби фаъолияти гени функсионалии lac z колонияҳои кабуд ба вуҷуд меоранд, ки дар он рекомбинантҳо колонияҳои сафедро ташкил медиҳанд, зеро амали гени lac z дар вектори рекомбинант гум мешавад.

Расм: Раванди клонкунии ген (интихоб/скрининги рекомбинантҳо)

Морфологияи лавҳа

Ин як усули муҳими скрининги фагҳои рекомбинантӣ мебошад. Ламбда бактериофаги дорои гени CI мебошад, ки сафедаи CI-ро (протеини репрессор) рамзгузорӣ мекунад. Ин протеини репрессори CI барои муқаррар кардани давраи ҳаёти лизогенӣ дар мизбон масъул аст E. coli ҳуҷайраҳо.


ТАРТИБИ тачрибавй

Стратегияи умумии клонсозӣ -

Усули ба таври васеъ истифодашавандаи тавлиди генҳои рекомбинантӣ тақвият додани гени мавриди таваҷҷуҳро тавассути PCR ва сипас пайваст кардани маҳсулоти PCR ба вектори плазмиди дилхоҳро дар бар мегирад. Барои осон кардани ин раванд, праймерҳои PCR метавонанд тарҳрезӣ шаванд, ки маконҳои мувофиқи маҳдудкунандаро дар ақсои ДНК-и мақсаднок барои ҳозима ва бастабандии минбаъда ба вектори интихобшуда дохил кунанд. Илова кардани маконҳои маҳдудкунанда тавассути ПЗР ҳангоми тақвияти пайдарпайии генетикӣ имкон медиҳад, ки амалан ҳама гуна гени мақсаднок ба ягон вектор ворид карда шавад [12].

Ин стратегияи клонкунӣ барои эҷоди рекомбинант истифода шудааст М. секста GFP-Ӯ6-серпин cDNA сохтори воридшуда ба вектори ифодаи pGFPuv (Clontech, Palo Alto, CA) (расми 1)А). Махсусан, А М. секста- клони мутагенизатсияшудаи cDNA-и функсионалии serpin1B (A343K), ки қаблан бо як Ҳис сохта шуда буд6 барчасп дар N терминали сафеда ҳамчун қолаб дар синтези ПТР истифода мешуд (расми 1).Б.) [9]. Примерҳои PCR барои илова кардани сайти 3′ (қатори рамзгузорӣ) EcoR1 ва сайти 5′ (қатори рамзгузорӣ) SacI ба Ҳис тарҳрезӣ шудаанд.6- пайдарпаии серпин (расми 2А). Ҳарду Ӯ6Маҳсулоти -serpin PCR ва вектори ифодаи pGFPuv аз ҷониби SacI ва EcoRI ҳазм карда шуданд. Ӯ6Маҳсулоти -serpin PCR баъдан дар охири 3′-и пайдарпаии рамзгузории GFP бо истифода аз сайти бисёр клонкунии вектори 5′ ворид карда шуд (расми 1).C). Протеини ниҳоии химерӣ GFP-ро дар охири N-терминал, як Ҳис мебарад6 теги наздикӣ бо пасмондаҳои чандири глицин дар мобайни конструксия ва cDNA-и серпин дар охири C-терминал паҳлӯ шудааст (расми 1).Д).

Идоракунии пайдарпай -

Дар давоми курс як барномаи компютерӣ барои ҳуҷҷатгузорӣ ва коркарди пайдарпаии ДНК, аз ҷумла тавлиди харитаҳои маҳдудкунӣ ва тарҷумаи пайдарпаии ДНК ба пайдарпаии сафедаҳо истифода мешуд. Дар ҳоле ки бисёре аз барномаҳои идоракунии пайдарпай дастрасанд, барномаи шарикии DNA Strider 1.1 (Macintosh) истифода шудааст [13]. Дар бисёр ҳолатҳо, пайдарпаии пурраи плазмидҳоро аз вебсайтҳои тиҷоратӣ зеркашӣ кардан мумкин аст ва тавассути ин барномаҳо идора карда мешавад. Истифодаи чунин барномаи идоракунии пайдарпаии ДНК, гарчанде ки зарур нест, донишҷӯёнро бо коркарди ДНК ва идоракунии пойгоҳи додаҳо шинос мекунад. Барномаҳои идоракунии пайдарпай дар таҳияи стратегияҳои ибтидоии клонкунӣ хеле муфид мебошанд.

Ташкили силсилаи лаборатория —

Донишҷӯёни мо ба таври инфиродӣ кор мекарданд ва ҳар яки онҳо дар давоми семестр реаксияҳои худро иҷро мекарданд. Бо вуҷуди ин, онҳо дар ҳамкорӣ ва дастгирӣ, мубодилаи маводҳо, муҳокимаи вариантҳои таҷрибавӣ, ҳамоҳангсозии истифодаи гели агароз ва ғайра машғул буданд. Аъзои факултет дар тӯли давраи лабораторӣ ҳузур дошта, роҳнамоӣ ва дахолати мувофиқро таъмин мекард. Давраи лабораторӣ як рӯз дар як ҳафта 3 соат буд. Дар чанд маврид аз донишҷӯён хоҳиш карда шуд, ки омодагии кӯтоҳе анҷом диҳанд (масалан. культурахо) дар нимаи дуйуми руз пеш аз сессияи лабораторияи мо. Ҷадвали пешниҳодшудаи машқҳои лабораторӣ дар давоми семестр дар ҷадвали I нишон дода шудааст.

Ҳафтаи якум

Трансформатсия -

Ан М. секста serpin cDNA serpin1B(A343K) қаблан ба ифодаи плазми pQME-60 клон карда шуда буд, ки ДНК-ро рамзгузории Ҳис илова кард.6 теги эпитоп ба охири N-терминали сафеда барои эҷоди плазми serpin1B(A343K) [9]. Аслан, ҳама гуна плазмид, изолятсияи геномии ДНК ё китобхонаи cDNA метавонад ҳамчун қолаби PCR дар оғози ин озмоиш хидмат кунад. Донишҷӯёни мо табдилоти ҷудогонаи плазми serpin1B (A343K) ва pGFPuv -ро иҷро карданд. Escherichia coli- ҳуҷайраҳои салоҳиятдор. Дар давоми тамоми манипуляцияҳои генетикӣ, устувор E. coli штамми клонкунӣ мавҷуд нест recA гени рекомбинатсия, ба монанди XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) ё DH5α (Invitrogen, San Diego, CA) истифода шудааст. Ҳуҷайраҳои салоҳиятдори дараҷаи зерклонкунӣ, ки ∼1 × 10 6 трансформант дар як микрограмм ДНК медиҳанд, аз манбаъҳои тиҷоратӣ гирифта шуданд. Протоколи трансформатсия, ки аз ҷониби истеҳсолкунандаи салоҳиятдори ҳуҷайра тавсия шудааст, камтар аз 2 соат тӯл кашид ва ҳуҷайраҳои натиҷавӣ дар лавҳаҳои дорои ампициллин ҷойгир карда шуданд. Ин плитаҳо дар 37 °C шабона (12-16 соат) нигоҳ дошта мешуданд, то афзоиши кофии колонияи бактерияҳоро фароҳам оранд. Рӯзи пас аз трансформатсия, донишҷӯён ба лаборатория баргаштанд, пластинҳои худро аз инкубатор ҷудо карданд, натиҷаҳои онҳоро қайд карданд ва табақҳои худро дар ҳарорати 4 °C барои давраи фосилавӣ нигоҳ доштанд. Ба донишҷӯён супориш дода шуд, ки шумораи колонияҳоро дар як микрограмм ДНК барои реаксияҳои онҳо ҳисоб кунанд.

Назорати манфӣ (бе ДНК плазмидӣ) ва назорати мусбат (ДНК плазмидӣ аз манбаи тиҷоратӣ, масалан. pUC18) барои табдил дохил карда шуданд. Донишҷӯёни мо маҳлули автоклавии пешакии гарми Лурия-Бертани (ЛБ)/агарро истифода бурда, дар оғози давраи лабораторӣ табақчаҳо рехтанд. Миқдори мувофиқи 1000 × захираи маҳлули ампициллин (0,1 г ампициллин/мл маҳлули 50% этанол/об, нигоҳдорӣ дар -20 °C) ба агари моеъ пеш аз рехтан илова карда шуд.

Ҳафтаи дуюм

Тайёр кардани плазмид -

Нимаи дуюми рӯз пеш аз давраи дуюми лабораторӣ, донишҷӯён ба культураҳои хурди (2 мл) шўрбои ампициллини LB аз як колония дар лавҳаҳои трансформатсияи худ оғоз карданд. Фарҳанг дар 37 ° C бо ларзиш (225 чархзанӣ) як шабонарӯз инкубатсия карда шуд. Донишҷӯён ин эмкуниро дар давоми ~15 дақиқа ба таври алтернативӣ анҷом доданд, факулта ё ёрдамчии омӯзгор метавонад ин фарҳангҳоро оғоз кунад. Инкубатсияи фарҳангҳо набояд аз 24 соат зиёд бошад, то плазмидҳо дар ҳуҷайраҳои солим ҳосил шаванд.

Дар давоми ҷаласаи лабораторӣ, аз ин фарҳанг ДНК-и плазмиди мувофиқ барои PCR бо истифода аз маҷмӯаи ҷудокунии ДНК-и минипреп тавлид карда шуд (аз Qiagen бо арзиши тақрибан $1 барои як тайёр кардани плазмид дастрас аст). Тартиби miniprep бояд донишҷӯи миёнаро то 1 соат дар бар гирад ва 50 мкл плазми тозашуда дар консентратсияи ~200 нг/мкл ҳосил кунад.

Маҳдудиятҳо -

Барои тасдиқи он, ки омодасозии плазмид бомуваффақият гузашт, дайджести маҳдудкунии ташхис гузаронида шуд. Ба донишҷӯён харитаи плазмид дода шуд ва хоҳиш карда шуд, ки ҳозимаи маҳдудкунандаро тарҳрезӣ кунанд, ки намунаи порчаҳои хоси плазмиди дурустро медиҳад. Масалан, ҳазм кардани вектори pGFPuv бо ферментҳои SacI ё EcoRI бояд як порчаи ягонаи хаттии ДНК-и 3,3 кб ба даст ояд, ки дар гели агарозӣ нишон дода шудааст. Ин ферментҳо ва протоколҳои ҳозима аз манбаъҳои тиҷоратӣ гирифта шудаанд (масалан. New England Biolabs, Promega). Умуман, 200 нг ДНК-и плазмиди тозашуда дар ҳаҷми умумии 10 мкл ҳазм карда шуд. Ҳазмро метавон ба осонӣ васеъ кард, то миқдори зиёди ДНК-ро ҳазм кунад. Ҳаҷми ферментҳои зарурӣ бо истифода аз фаъолияти ҳар як фермент, ки аз ҷониби истеҳсолкунанда нишон дода шудааст, ҳисоб карда шуд. Инкубатсияи 30 дақиқа одатан барои миқдори мувофиқи фермент кифоя аст, то қисми зиёди ДНК-ро ба таври махсус бурида шавад. Агар хоҳед, ҳазмҳои мураккабтарро бо истифодаи зиёда аз як фермент дар як вақт иҷро кардан мумкин аст. Агар ин интихоб амалӣ карда шавад, донишҷӯён бояд буфери ҳозима ва шароити реаксияро интихоб кунанд, ки бо ҳама ферментҳо мувофиқанд. Порчаҳои ДНК-и ҳазмшуда дар -20 °C то ҳафтаи оянда нигоҳ дошта шуданд.

Ҳафтаи сеюм

Намоиши порчаи ДНК тавассути электрофорез тавассути гели агароз

Agarose E-gels (Invitrogen) як усули бехатар ва зудро барои дидани пораҳои ДНК таъмин мекунанд. Гельҳо буфери электрофорезро талаб намекунанд ва дар камтар аз 45 дақиқа кор мекунанд. Гели агарозе, ки дорои бромиди флюорофори этидиум аст, дар байни ду пластинкаи пластикӣ мӯҳр карда шудааст ва ба ин васила дучори донишҷӯён ба ин канцерогенро кам мекунад. Илова бар ин, буфери боркунии ДНК талаб карда намешавад, ки раванди боркуниро ба эътидол меорад. Интихобан, як гели стандартии агарозие, ки аз ҷониби донишҷӯён рехта мешавад ва барои дидани ДНК ба таври мувофиқ ранг карда шудааст, метавонад истифода шавад. Пас аз электрофорез, пораҳои ДНК бо истифода аз манбаи нури ултрабунафш тасвир карда шуданд. Намунаи E-гели 1,2% дар трансиллюминатор дар расми 3 нишон дода шудааст. Дар ҳар як хат тақрибан 200 нг ДНК бор карда шудааст (баробар ба 1 мкл тайёр кардани ДНК). Ин миқдори ДНК як банди ба осонӣ намоёнро дод. Миқдори зиёди ДНК барои дидани бандҳои сершумор ё порчаҳои хурдтари ДНК (дарозии камтар аз 1,0 кб) лозим аст. ДНК-и хаттӣ бо нардбони ДНК (Sigma ё New England Biolabs) муқоиса карда шуд, то муайян кунад, ки порчаи дарозии дуруст ба даст омадааст. ДНК-и плазмиди буриданашуда намунаи бандҳои сершумори ДНК-ро медиҳад, ки ба дарозии ҳақиқии плазмид мустақиман мувофиқат намекунанд, аз сабаби суперкалинги дифференсиалии ДНК-и плазми даврашакл, ин як назорати муфид барои муайян кардани пурра бурида шудани ДНК-ҳои таҷрибавӣ буд.

Ҳафтаҳои сеюм ва чорум

Тарҳрезии ибтидоӣ -

Барои пурзУр кардани У6- пайдарпаии cDNA serpin аз плазми serpin1B(A343K), праймерҳои фармоишии PCR тарҳрезӣ шудаанд. Бо кӯмаки омӯзгорон, донишҷӯён праймерҳои PCR-ро тарҳрезӣ ва фармоиш доданд, ки ҷойҳои маҳдудкуниро ба ақсои cDNA ҷорӣ карданд. Примерҳо аз ду минтақаи ҷудогона иборат буданд: 3'-нӯги праймерҳо ба cDNA пурракунанда мебошанд ва ҳамчун қолаби васеъшавии полимераз хизмат мекунанд. Нӯги 5′-и праймерҳо ба cDNA-и серпин илова нестанд ва имкон медиҳанд, ки пайдарпаии мушаххаси ДНК ба охири маҳсулоти ПТР ворид карда шаванд (ниг. Расми 2).А).

Примери "пеш аз ҳама" барои ҷорӣ кардани як макони нави SacI дар маҳсулоти амплификацияи PCR serpin cDNA тарҳрезӣ шудааст, ки имкон медиҳад пайвастшавӣ ба сайти SacI дар вектори pGFPuv (ниг. Расми 2).Б.). Анҷоми 3'-и праймер аз минтақае иборат буд, ки ба охири 5'-и риштаи рамзгузории Ҳис6-серпин cDNA. Дар Тм Ин таъсири мутақобилаи праймер бо қолаби ДНК бояд ~60 °C ё зиёдтар бошад. Қоидаи умумӣ ин аст, ки ҷуфти иловагии G-C ба Тм тақрибан 4 °C, дар ҳоле ки як ҷуфти AT ба он мусоидат мекунад Тм тақрибан 2 ° C. Минтақаи 5'-и иловагии праймер рамзи ДНК-ро барои боқимондаи глицин дар болооби Ҳис дар бар мегирад.6 барчасп барои имкон медиҳад, ки домени GFP новобаста аз Ҳи худ ориентировка кунад6 тег ва протеини серпин. Илова кардани глицин инчунин кодони эндогении қатъии GFP-ро нест кард ва имкон дод, ки тарҷумаи пайдарпаии пурраи GFP-серпин. Ниҳоят, охири 5′-и праймер барои барқарор кардани чанд кодонҳои охирини гени GFP, илова кардани макони SacI ва фарогирии ДНК тарҳрезӣ шуда буд, то имкон диҳад, ки макони SacI дар Ҳис ҷудо шавад.6- маҳсулоти serpin PCR. Ферментҳои маҳдудкунанда аксар вақт як изофаи ДНК-ро талаб мекунанд, то макони маҳдудкунандаро ба таври муассир ҷудо кунанд [14].Маълумоти бештарро дар бораи фарогирии мувофиқи ДНК барои ферментҳои маҳдудкунандаи инфиродӣ аз New England Biolabs (Beverly, MA www.neb.com) дастрас кардан мумкин аст.

Примери "пушт" PCR, ки барои пайвастшавӣ ба 5'-охири пайдарпаии риштаи ғайрикоднашавандаи serpin cDNA тарҳрезӣ шудааст, макони EcoR1-ро ба cDNA-и серпин ҷорӣ мекунад (ниг. Расми 2).C). Охири 3'-и ин праймер аз пайдарпаии иловагии cDNA-и серпин иборат буд. Ин қисмати иловагӣ дар кодони қатъии cDNA-и серпин ба итмом мерасад. Қисми ғайримукаммали ин праймер (охири 5′) кодони иловагии таваққуфро илова кард, то қатъи тарҷумаро таъмин кунад ва сайти маҳдудкунии EcoRI-ро дар бар гирифт. Ниҳоят, охири 3'-и праймери "пушт" дорои фарогирии бисёрсоҳаи ДНК-и берун аз макони маҳдудкунии EcoRI буд.

Дар тӯли даҳсолаи охир арзиши праймерҳои олигонуклеотидҳои ДНК ба таври назаррас коҳиш ёфт ва акнун праймерҳоро метавон ба осонӣ аз ширкатҳое ба мисли Integrated DNA Technologies ё Life Technologies онлайн фармоиш дод ва дар муддати камтар аз 3 рӯз бо арзиши тақрибан ба даст меояд.

Ташаккур

Мо ба Ишан Диллон, Лейси Веркамп, Моника Силвер, Кейт Уоре, Абиҷайл Гей, Кжерсти Нокс, Лорен Филлипс ва Захари Сеймур барои шавқу рағбат, ҷидду ҷаҳд ва суботкорӣ дар давоми семестр ташаккур мегӯем. Садоқи саховатмандонаи Ӯ6-serpin cDNA аз ҷониби Майк Каност ва Хаобо Цзян хеле қадр карда шудааст. Илова бар ин, ташаккур ба Мелисса Фостер, Вилям Ҳарви, Донишкадаи тиббии Ҳовард Хьюз (HHMI) ва шӯъбаҳои биология ва химияи Коллеҷи Эрлҳам барои таъмини мавод ва таҷҳизоти дар рафти пайдарпайии лабораторӣ истифодашуда. J.A.B. мехоҳад ба HHMI ва аъзоёни Коллеҷи Эрлҳам барои фароҳам овардани таҷрибаи ҷолиби таълими баъдидокторӣ ташаккур гӯяд.

Асоси .50 / ДНК барои омодагии 100-нмол. Аз ин рӯ, праймерҳо дар як давраи лабораторӣ онлайн тарҳрезӣ ва фармоиш дода шуданд. Онҳо пеш аз вохӯрии ҳафтаинаи оянда омаданд. Примерҳои лиофилизатсияшуда бо гардиш то консентратсияи 100 мкМ дар оби биологияи молекулавӣ дубора боздошта шуданд ва баъдан тақсим карда, дар -20 °C нигоҳ дошта шуданд.

Ҳафтаи 5

Амплификатсияи пайдарпаии PCR -

Амплификацияи пайдарпаии мақсаднок тавассути PCR бо истифода аз ферментҳои термофилӣ анҷом дода шуд Пфу Turbo (Stratagene), ки нисбат ба бисёр дигар ферментҳои анъанавии PCR (масалан. Taq polymerase), кам кардани басомади хатогиҳо дар маҳсулоти пурқувват. Протоколи муфассал барои истифодаи PCR Пфу турборо аз Stratagene гирифтан мумкин аст. Барои иҷро кардани реаксия, 100 нг ДНК плазмидӣ, 100 нг ҳар як праймер, 5 мкл 10 × Пфу омехтаи буферӣ, dNTPs то консентратсияи 500 н М ҳар як, оби деионизатсияшуда то 50 мкл ва 1 мкл фермент (2,5 U) дар як найчаи тунуки девордор ПТР омехта карда шуданд. Давраи ягона аз марҳилаи денатуризатсия дар 95 °C барои 2 дақиқа, марҳилаи гармкунӣ дар 67 °C барои 30 сония ва дар ниҳоят марҳилаи васеъшавӣ дар 72 °C барои 3 дақиқа иборат буд. Ин навбат барои 25 давра такрор карда шуд. Ҳангоми тарҳрезии сикли ПТР, мулоҳизаҳои зерин бояд ба назар гирифта шаванд. Мӯҳлати тамдиди полимераз бояд на камтар аз 2 дақиқа/кб маҳсулоти PCR бошад. Ҳарорати тозакунӣ бояд аз сатҳи пасттарин 5 °C пасттар бошад Тм. Агар термоциклёр бе сарпӯши тафсон истифода шавад, бояд ба болои ҳар як реаксия 30 мкл равғани минералӣ гузошта шавад, то бухоршавии омехтаи реаксия пешгирӣ карда шавад. Азбаски вақти иҷрои PCR метавонад 3-4 соатро дар бар гирад, реаксияҳоро дар давраи лабораторӣ оғоз кардан мумкин аст ва термоциклро метавон барномарезӣ кард, ки реаксияҳоро дар 4 °C ё 10 °C шабона нигоҳ дорад. Маҳсулоти PCR пас аз он метавонад барои муддати тӯлонӣ дар -20 ° C нигоҳ дошта шавад.

Ҳафтаи 6

Маҳдудияти ҳазми маҳсулоти PCR ва вектори ген —

Мавҷудияти маҳсулоти PCR-и андозаи мувофиқ (1,2 кб) тавассути E-gel тасдиқ карда шуд (ниг. Расми 3). Консентратсияи маҳсулоти ПТР метавонад хеле фарқ кунад, аз ин рӯ ҳам миқдори нисбатан калон (5 мкл) ва ҳам миқдори ками (1 мкл) ПТР бояд ба гел бор карда шавад. Варақаи дилхоҳи PCR бояд маҳсулоти асосии дар гел намоёншаванда бошад.

Ҳангоми омодагӣ ба воридкунии самти порчаи PCR ба вектори pGFPuv, ҳам маҳсулоти PCR ва ҳам вектор бо SacI ва EcoR1 бурида шуданд. Ин ҳозима нӯгҳои иловагии "часпак"-и якқаторро ба вуҷуд меорад, ки пайвастшавии варақаро ба вектори хаттӣ осон мекунад. Маҳдудияти ҳозима бо истифода аз ду ферментҳои гуногун метавонад дар як вақт иҷро карда шавад, агар ҳарду фермент дар як буфер фаъол бошанд. Натиҷаҳои ҳазми маҳдудкунии вектор ва маҳсулоти PCR дар E-gel таҳлил карда шуданд, то боварӣ ҳосил кунанд, ки онҳо порчаҳои ДНК-и дарозии пешбинишударо доданд. Азбаски маконҳои маҳдудкунанда дар охири варақаи пурқувват ҷойгиранд, ҳаракатнокии ин маҳсулоти PCR ҳангоми ҳозима ба таври назаррас тағир намеёбад. Ба ҳамин монанд, вектори ҳазмшуда ба вектори яккабурида хеле шабоҳат дошт, зеро аз вектор танҳо як порчаи кӯтоҳи ДНК (камтар аз 100 асос) хориҷ карда шуд. Ин қадам барои таъмини он истифода шуд, ки ягон вектори буриданашуда боқӣ намонад ва дар вектор ва маҳсулоти PCR ягон ҳазми ғайричашмдошт вуҷуд надошта бошад. Пас аз ҳозима, ДНК дар -20 ° C нигоҳ дошта шуд. Хусусан нугҳои "часпанда"-и ДНК ба таназзул ҳассосанд, аз ин рӯ, ҳангоми ҳама амалҳо реагентҳои нуклеазӣ истифода мешуданд ва барои пешгирӣ кардани ифлосшавии реаксияҳо эҳтиёткор буданд. Ниҳоят, як омодагии векторе, ки танҳо бо EcoR1 ҳазм карда шудааст, барои истифода ҳамчун назорати мусбӣ дар реаксияи минбаъдаи ligation истеҳсол карда шуд.

Ҳафтаи 7

Тозакунии сутуни пораҳои калони ДНК -

Порчаҳои калони ДНК, ки тавассути ҳазмҳои маҳдудкунандаи маҳсулоти ПТР дар ҳафтаи гузашта тавлид шуда буданд, бо протоколи сутуни чарх барои тоза кардани ифлоскунандаҳо тоза карда шуданд. Порчаҳои калони ДНК ба зудӣ (дар давоми камтар аз 30 дақиқа) бо тозагии баланд бо истифода аз сутунҳои тозакунии Qiaquick PCR мувофиқи протоколи фурӯшанда (Qiagen, Valencia, CA) барқарор карда шуданд. Ин қадам барои хориҷ кардани ферментҳо, порчаҳои хурди ДНК (камтар аз 100 асос) ва ҷузъҳои буферии номатлуб истифода мешуд. Дар бисёре аз схемаҳои клонкунӣ, истифодаи сутуни тозакунии ДНК метавонад алтернативаи зудро ба усулҳои тозакунии гел таъмин кунад.

Табобати вектор бо фосфатазаи рӯдаи ишғолии гӯсола —

Пас аз маҳдудкунии ҳозима, вектор бо фосфатазаи сілтӣ дар рӯдаи гӯсола (CIAP Promega, Madison, WI) коркард карда шуд, то дар қадами баъдӣ худбастагӣ пешгирӣ карда шавад. CIAP 5' фосфатҳоро аз ДНК хориҷ мекунад. Плазмидҳои даврӣ нисбат ба ДНК-и хаттӣ хеле самараноктар табдил меёбанд ва такрор мешаванд. Дар ҳоле, ки ҳазми вектор бо ду ферментҳои гуногун бояд танҳо бастабандии векторро пешгирӣ кунад, истифодаи CIAP бастабандии ҳар як вектори яккасаро пешгирӣ мекунад ва шумораи мусбатҳои бардурӯғро дар реаксияҳои минбаъдаи ligation кам мекунад. Миқдори зиёди CIAP дар реаксияи 30-дақиқа барои муолиҷаи кофии вектори хаттӣ истифода шуд. Пас аз он вектор фавран бо истифода аз сутуни чархзании PCR (Qiagen) тоза карда шуд, то ферменти CIAP хориҷ карда шавад. Вектори тозашуда дар -20 °C то ҳафтаи оянда нигоҳ дошта шуд. Як аликвоти вектори ҳазмшуда, ки бо CIAP коркард нашудааст, барои истифода ҳамчун реаксияи назоратӣ дар марҳилаи ligation нигоҳ дошта шуд. Вектори ягонаи буридашудаи EcoRI инчунин бо CIAP ҳамчун назорат муносибат карда шуд.

Ҳафтаи 8

Лигатсионӣ ва трансформатсияи реаксия

Варақаи тозашудаи ПТР-и ҳазмшуда ва вектор (бо CIAP коркард шудааст) барои ташкили плазми нави рекомбинатии pMAJILK, ки дорои GFPuv- His мебошад, пайваст карда шуданд.6- пайдарпаии серпин (нигаред ба расми 1). Бо истифода аз маҷмӯаи бастабандии зуд (New England Biolabs), ки ба наздикӣ ҷорӣ карда шуд, вақти инкубатсияи ligation дар ҳарорати хонагӣ 5 дақиқа буд. Ин имкон дод, ки реаксия ва трансформатсия дар як давраи лабораторӣ анҷом дода шавад. Дар реаксия таносуби молярии ~ 2: 1 воридшавӣ ба вектор истифода шуд. Ҳадди ақал 200 нг вектори хаттӣ бояд истифода шавад. Дар аввал, дар сурати бемуваффақият табдил додани трансформатсия танҳо нисфи маҳсулоти ligation истифода мешуд. Ворид ва вектори истифоданашуда дар -80 °C барои кӯшишҳои минбаъдаи пайвастшавӣ нигоҳ дошта шуданд.

Трансформатсияи маҳсулоти ligation бо истифода аз омодагии баланди самарабахши ҳуҷайра бо самаранокии табдилдиҳии на камтар аз 106 трансформант дар як микрограмм ДНК плазми қобили ҳаёт анҷом дода шуд. Реаксияҳои трансформатсия дар лавҳаҳои агари LB, ки антибиотики мувофиқ доранд, ҷойгир карда шуданд. Барои пӯшонидани тамоми ҳаҷми реаксияи ligation лавҳаҳои зиёди агар бояд истифода шаванд. Барои санҷидани самаранокии ligation, намунаи вектори ифодаи буридашуда танҳо бо EcoR1 (бе CIAP) бо лигаза коркард ва бо намунаи коркарднашуда муқоиса карда шуд. Барои санҷидани реаксияи CIAP, инчунин намунаи вектори буриши EcoRI, ки бо CIAP коркард шудааст, дохил карда шуд. Ҳамчун назорати манфӣ, намунае, ки дорои вектор ва варақаи бо CIAP коркардшуда, вале ба лигаза дучор нашудааст, низ табдил дода шуд. Ниҳоят, реаксияҳои мусбат ва манфии трансформатсияи назоратӣ, ки қаблан тавсиф шуда буданд, барои санҷиши самаранокии раванди табдилдиҳӣ истифода шуданд.

Ҳафтаи 9

Таҳлили маҳдудияти маҳсулоти генӣ -

Пас аз пӯшонидани реаксияи трансформация одатан шумораи ками колонияҳо мушоҳида карда шуданд (камтар аз 50). Шумораи маҳдуди колонияҳо (~5) дар фарҳангҳои алоҳидаи 2 мл, ки дорои антибиотик мебошанд, парвариш карда шуданд ва ҷудокунии плазми ДНК аз ҳар як фарҳанг анҷом дода шуд. Тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, ин фарҳангҳо як рӯз пеш аз ҷаласаи лабораторӣ эм карда шуданд. Ҳазми маҳдудияти ташхисӣ бо истифода аз EcoRI ва SacI анҷом дода шуд, то муайян кунад, ки оё плазмидҳои ҷудошуда дорои василаи рекомбинантӣ мебошанд. Ҳазм дар -20 °C то ҳафтаи дигар нигоҳ дошта мешуд.

Ҳафтаи 10

Гели агароза аз Диҷести маҳдудияти ташхисӣ -

Ҳазми маҳдудияти ташхисӣ дар E-gel визуалӣ карда шуд (ниг. Расми 3). Ҳазми плазмидҳо бе василаи рекомбинантӣ танҳо вектори хаттӣ дода шуд. Ҳазми плазмидҳои рекомбинатии дилхоҳ аз колонияҳои рекомбинантӣ ба мушоҳидаи варақаи озодшуда (1,2 кб) оварда расонд, ки дорои6-гени серпин ва инчунин вектори хаттӣ. Бо истифода аз ин тартиб, донишҷӯёни мо пайваста васлкуниро дар ~50% доруҳои плазмидӣ мушоҳида карданд. Дар ҳоле, ки мушоҳидаи замима дар ин ҳазмҳои маҳдудияти ташхисӣ аз анҷоми бомуваффақияти раванди зерклонкунӣ шаҳодат медиҳад, плазмидҳо бо иловаҳо бояд минбаъд тавассути пайдарпай тафтиш карда шаванд.

Тарҳрезӣ ва фармоиши праймерҳои пайдарпай -

Примерҳо барои пайдарпайӣ 22-25 пойгоҳ дарозӣ доштанд ва комилан ба гени таваҷҷӯҳ илова мекарданд. Интихоби макон дар ген барои тарҳрезии праймерҳо ба якчанд омилҳо асос ёфтааст. Аввалан, фосилаи праймерҳо тақрибан ҳар 400 асос буд, то пайдарпайии пурра ва дақиқи тамоми пайдарпаии таваҷҷӯҳро фароҳам оварад. Дуюм, ҳарорати обшавӣ 55-60 °C, бо мазмуни GC 45-60% мувофиқи талаботи иншооти секвенсия буд. Сеюм, праймерҳо барои худпешбарӣ ва ҳалқаҳо бо истифода аз нармафзори Integrated DNA Technologies (www.IDTDNA.com) тафтиш карда шуданд. Ниҳоят, праймерҳо дар ~50 пойгоҳ дар боло (3′) аз оғози пайдарпаии хондан ҷойгир карда шуданд. Барои баъзе плазмидҳои маъмулан истифодашаванда, праймерҳои пайдарпайии аз ҷониби тиҷоратӣ омодашуда мавҷуданд.

Ҳафтаи 11

Пайдарпайии плазмидҳои дорои ДНК замима -

Санҷиши муҳими таҷрибаи бомуваффақияти клонкунӣ ин пайдарпайии дохилкунии ген бо қисмҳои паҳлӯи вектор мебошад. Гарчанде ки секвенсерҳои автоматӣ барои коллеҷҳои санъати гуманитарӣ умуман хеле гарон ҳастанд, пайдарпаии ДНК-ро тавассути фурӯшандагони беруна ба осонӣ ва арзон дастрас кардан мумкин аст. Ин фурӯшандагон одатан талаб мекунанд, ки ба онҳо плазми тозашуда ва праймери пайдарпай фиристода шаванд. Ин раванд маъмулан камтар аз 10-12 мкл намунаи плазми-сутуни тозашударо бо консентратсияи 150-200 нг/мкл талаб мекунад. Як реаксияи маъмулии пайдарпай тақрибан 700 асоси пайдарпайии хондашавандаро медиҳад ва вобаста ба ширкат барои як реаксия 9-13 доллар арзиш дорад. Мо Genegateway (www.genegateway.com) -ро истифода бурдем, ки барои як реаксия 9 доллар арзиш дошт ва вақти хеле кӯтоҳ (камтар аз 3 рӯз) дошт.

Ҳафтаи 12

Тафсири натиҷаҳои пайдарпайии плазмидҳо -

Ин пайдарпай аз Genegateway тавассути почтаи электронӣ дар файли фишурда интиқол дода шуд, ки ҳангоми васеъ шудан ҳам хроматограммаи пайдарпайии аслӣ ва ҳам файли пайдарпайро дод. Намунаи хроматограмма дар расми 4 нишон дода шудааст. Дар ин усули пайдарпайии автоматӣ, ҳар як пойгоҳи терминал бо рангҳои гуногуни флуоресцентӣ нишон дода шудааст [15]. Вақте ки пораҳои гуногуни ДНК тавассути матритса мегузаранд ва аз детектор мегузаранд, шиддатнокии нисбии флуоресценти мушоҳидашуда барои муайян кардани шахсияти пойгоҳи терминалии ДНК истифода мешавад. пайдарпаии автоматии хондан мумкин аст бо истифода аз як барнома ба монанди ClustalW бо пайдарпаии вектор/ген интизоршаванда мувофиқат. Дар интернет сайтҳои зиёди ClustalW мавҷуданд, ба монанди pir.georgetown.edu/pirwww/search/multaln.html. Тафовут байни пайдарпаии ДНК-и интизоршуда ва гирифташуда бояд минбаъд тафтиш карда шавад. Азбаски дар хондани автоматии асосҳо хатогиҳо ҷой дошта метавонанд, ба донишҷӯён тавсия дода мешавад, ки хроматограммаро таҳрир кунанд, ки дар он ҷо ихтилофҳо рух медиҳанд, то боварӣ ҳосил кунанд, ки пайдарпаии хондашуда бо хроматограмма дуруст мувофиқат мекунад. Диққати махсус бояд ба минтақаҳои праймерҳо дода шавад, зеро хатогӣ дар синтези праймер метавонад ба мутатсияҳои ғайричашмдошт оварда расонад ва ин корро дар яке аз клонҳои интихобшудаи мо анҷом дод.


Шартҳои асосӣ

  • реаксияи занҷири полимераз: Усул дар биологияи молекулавӣ барои эҷоди нусхаҳои сершумори ДНК аз намунае, ки дар изи ангуштони генетикӣ ва ғайра истифода мешавад.
  • клонкунии молекулавӣ: маҷмӯи усулҳои таҷрибавӣ дар биологияи молекулавӣ, ки барои ҷамъ овардани молекулаҳои рекомбинатии ДНК ва роҳнамоии такрории онҳо дар дохили организмҳои мизбон истифода мешаванд.
  • ферментҳои маҳдудкунанда: Эндонуклеаза, ки ҷудошавии дуқатораи ДНК-ро бо пайдарпаии мушаххас катализ мекунад.

Технологияи рекомбинантии ДНК, ки инчунин клонкунии молекулавӣ номида мешавад, ба реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) монанд аст, зеро он ба такрори пайдарпаии мушаххаси ДНК имкон медиҳад. Фарқи асосии байни ин ду усул дар он аст, ки клонизатсияи молекулавӣ такрори ДНК-ро дар микроорганизми зинда дар бар мегирад, дар ҳоле ки PCR ДНК-ро дар як микроорганизм такрор мекунад. in vitro маҳлул, ки аз ҳуҷайраҳои зинда озод аст.

Дар таҷрибаҳои стандартии клонкунии молекулавӣ, клонкунии ҳар як порчаи ДНК аслан ҳафт марҳиларо дар бар мегирад:

  1. Интихоби организми мизбон ва вектори клонкунӣ
  2. Тайёр кардани ДНК-и векторӣ
  3. Омода кардани ДНК барои клон кардан
  4. Эҷоди ДНК-и рекомбинантӣ
  5. Ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба организми мизбон
  6. Интихоби организмҳои дорои ДНК-и рекомбинантӣ
  7. Скрининг барои клонҳо бо иловаҳои дилхоҳи ДНК ва хосиятҳои биологӣ

Гарчанде ки шумораи хеле зиёди организмҳои мизбон ва векторҳои клонкунии молекулавӣ истифода мешаванд, аксарияти таҷрибаҳои клонкунии молекулавӣ аз штамми лаборатории бактерия оғоз мешаванд. E. coli (Escherichia coli) ва вектори клонкунии плазмид. E. coli ва векторҳои плазмидӣ дар истифодаи умумӣ мебошанд, зеро онҳо аз ҷиҳати техникӣ мураккаб, гуногунҷабҳа, дастрас мебошанд ва афзоиши босуръати организмҳои рекомбинантиро бо таҷҳизоти ҳадди аққал пешниҳод мекунанд. Вектори клонкунӣ бо эндонуклеазаи маҳдудкунанда коркард карда мешавад, то ДНК-ро дар маконе, ки ДНК-и хориҷӣ ворид карда мешавад, ҷудо кунад. Ферментҳои маҳдудкунанда барои тавлиди конфигуратсия дар макони кандашавӣ интихоб карда мешавад, ки бо он дар нугҳои ДНК хориҷӣ мувофиқ бошад.

Одатан, ин бо роҳи ҷудо кардани ДНК-и векторӣ ва ДНК-и хориҷӣ бо як ферментҳои маҳдудкунанда анҷом дода мешавад, масалан EcoRI. Аксари векторҳои муосир дорои ҷойҳои гуногуни ҷудошавии қулай мебошанд, ки дар дохили молекулаи вектор беҳамтоанд (то ин ки векторро танҳо дар як макон ҷудо кардан мумкин аст) ва дар дохили ген ҷойгир аст (аксар вақт бета-галактозидаза), ки ғайрифаъолиятии онҳоро барои фарқ кардани он истифода бурдан мумкин аст. рекомбинант аз организмҳои ғайрирекомбинантӣ дар марҳилаи баъдӣ дар раванд. Барои беҳтар кардани таносуби организмҳои рекомбинант ба рекомбинантӣ, вектори ҷудошударо метавон бо фермент (фосфатазаи сілтӣ) коркард кард, ки нӯги векторро дефосфорил мекунад. Молекулаҳои векторӣ бо нӯги дефосфорилшуда наметавонанд такрор шаванд ва репликатсияро танҳо дар сурати ворид шудани ДНК-и хориҷӣ ба макони ҷудошуда барқарор кардан мумкин аст.

Барои клон кардани ДНК-и геномӣ, ДНК-и клоншаванда аз организми мавриди таваҷҷӯҳ истихроҷ карда мешавад. Усулҳои реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR) аксар вақт барои тақвият додани пайдарпаии мушаххаси ДНК ё РНК (RT-PCR) пеш аз клонкунии молекулавӣ истифода мешаванд. Пас аз он ДНК-и тозашуда бо ферментҳои маҳдудкунанда коркард карда мешавад, то порчаҳоеро ба вуҷуд оранд, ки нӯгҳояш метавонанд бо нуқоти вектор пайваст шаванд. Дар ҳолати зарурӣ, барои эҷоди сохторҳои ниҳоӣ, ки бо вектор мувофиқанд, сегментҳои кӯтоҳи дуқабараи ДНК (пайвандҳо), ки сайтҳои маҳдудкунандаи дилхоҳ доранд, метавонанд илова карда шаванд. Эҷоди ДНК-и рекомбинантӣ аз бисёр ҷиҳат соддатарин қадами раванди клонкунии молекулавӣ мебошад. ДНК-и аз вектор ва манбаи хориҷӣ омодашуда ба таври оддӣ дар консентратсияи мувофиқ омехта карда мешаванд ва ба фермент (лигазаи ДНК), ки нӯгҳоро ба таври ковалентӣ мепайвандад, дучор мешаванд. Ин реаксияи ҳамроҳшавӣ аксар вақт ligation номида мешавад. Омехтаи ДНК, ки дар он нӯгҳои ба таври тасодуфӣ пайвастшуда мавҷуд аст, пас барои ворид шудан ба организми мизбон омода аст. Омехтаи ДНК, ки қаблан коркард шуда буд in vitro, дубора ба ҳуҷайраи зинда интиқол дода мешавад, ки онро организми мизбон меноманд. Усулҳое, ки барои ба даст овардани ДНК ба ҳуҷайраҳо истифода мешаванд, гуногунанд ва номе, ки ба ин марҳила дар раванди клонкунии молекулавӣ истифода мешавад, аксар вақт аз усули таҷрибавии интихобшуда вобаста аст (масалан, трансформатсия, трансдуксия, трансфекция, электропоратсия).

Вақте ки микроорганизмҳо қодиранд, ки ДНК-ро аз муҳити маҳаллии худ гиранд ва такрор кунанд, ин раванд трансформатсия номида мешавад ва ҳуҷайраҳое, ки дар ҳолати физиологӣ ҳастанд, ки метавонанд ДНК-ро гиранд, салоҳиятнок мебошанд. Вақте ки ҳуҷайраҳои бактериявӣ ҳамчун организмҳои мизбон истифода мешаванд, аломати интихобшаванда одатан генест, ки ба антибиотик муқовимат мекунад, ки дар акси ҳол ҳуҷайраҳоро, маъмулан ампициллинро мекушад. Ҳуҷайраҳое, ки векторро дар бар мегиранд, ҳангоми дучор шудан ба антибиотик зинда мемонанд, дар ҳоле ки онҳое, ки пайдарпайии векториро қабул накардаанд, мемиранд. Векторҳои клонкунии бактерияҳои муосир (масалан, pUC19) системаи скрининги кабуд-сафедро барои фарқ кардани колонияҳои (клонҳо) ҳуҷайраҳои трансгенӣ аз онҳое, ки вектори волидайн доранд, истифода мебаранд.

Дар ин векторҳо, ДНК-и хориҷӣ ба пайдарпай ворид карда мешавад, ки қисми муҳими бета-галактозидаза, ферментро рамзгузорӣ мекунад, ки фаъолияти он боиси ташаккули колонияи кабуд дар муҳити фарҳангӣ мегардад, ки барои ин кор истифода мешавад.Дохил кардани ДНК-и хориҷӣ ба пайдарпаии рамзгузории бета-галактозидаза вазифаи ферментро ғайрифаъол мекунад, то колонияҳое, ки плазмидҳои рекомбинантӣ доранд, рангин (сафед) боқӣ мемонанд. Аз ин рӯ, клонҳои рекомбинантӣ ба осонӣ муайян карда мешаванд.

Расм: Экрани кабуди сафед: Экрани кабуд-сафед як усули скринингест, ки имкон медиҳад, ки лигатҳои бомуваффақият дар клонкунии генҳои векторӣ муайян карда шавад. ДНК -и мавриди таваҷҷӯҳ ба вектор пайваст карда мешавад. Пас аз он вектор ба ҳуҷайраи салоҳиятдор (бактерияҳо) табдил меёбад. Ҳуҷайраҳои салоҳиятдор дар ҳузури X-gal парвариш карда мешаванд. Агар ligation муваффақ бошад, колонияи бактериявӣ сафед хоҳад буд, агар не, колония кабуд хоҳад буд. Ин техника имкон медиҳад, ки ligation бомуваффақият зуд ва осон муайян карда шавад.


Вектори клонкунӣ як молекулаи хурди ДНК мебошад, ки порчаи ДНК-и хориҷиро ба ҳуҷайраи мизбон интиқол медиҳад, дар ҳоле ки вектори экспрессия як намуди векторест, ки воридшавӣ, ифодаи генҳо ва истеҳсоли сафедаҳоро осон мекунад. Ҳамин тавр, ин фарқи калидӣ байни вектори клонкунӣ ва вектори ифода аст. Ғайр аз он, фарқияти дигари назаррас байни вектори клонкунӣ ва вектори экспрессия дар он аст, ки вектори клонкунӣ як порчаи ДНК-и хориҷиро ба ҳост ворид мекунад, дар ҳоле ки векторҳои экспрессия гени воридшударо тавассути тавлиди сафедаи мувофиқ ифода мекунанд.

Ғайр аз он, вектори клонкунӣ аз пайдоиши такрорӣ, сайтҳои маҳдудкунӣ ва аломати интихобшаванда иборат аст. Дар ҳоле ки вектори ифода дорои тақвиятдиҳандаҳо, минтақаи промоутер, кодони хотимавӣ, пайдарпаии оғози транскрипсия, пайдоиши такрорӣ, сайтҳои маҳдудкунӣ ва аломати интихобшаванда мебошад. Аз ин рӯ, ин инчунин фарқияти байни вектори клонкунӣ ва вектори ифода аст. Ғайр аз он, плазмидаҳо, бактериофагҳо, хромосомаҳои сунъии бактериявӣ, космидҳо, хромосомаҳои сунъии ширхӯрон, хромосомаи сунъии хамиртуруш ва ғайра мисоли векторҳои клонкунӣ мебошанд. Дар ҳамин ҳол, векторҳои ифода асосан плазмидҳо мебошанд.


Клон кардани гени рамзгузорӣ ба вектори ғайрифаъол - Биология

Қисмҳои BioBrick пайдарпаии ДНК мебошанд, ки ба стандарти мушаххаси васлкунии ферментҳои маҳдудкунанда риоя мекунанд. Стандартҳои мушаххас барои тартиб додан ва нигоҳ доштани феҳристи қисмҳои BioBrick ва инчунин усулҳои васлкунӣ мавҷуданд, ки барои сохтани ин қисмҳо ба дастгоҳҳо ва системаҳо барои тавлиди сафедаи дилхоҳ дар микроорганизмҳои моделӣ истифода мешаванд. BioBricks-ро метавон ҳамчун блокҳои сохтмонӣ ё лего баррасӣ кард, ки онҳоро бо роҳҳои гуногун барои ҷамъ кардани схемаҳои калонтари биологии синтетикӣ, ки дар якҷоягӣ вазифаи беназир доранд, якҷоя кардан мумкин аст. Баъдан ин схемаҳои биологӣ метавонанд ба ҳуҷайраҳои зинда дохил карда шаванд, масалан E.Coli, сохтани системахои нави биологй ва ичрои вазифахои муайяншуда. Намунаҳои қисмҳои BioBrick иборатанд аз пайдарпаии рамзгузорӣ, промоутерҳо, сайтҳои ҳатмии рибосомӣ ва терминаторҳо.
Стандарти BioBricks стандарти ампирикӣ ва универсалӣ барои муайян кардани пайдарпайии кислотаҳои нуклеини қисмҳо мебошад ва тавсиф мекунад, ки чӣ гуна онҳоро бо пайдарпаии қисмҳои дигар дар дохили векторҳои клонкунӣ муттаҳид кардан мумкин аст. Ин имкон медиҳад, ки қисмҳои BioBrick стандартизатсия карда шаванд. Стандартҳои мухталифе, ки барои муайян кардани қисмҳои BioBrick истифода мешаванд, дар саҳифаи "Стандартҳои васлкунӣ барои BioBricks" тавсиф шудаанд. Ҷамъоварии BioBrick ба усулҳо ва тартиботе, ки барои тартиб додани пайдарпаии қисмҳо истифода мешаванд, дахл дорад, ки дар амиқтар дар саҳифаи "Усулҳои васлкунӣ барои BioBricks" тавсиф шудааст.
BioBricks барои бисёр соҳаҳои гуногун, ки стратегияҳои клонкуниро барои истеҳсоли маҳсулот ба монанди доруҳои табобатӣ ё ферментҳои дар ғизо истифодашаванда истифода мебаранд, бениҳоят муфид аст. Ба ин соҳаҳо дорусозӣ, коркарди хӯрокворӣ, сӯзишвории биологӣ ва ғайра дохил мешаванд. Бисёре аз ин соҳаҳо аз асбобҳои биологияи синтетикӣ, ба монанди BioBricks, барои муҳандисии организмҳо барои истеҳсоли бисёре аз маҳсулоти худ истифода мебаранд. Биологияи синтетикиро метавон ҳамчун A) васл кардани қисмҳо, дастгоҳҳо ва системаҳои нави биологӣ ё B) аз нав конфигуратсияи системаҳои мавҷудаи табиии биологӣ барои мақсадҳои муфид муайян кард. BioBricks тарҳрезӣ ва ҷамъ кардани роҳҳои биологиро, ки барои организмҳои тарроҳишуда барои иҷрои вазифаҳои нав заруранд, осонтар мекунад.

Ин видео муқаддима ба биологияи синтетикиро медиҳад

Махзани маълумотҳои қисмҳои BioBrick метавонад дар феҳристи қисмҳои стандартии биологӣ пайдо шавад, ки барои муҳаққиқон мубодилаи қисмҳо ва ҳамкорӣ осонтар мешавад. Қисми биологӣ ҳамчун пайдарпаии мушаххаси кислотаҳои нуклеинӣ муайян карда мешавад, ки хусусияти муайяншавандаи биологиро рамзгузорӣ мекунад. Феҳрист зиёда аз 20,000 қисмҳои BioBrick-ро дар бар мегирад, ки аз рӯи функсияҳои биологии худ ба каталог ва гурӯҳбандӣ шудаанд. Ҳар як вурудоти каталог функсия, иҷро ва тарҳрезии қисмро тавсиф мекунад. Ҳар як қисми BioBrick инчунин бо рамзи ягонаи мушаххас меояд. Феҳристро муҳаққиқони MIT, Ҳарвард ва UCSF таҳия кардаанд. Ҳар сол иштирокчиёни озмуни iGEM ва лабораторияҳои академӣ ба феҳрист саҳм мегузоранд, бинобар ин, феҳрист бо мурури замон ба таври назаррас афзоиш меёбад.

Феҳристи қисмҳои биологии стандартиро дар ин ҷо пайдо кардан мумкин аст!

Навоварии калидии стандарти васлкунии BioBrick дар он аст, ки муҳандис метавонад ба ҳар ду қисмати BioBrick ҳамроҳ шавад ва шакли минбаъдаи якҷоя низ як қисми BioBrick мебошад, ки онро бо ҳама қисмҳои дигари BioBrick пайваст кардан мумкин аст. Стандартизатсияи BioBricks имкон медиҳад, ки коллексияи қисмҳои биологӣ тақсим карда шавад. Муҳандисон дар қисматҳои гуногуни ҷаҳон метавонанд қисмҳоеро тарҳрезӣ кунанд, ки ба ассамблеяи стандартизатсия мувофиқанд ва ин ду қисм метавонанд ба як стандарт мувофиқат кунанд. Ғайр аз он, муҳандисон ҳамон як раванди дақиқро ҳангоми муттаҳид кардани ду қисмати BioBrick иҷро мекунанд, аз ин рӯ раванди васлкунӣ барои оптимизатсия ва автоматизатсия кушода аст, дар муқоиса бо равишҳои анъанавии клонкунии молекулавӣ барои шона кардани пайдарпаии генетикӣ. На танҳо метавонад феҳристро ҳар як пажӯҳишгар ё муҳандиси рӯи сайёра барои муайян кардани кадом қисмҳои биологӣ барои мусоидат ба раванди муайяни истеҳсолот истифода барад, балки ин олимон инчунин метавонанд кашфиётҳои худро дар феҳрист пас аз тасдиқи онҳое, ки онро нигоҳ медоранд, саҳм гузоранд. базаи маълумот. Ин хидмат мекунад, ки BioBricks ҳамчун як абзори хеле гуногунҷабҳа ва гуногунҷабҳа дар ҳолати муттасили фарогиртар шавад ва онро ба яке аз захираҳои муфидтарин барои биологҳои синтетикӣ дар саросари ҷаҳон табдил медиҳад.


Shoemaker, S., Schweickart, V., Ladner, M., Gelfand, D., Kwok, S., Myambo, K. and Innis, M. 1983. Клонизатсияи молекулавии экзо-целлобиогидролаза ман аз Trichoderma reesei штамми L27. Био/технология 1: 691–696.

Чен, М.С., Гритзали, М. ва Стаффорд, В.Д. 1987. пайдарпаии нуклеотидҳо ва сохтори ибтидоии cellobiohydrolase II аз Trichoderma reesei. Био/технология 5: 274–278.

Teeri, T.T., Lehtovaara, P., Kauppinen, S., Salovuori, I. and Knowles, J. 1987. Доменҳои гомологӣ дар Trichoderma reesei Ферментҳои целлюлолитикӣ: пайдарпаии ген ва экспрессияи целлобиогидролаза II. Ген 51: 43–52.

Penttila, M., Lehtovaara, P., Nevalainen, H., Bhikhabhai, R. and Knowles, J.K.C. 1986. Гомология байни генҳои селлюлази Trichoderma reesei: пайдарпаии пурраи нуклеотидҳои гени эндоглюконаза I. Ген 45: 253–263.

Saloheimo, M., Lehtovaara, P., Penttila, M., Teeri, T.T., Stahlberg, J., Pettersson, G., Claeyssens, M., Tomme, P. and Knowles, J.K.C. 1988. EGIII, як endoglucanase нав Аз Trichoderma reesei: тавсифи ҳам ген ва ҳам фермент. Ген 63: 11–21.

Энари, Т.М., Нику-Паавола, М.Л., Харжу, Л., Лаппалайнен, А. ва Нумми, М. 1981. Поксозии Trichoderma reesei ва Aspergillus niger β-глюкозидаза. J. Appl. биохимия. 3: 157–163.

Umile, C. ва Kubicek, C.P. 1986. β-глюкозидаза бо мембранаи плазмаи конститутсионӣ дар Trichoderma reesei. FEMS Microbiol. Леттс. 34: 291–295.

Ҷексон, М.А. ва Талбурт, Д.Э. 1988. Тозакунӣ ва қисман тавсифи β-глюкозидазаҳои берун аз ҳуҷайра Trichoderma reesei истифодаи катодӣ, электрофорези гели полиакриламидӣ. Биотехнология. Bioeng. 32: 903–909.

Хофер, Ф., Вайссингер, Э., Мисчак, Х., Месснер, Р., Мейкснер-Монори, Б., Блас, Д., Виссер, Ю ва Кубичек, Ч.П. 1989. Антиденои моноклоналӣ бар зидди β-глюкозидазаи сілтӣ берун аз ҳуҷайра аз Trichoderma reesei: реактивӣ бо дигарон Триходерма β-глюкозидазаҳо. Биохим. Биофиз. Акта. 992: 298–306.

Месснер, Р. ва Кубичек, C.P. 1990. Далелҳо барои як, мушаххас β-глюкозидаза дар деворҳои ҳуҷайра аз Trichoderma reesei QM9414. Ферментҳои микроб. Технология. 12: 685–690.

Инглин, М., Файнберг, Б.А. ва Loewenberg, J.R. 1980. Қисман поксозӣ ва тавсифи як β-глюкозидазаи нави intraccllular аз Trichoderma reesei. биохимия. Ҷ. 185: 515–519.

Кубичек, C.P. 1981. Баровардани карбоксиметил-целлюлаза ва β-глюкозидаза аз деворҳои ҳуҷайраҳои Trichoderma reesei. Ёвро. J. Appl. Биотехнология. 13: 226–231.

Месснер, Р., Хагспиэл, К. ва Кубичек, Ч.П. 1990. Ҷудокунии полисахариди β-глюкозидаза ва фаъолкунанда аз деворҳои ҳуҷайра Trichoderma reesei. Арк. Микробиол. 154: 150–155.

Штернберг, Д., Вижаякумар, П. ва Риз, Э.Т. 1977. β-глюкозидаза: истеҳсоли микробҳо ва таъсир ба гидролизи ферментативии селлюлоза. Метавонед. J. Microbiol. 23: 139–147.

Кадам, С. ва Demain, A.L. 1989. Иловаи β-глюкозидазаи клононидашуда таназзули селлюлозаи кристалиро тавассути Clostridium thermocellum комплекси целлюлоза. биохимия. Биофиз. Рес. Комм. 161: 706–711.

Ковамори, М., Адо, Ю. ва Такасава, С. 1986. Тайёр ва татбиқи Trichoderma reesei мутантҳо бо такмилёфтаи β-глюкозидаза. агр. Биол. Химия. 50: 2477–2482.

Манделс, М., Парриш, Ф.В. ва Риз, Э.Т. 1962. Софороза хамчун индуктори целлюлаза дар Триходерма вирид. J. Бактериол. 83: 400–408.

Perlman, E. and Halvorson, H. 1983. Як макони шинохтани сигнали пептидаза ва пайдарпаӣ дар пептидҳои сигнали эукариотӣ ва прокариотӣ. J. Мол. Био. 167: 391–409.

Von Heijne, G. 1984. Чӣ тавр пайдарпаии сигнал хусусияти ҷудошавиро нигоҳ медорад. J. Мол. Биол. 173: 243–251.

Von Heijne, G. 1986. Усули нав барои пешгӯии ҷойҳои ҷудошавии пайдарпаии сигнал. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 14: 4683–4690.

Gavel, Y. ва Heijne Von, G. 1990. Тафовутҳои пайдарпай байни сайтҳои аксептори гликозилшуда ва ғайримоддии Asn-X-Thr/Ser: оқибатҳо барои муҳандисии протеин. Муҳандиси протеин 3: 433–442.

Гурр, С.Ҷ., Унклес, С.Э. ва Кингхорн, Ҷ.Р., 1987. Сохтор ва ташкили генҳои ядроии занбӯруғҳои филаментӣ, саҳ. 93–139. Дар: Сохтори ген дар микробҳои эукариотӣ. Кингхорн, Ҷ.Р. (ред.). IRL Press, Бока Ратон, Флорида.

Смит, Ҷ.Л., Бейлис, Ф.Т. ва Уорд, M. 1991. пайдарпаии cloned пир4 гени Trichoderma reesei ва истифодаи он ҳамчун аломати интихобшавандаи гомологӣ барои трансформатсия. Кур. Генет. 19: 27–33.

Chirico, W.J. and Brown, R.D. Jr. 1987. Тозакунӣ ва тавсифи β-глюкозидаза аз Trichoderma reesei. Ёвро. J. Биохимия. 165: 333–341.

Bause, E. and Legler, G. 1980. Изолятсия ва сохтори гликопептиди триптӣ аз макони фаъоли β-глюкозидаза A3 аз Aspergillus goii. Биохим. Биофиз. Акта. 626: 459–465.

Пейс, М.Г. ва Jurasek, L. 1979. Муқоисаи сохторӣ ва механикии баъзе гидролазаҳои β-l,4-гликозид. Adv. Химия. Сер. 181: 361–374.

Кларк, A.J. 1990. Тағйироти кимиёвии як β-глюкозидаза аз Schizophyllum коммуна: далелҳо барои гурӯҳҳои муҳими карбоксил. Биохим. Биофиз. Акта. 1040: 145–152.

Боел, Э., Ҳёрт, И., Свенссон, Б., Норрис, К.Э. ва Fiil, N.P. 1984. Глюкоамилазаҳои G1 ва G2 аз Aspergillus niger аз ду mRNA-и гуногун, вале ба ҳам наздик синтез карда мешаванд. EMBO. Ҷ. 3: 1097–1102.

Boel, E., Hansen, M.T., Hjort, I., Hoegh, I. and Fiil, N.P. 1984. Ду намуди гуногуни пайдарпайии интервенсия дар гени глюкоамилаза аз Aspergillus niger. EMBO. Ҷ. 3: 1581–1585.

Финклштейн, Д.Б., Рамбосек, Ҷ., Кроуфорд, М.С., Солидей, К.Л., МакАда, П.С. ва Лич, Ҷ. 1989. Секрецияи сафеда дар Aspergillus niger, саҳ. 259–300. Дар: Генетика ва биологияи молекулавии микроорганизмҳои саноатӣ Квинер, С. В. ва Гегеман, Г. (Эд.). Нашрияҳои ASM, Вашингтон, D.C.

Шейр-Нейс, Г. ва Монтенекур, Б. 1984. Характеристикаи селлюлазахои махфии Trichoderma reesei мутантҳои навъи ваҳшӣ ҳангоми ферментатсияҳои назоратшаванда. Appl. Микробиол. Биотехнология. 20: 46–53.

Грицали, М. 1977. Биосинтез ва идентификацияи ферментҳои системаи целлюлазаи Trichoderma reesei. Рисолаи магистрӣ. Донишкадаи политехникии Вирҷиния ва Донишгоҳи давлатӣ.

Манделс, М. ва Вебер, Ҷ. 1969. Истеҳсоли селлюлазаҳо. Adv. Химия. Сер. 95: 391–413.

Мессинг, Х., Креа, Р. ва Зеебург, П.Х. 1981. Системаи барои пайдарпаии ДНК shotgun. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 9: 309–321.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J. 1985. Такмили векторҳои клонкунии генҳои фаги M 13 ва штаммҳои мизбон: пайдарпаии нуклеотидҳои векторҳои M 13mpl8 ва pUC19. Ген 33: 103–119.

Корман, Д.Р., Бейлис, Ф.Т., Барнетт, С.С., Кармона, К.Л., Кодама, К.Х., Ройер, Т.Ж., Томпсон, С.А., Уорд, М., Вилсон, Л.Ж. ва Берка, Р.М. 1990. Клонизатсия, тавсиф ва ифодаи ду гени алфа-амилаза аз Aspergillus niger var. авамори. Курр. Генет. 17: 203–221.

Тимберлейк, В.Э. ва Барнард, EC 1981. Ташкили кластери генҳо, ки махсусан дар қаламчаҳои асексуалии A. nidulans. Ҳуҷайра 26: 29–37.

Самбрук, Ҷ., Фрич, Э.Ф. ва Маниатис, Т. 1989. Клонкунии молекулавӣ. Дастури лабораторӣ, нашри дуюм. Лабораторияи Харбор Сард, Харбор, Н.

Томас, P.S. 1980. Гибридизатсияи РНК-и денатуратшуда ва пораҳои хурди ДНК, ки ба нитроцеллюлоза интиқол дода шудаанд. Прок. Нат. Акад. Илм. ИМА 77: 5201–5205.

Сэнгер, Ф., Никлен, С. ва Кулсон, А.Р. 1977. пайдарпаии ДНК бо ингибиторҳои қатъкунандаи занҷир. Прок. Натл. Акад. Илм. ИМА 74: 5463–5467.

Охмия, К., Такано, М. ва Шимизу, С. 1990. пайдарпаии ДНК-и β-глюкозидаза аз Ruminoccocus albus. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 18: 671.

Райнал, А., Гербо, С., Франсинг, М. ва Геринё, М. 1987. Пайдарҳамӣ ва транскрипсияи гени β-глюкозидаза Kluyveromyces fragalis клон карда шудааст Saccharomyces cerevisiae. Курр. Генет. 12: 175–184.

Kohchi, C. and Toh-e, A. 1985. пайдарпаии нуклеотидҳои Candida pelliculosa Ген β-глюкозидаза. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 13: 6273–6282.

Мачида, М., Охтсуки, И., Фукуи, С. ва Ямашита, I. 1988. пайдарпаии нуклеотидҳои Saccharomycopsis fibuligera генҳо барои β-глюкозидазаҳои берун аз ҳуҷайра, тавре ки дар Saccharomyces cerevisiae. Барнома. Env. Микро. 54: 3147–3155.


7 Қадамҳои асосӣ дар клонкунии генҳо

Нуқтаҳои зерин ҳафт қадами асосиро дар клонкунии генҳо таъкид мекунанд. Баъзе аз қадамҳо инҳоянд: 1. Ҷудо кардани порчаҳои ДНК (гени ҷолиб), ки клон карда мешаванд 2. Ворид кардани ДНК-и ҷудошуда ба вектори мувофиқ барои ташаккули ДНК-и рекомби ва шинант 3. Ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба организми мувофиқ бо номи мизбон ва дигар қадамҳо низ.

Қадами клонкунии ген №1.

Ҷудокунии ДНК (Генҳои Inter­est) Фрагментҳои клон кардашаванда:

Пеш аз он ки мо амалиёти клон ва шармгинии генро анҷом диҳем, ба мо ду чизи асосӣ дар ҳолати тозашудаи онҳо лозим аст, – гени таваҷҷӯҳи мо (GI) ва вектор. GI як порчаи генест, ки ҳосили он (сафеда, фермент ё гормон) ба мо таваҷҷӯҳ дорад. Масалан, рамзгузории ген барои инсулин гормон.

Ба ҳамин монанд, вектор як молекулаи интиқолдиҳанда аст, ки метавонад GI-и моро ба ҳост интиқол диҳад ва дар он ҷо дар якҷоягӣ бо GI нусхаҳои сершумори онро такрор кунад. Дар ин ҳолат GI инчунин метавонад дар ҳуҷайраи мизбоне ифода карда шавад, ки маҳсулоти генеро, ки ба мо лозим аст, тавлид мекунад.

Қадами клонкунии ген № 2.

Ворид кардани ДНК-и ҷудошуда ба вектори мувофиқ барои ташаккули ДНК-и рекомбинантӣ:

Вақте ки компонентҳо омодаанд, мо метавонем амалиётро оғоз кунем. Қадами навбатии мо буридани ҳам векторҳо ва ҳам GI бо истифода аз як намуди махсуси фермент, ки эндонуклеазаи маҳдуд номида мешавад, хоҳад буд. Эндонуклеазаи маҳдудкунанда як ферментест, ки ДНК-и дуқатор ё якқаторро дар нуклеотидҳои шинохти мушаххас, ки бо номи маконҳои маҳдудкунанда ба минтақаи дарунӣ маълуманд, буридааст (аз ин рӯ эндонуклеаза).

Онҳо инчунин ҳамчун кайчи молекулавӣ ҳисобида мешаванд, зеро онҳо риштаҳои ДНК-ро мекушоянд. Пас аз ин қадами буридан мо ба часпондан мегузарем. Дар ин ҷо GI гирифта мешавад ва ба вектори бурида часпонида мешавад. Ин раванд инчунин ба фермент ниёз дорад, ки лигаза ДНК номида мешавад. Онҳо инчунин ҳамчун ширеши молекулавӣ ҳисобида мешаванд.

Дар натиҷа ва шармгини молекулаи ДНК гибриди ду молекулаи ДНК – GI мо ва вектор аст. Дар тер&шиминологияи генетика ин омехташавии риштахои гуногун ва шармгини ДНК-ро рекомбинатсия меноманд (ки табиатан дар профазаи 1-уми мейоз 1 ба амал меояд). Аз ин рӯ, ин молекулаи нави гибридии ДНК инчунин молекулаи рекомбинатии ДНК номида мешавад ва ин технология технологияи реком ва shybinant DNA (RDT) номида мешавад.

Қадами клонкунии ген № 3.

Ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба организми мувофиқ бо номи мизбон:

Вақте ки молекулаи рекомбинатии ДНК мо омода аст, мо бояд онро ба системаи зинда, ки ҳамчун мизбон маълум аст, ҷорӣ кунем.

Ин барои як ё ду сабабҳои зерин анҷом дода мешавад:

(а) Барои нусхабардории ДНК-и рекомбинантӣ мол&шиекула барои ба даст овардани нусхаҳои сершумори GI мо.

(б) Барои он ки GI мо экспресс шавад ва сафедаеро, ки ба мо лозим аст, тавлид кунад.

Ворид кардани ДНК-и рекомбинантӣ ба ҳуҷайраи мизбон бо роҳҳои гуногун анҷом дода мешавад ва ба таври қатъӣ аз андозаи молекулаи ДНК ва табиати GI вобаста аст. Баъзе аз усулҳое, ки барои анҷом додани ин қадам дар электропоратсия, микро-инъекция, липофекция ва ғайра истифода мешаванд.

Вақте ки мо ин равандро иҷро мекунем, баъзе аз ҳуҷайраҳои мизбон ДНК-и аз нав ва шабеҳро мегиранд ва баъзеҳо не. Ҳуҷайраҳои мизбоне, ки ДНК-и рекомбинатиро гирифтаанд, ҳуҷайраҳои табдилёфта номида мешаванд ва прошадсис трансформация номида мешаванд.

Қадами клонкунии ген № 4.

Интихоби ҳуҷайраҳои табдилшудаи ҳост ва муайян кардани клони кон ва дорои гени таваҷҷӯҳ:

Раванди трансформатсия як популяцияи омехтаи ҳуҷайраҳои мизбони табдилшуда ва табдилнашуда тавлид мекунад. Азбаски мо танҳо ба ҳуҷайраҳои мизбони табдилшуда таваҷҷӯҳ дорем, зарур аст, ки онҳоро филтр кунем. Ин маҳз дар раванди интихоб анҷом дода мешавад. Бисёр стратегияҳои собиқ ва шармгини интихоб мавҷуданд, ки баъзеи онҳо бо гирифтани кӯмаки генҳои хабарнигор, техникаи гибридизатсияи колонияҳо ва ғ.

Қадами клонкунии ген № 5.

Зарб / ифодаи гени воридшуда дар ҳост:

Вақте ки мо ҳуҷайраҳои табдилшудаи худро тавассути раванди скрининг тоза кардем, ҳоло вазифаи мо ин аст, ки ба онҳо параметрҳои оптималии афзоиш ва афзоишро таъмин кунем. Дар ин марҳила ҳуҷайраҳои табдилёфта ба васоити фарҳангии тару тоза ворид карда мешаванд, ки онҳо ба онҳо ғизои фаровон медиҳанд ва пас аз инкубатсия дар танӯр дар ҳарорати мувофиқ.

Дар ин марҳила ҳуҷайраҳои мизбон бо репликатсияи ДНК-и реком ва шибинантӣ, ки тавассути онҳо интиқол дода мешаванд, тақсим ва дубора тақсим мешаванд. Ҳоло дар ин лаҳза мо ду интихоб дорем.

Вақте ки ҳадафи раванди клонсозӣ ва шармоварӣ тавлиди китобхонаи генӣ аст, пас ҳадафи мо ба даст овардани нусхаҳои сершумори GI хоҳад буд. Ҳамин тавр, бо ин нақша дар зеҳни худ мо танҳо ба такрори ДНК-и рекомби ва шинантӣ меравем, на аз он.

Агар ҳадафи таҷрибаи клонкунӣ ба даст овардани маҳсулоти GI бошад, пас мо як қадам пеш меравем, ки мо ба ҳуҷайраҳои мизбон шароити мусоид фароҳам меорем, ки дар он GI дар вектор нишаста метавонад маҳсулоти мавриди таваҷҷӯҳи моро ифода кунад (PI) .

Қадами клонкунии ген № 6.

Ҷудокунии нусхаҳои зиёдшудаи ген/протеин, ки аз ҷониби гени воридшуда ифода шудааст:

Дар ин қадам мо GI-и сершумори худро ҷудо мекунем, ки бо вектор ё pro­tein бо он рамзгузорӣ шудааст. Инро бо рафти чамъоварии хосил дар он чое, ки мо хосилро аз сахро чамъоварй мекунем, ба таври хакконй му-носибат кардан мумкин аст. Равандҳои изолятсия бисёранд, ки интихоби онҳо аз ҳар ҳолат фарқ мекунад.

Қадами клонкунии ген № 7.

Тоза кардани нусхаи ген/протеини ҷудошуда:

Пас аз ҷамъоварии нусхаи генҳои ҷудошуда ё сафеда ҳоло кори мо тоза кардани онҳост.


Омилҳои муҳиме, ки ба муваффақияти клонкунӣ, экспрессия ва истеҳсоли оммавии ферментҳо тавассути рекомбинант таъсир мерасонанд E. coli

E. coli мизбони маъмултарин барои истеҳсоли ферментҳо ва сафедаҳои дигар бо технологияи рекомбинатии ДНК мебошад. E. coli барои соддагии нисбӣ, арзон ва зуд парвариши зичии баланд, генетикаи маъруф ва миқдори зиёди асбобҳои молекулавии мувофиқ афзалтар аст. Сарфи назар аз ҳамаи ин бартариҳо, ифода ва истеҳсоли ферментҳои рекомбинантӣ на ҳамеша муваффақанд ва аксар вақт боиси сафедаҳои ҳалнашаванда ва ғайрифаъол мешаванд. Омилҳои зиёде мавҷуданд, ки ба муваффақияти клонкунӣ, экспрессия ва истеҳсоли оммавии ферментҳо тавассути рекомбинант таъсир мерасонанд E. coli. Дар ин мақола, ин омилҳо ва равишҳои муҳим барои бартараф кардани ин монеаҳо ҷамъбаст карда шудаанд, ки ба ифодаи назоратшавандаи протеин/ферментҳои мақсаднок дар шакли бетағйир дар сатҳи саноатӣ нигаронида шудаанд.

1. Муқаддима

Дар чанд соли охир технологияи рекомбинатии ДНК ба олимон имкон дод, ки миқдори зиёди сафедаҳои гуногунро дар микроорганизмҳо тавлид кунанд, ки қаблан дастрас набуданд, нисбатан гаронбаҳо ё ба миқдор гирифтан душвор буданд [1]. Гарчанде ки ифодаи генҳои хориҷӣ дар як қатор микроорганизмҳо ва хатҳои ҳуҷайра гузориш дода шудааст, аксари ин корҳо истифода мебаранд E. coli барои клонкунӣ ва ифодаи генҳои хориҷӣ [2]. Истеҳсоли ферментҳо клонкунии гени мувофиқро ба вектори экспрессия таҳти назорати промоутерҳои индуксионалӣ дар бар мегирад [3].

2. Истеҳсоли ферментҳо дар E. coli

Ифодаи сафедаҳои рекомбинантӣ дар ҳуҷайраҳо, ки дар онҳо табиатан пайдо намешаванд, номида мешавад истеҳсоли сафедаҳои гетерологӣ. Системаҳои экспрессияи бактериявӣ одатан барои истеҳсоли маҳсулоти гетерологии ҳам эукариотӣ ва ҳам прокариотӣ истифода мешаванд [4]. Ифодаи сафедаҳои гетерологӣ дар E. coli, ки системаи бактериявӣ мебошад, аз ҳама васеъ ва мунтазам истифода мешавад. Ҳоло як қатор сафедаҳои аз ҷиҳати табобатӣ муҳим ҳамчун гетерологӣ истеҳсол карда мешаванд E. coli. Аввалин протеини гетерологӣ, ки дар клиникӣ истифода шуд, инсулини инсон дар он истеҳсол шуд E. coli, бори аввал соли 1982 дар Британияи Кабир, Германияи Гарбй, Нидерландия ва ИМА тасдик карда шудааст [5] (Љадвали 1).

3. Мулоҳизаҳои умумии интихоб E. coli ҳамчун мизбони ифодаи сафедаи гетерогенӣ

E. coli ба таври васеъ ҳамчун мизбон барои ифодаи сафедаҳои гетерогенӣ барои афзалиятҳои зерин истифода мешавад: (1) осонии афзоиш ва коркард бо истифода аз таҷҳизоти оддии лабораторӣ (2) мавҷудияти даҳҳо векторҳо ва штаммҳои мизбон, ки барои ба ҳадди аксар расонидани ифода таҳия шудаанд (3) сарват дониш дар бораи генетика ва физиологияи E. coli (4) ифодаро аксар вақт бо як клони эукариотии cDNA оғоз кардан мумкин аст, ки сафеда дар E. coli, ва миқдори миллиграммҳоро дар муддати камтар аз 2 ҳафта тоза кунед (5) технологияи мувофиқи ферментатсия, ки хуб ба роҳ монда шудааст (6) метавонад захираҳои эҳтимолан номаҳдуди сафедаи рекомбинантиро тавлид кунад (7) аз ҷиҳати иқтисодӣ ҷолиб [6].

4. Маҳдудиятҳои истифода E. coli ҳамчун мизбони ифодаи сафедаи гетерогенӣ

Онҳо (1) нотавонӣ мебошанд E. coli ҳамчун прокариот барои анҷом додани тағироти пас аз трансляциявӣ, ки барои эукариот хос аст (2) қобилияти маҳдуди ташаккули пайванди дисульфидӣ (3) баъзе сафедаҳо дар шакли ҳалнашаванда, дар натиҷаи нодуруст печонидани сафедаҳо, ҷамъшавӣ ва ҷамъшавии дохили ҳуҷайраҳо ҳамчун ҷисмҳои дохилшавӣ (4) баъзан бо сабаби таназзули сафедаҳо ё тарҷумаи нокифоя ифодаи кофӣ мушоҳида карда намешавад (mRNA метавонад дар сохтори дуюмдараҷа боқӣ монад ва тарҷума халалдор шавад) (5) пайдарпаии кодон барои кислотаи аминокислотаи мушаххас дар эукариот аз прокариотҳо фарқ мекунад. E. coli. Ин падида бо номи "тағйирёбии кодон" маълум аст, ки ба синтези сафедаҳо ва ифодаи генҳо дар бадан халал мерасонад. E. coli [6].

5. Омилҳое, ки ба ифодаи ферментҳо дар E. coli

Ифодаи генҳои ферментҳо дар E. coli ба як катор омилхо таъсир мерасонад. Инҳо дар поён муҳокима карда мешаванд.

5.1. Хусусиятҳои сохтории беназир ва нозуки пайдарпаии генҳо

Пайдарпайвандҳои беназири ДНК дар марҳилаҳои гуногуни ифодаи ферментҳои рекомбинантӣ ба монанди транскрипсия ва тарҷума иштирок мекунанд.

(а) пайдарпаии ДНК, ки дар транскрипсия иштирок мекунанд. Дар транскрипсияи генҳо се пайдарпаии гуногуни ДНК ва як протеини бисёркомпонент иштирок мекунанд. (1) Пропагандист: промоутерҳо одатан аз се минтақа иборатанд, ки қуттии −35 ва −10 номида мешаванд ва минтақаи фосилавӣ, ки ҳарду қуттиҳоро ҷудо мекунанд. Ҳамоҳангсозии бисёр промоутерҳо имкон медиҳад, ки пайдарпаии ба истилоҳ консенсусӣ бароварда шавад. Ин пайдарпаӣ пайдарпаии оптималии промоутерро бо минтақаи фосилавии 17 нуклеотид ифода мекунад. Бояд қайд кард, ки дар он ягон промоутер мавҷуд нест E. coli хромосома ба пайдарпаии консенсус шабеҳ аст. Дар аксари ҳолатҳо, дар қуттии -35 ва -10 як ё ду инҳироф вуҷуд дорад [4]. (2) Терминатори транскриптӣ: як терминатори транскриптӣ лозим аст, то қатъи транскрипсияро иҷозат диҳад. Ду синфи терминаторҳо тавсиф шудаанд, истилоҳоти аз омил ва омил вобаста [7]. (3) Тартиби танзим: генҳо ё ба таври конститутсионӣ ифода ё танзим карда мешаванд. Ду синфи гуногуни танзимкунанда тавсиф карда шудаанд, репрессорҳои транскриптӣ ва фаъолкунандагони транскриптӣ. Репрессорҳо ба операторҳое, ки дар дохили минтақаи промоутер ё фавран дар поёни он ҷойгиранд, мепайванданд ва дар аксари мавридҳо, пайвастшавии РНК полимеразро пешгирӣ мекунанд ё ҳамчун блоки роҳ амал мекунанд. Барои бартараф кардани репрессия, репрессор бояд аз оператори худ ҷудо шавад. Дар баъзе ҳолатҳо, индуктор аз ҷониби ҳуҷайра синтез карда мешавад ё аз муҳит гирифта мешавад, ки ба репрессор мепайвандад ва боиси ҷудошавии оператори он мегардад [3]. (4) Полимеразаи РНК: полимеразаи РНК аз панҷ ҷузъҳои гуногун иборат аст, ки номида мешаванд α, б, б′, ω, ва σ. Дар ҳоле ки α2ββω ферменти асосиро ташкил медиханд, илова кардани σ додани хосияти промоутер голоферментро ташкил медиҳад. Дар σ омил барои эътирофи промоутер масъул аст ва аз ин бармеояд, ки ҳар як σ омил як промоутерро эътироф мекунад [8]. E. coli рамзҳои шаш омили алтернативӣ, ки дар он ҷо σ 32 пас аз болоравии ҳарорат ногаҳон лозим аст ва σ S кори хонаро иваз мекунад σ омил σ 70 дар давраи статсионарй. То ҳол, танҳо σ 70 дар истеҳсоли сафедаҳои рекомбинантӣ ба монанди ферментҳо истифода мешавад [3].

(б) пайдарпаии ДНК, ки дар тарҷума иштирок мекунанд. Маълум шуд, ки доираи васеи самаранокии тарҷумаи mRNA-ҳои гуногун асосан ба сохтор дар охири 5'-и ҳар як намуди mRNA вобаста аст. Минтақаи оғози тарҷума аз чор пайдарпаии гуногун иборат аст: (1) пайдарпаии Shine-Dalgarno, (2) кодон оғоз, (3) минтақаи фосила байни пайдарпаии Shine-Dalgarno ва кодони оғоз, фосилаи оптималии муайян карда шудааст 4 то 8 нуклеотидҳо ва (4) тақвиятдиҳандаҳои тарҷумавӣ [3].

Сохтори дуюмдараҷа дар минтақаи оғози тарҷумаи mRNA дар самаранокии ифодаи ген нақши муҳим дорад. Нишон дода шудааст, ки басташавии пайдарпаии Shine-Dalgarno ва/ё кодони ибтидоӣ аз ҷониби сохтори ҳалқаи бунёдӣ дастрасӣ ба зербанди рибосомаи 30S-ро пешгирӣ мекунад ва тарҷумаро бозмедорад [9]. Мутацияи нуклеотидҳои мушаххас дар боло ё поён аз пайдарпаии Shine-Dalgarno ташаккули сохторҳои дуюмдараҷаи mRNA-ро пахш кард ва самаранокии тарҷумаро афзоиш дод [10, 11].

5.2. "Қувват" -и Промоутери транскриптӣ

Барои ифодаи баландтар, гени ферментҳо бояд таҳти назорати промоутерҳои қавӣ ҷойгир карда шаванд. Бисёр векторҳои плазмидӣ ва бактериофагҳо таҳия шудаанд, ки дар онҳо гени клоншуда фавран дар поёни промоутерҳои транскрипсияи қавӣ ҷойгир аст [2]. Истифодаи ин векторҳо талаб мекунад, ки промоутер набояд конститутсионӣ бошад (яъне ҳамеша фаъол бошад), балки дар марҳилаи мушаххаси афзоиши тағирёбанда фаъол бошад. E. coli ҳуҷайраҳо. Ин аксар вақт тавассути илова кардани метаболити мушаххас ё тағирёбии ҳарорати муҳити афзоиш ба амал меояд [12]. Танзими фаъолияти промоутерҳо кафолат медиҳад, ки ифодаи гени хориҷӣ ба функсияҳои муқаррарии генҳои ҳуҷайра халал нарасонад ва барои ҳуҷайра зараровар набошад. Нокомии танзими ифодаи промоутерҳои қавӣ аксар вақт боиси аз даст додани плазмиде, ки промоутерҳои қавӣ дорад ё ифодаи конститутсионии промоутерҳои қавӣ, ки метавонад барои ҳуҷайра марговар бошад, оварда мерасонад [13].

Промоутерҳои пурқувваттарин аз ҳама васеъ истифода мешаванд E. coli trp ва lac оперонҳо, промоутер (ан in vitro Сохтмон, аз ҷумла унсурҳои ҳам аз промоутерҳои trp ва lac) ва ба чап ё pL, промоутерҳои бактериофаги ламбда [4].

5.3. Устувории вектор дар E. coli Ҳуҷайраҳо

Пас аз клон кардани гени хориҷӣ ба вектори экспресс, вектор ба салоҳиятдор ворид карда мешавад E. coli ҳуҷайраҳое, ки манбаи сафедаи хориҷӣ мешаванд. Аммо, плазмидҳо на ҳамеша устуворанд, махсусан дар ҳуҷайраҳои барои наслҳои зиёд дар фарҳангҳои миқёси калон [14], аз ин рӯ, ҳангоми васеъ кардани раванд муҳим аст, ки устувории векторҳо баррасӣ карда шаванд. Азбаски штамм аз плазмидҳо нисбат ба штаммҳои дорои плазмидҳо суръати афзоиши хоси тезтар дорад, дар натиҷаи энергияи мубодилаи моддаҳо, ки барои нигоҳдории плазмидҳо сарф мешавад, штамм аз плазмидҳо дар ниҳоят аз штамми дорои плазмидҳо бартарӣ хоҳад дошт [15] .

5.3.1. Сабабҳои ноустуворӣ

(1) Устувории плазмид ба генотипҳои вектор ва мизбон таъсир мерасонад, як плазмид дар ҳостҳои гуногун дараҷаҳои гуногуни устувориро нишон медиҳад ва баръакс [16]. (2) Мушоҳида шудааст, ки пайдоиш ва андозаи ДНК-и хориҷӣ ба устувории плазмид таъсир мерасонад [16]. (3) Нобудшавии плазмидҳо аввал дар сатҳи ҳуҷайраҳои инфиродӣ дар натиҷаи сегрегатсияи ноқис дар тақсимоти ҳуҷайра ва баъд дар сатҳи популятсия ба амал меояд [15]. (4) Ноустуворӣ аз сабаби афзоиши энергияи мубодилаи моддаҳо, ки барои нигоҳдорӣ ва функсияи плазмид заруранд [17]. (5) Устувории плазмидҳо инчунин як функсияи параметрҳои физиологие мебошад, ки ба суръати афзоиши ҳуҷайраи мизбон таъсир мерасонанд, ки рН, ҳарорат, суръати аэратсия, ҷузъҳои миёна ва ҷамъшавии сафедаҳои гетерологиро дар бар мегиранд [16].

5.3.2. Роҳҳои ҳалли мушкилоти ноустуворӣ

(1) Усули маъмултарини кафолат додани он, ки плазмиди рекомбинантӣ ҳангоми афзоиши микроорганизм гум нашавад, ворид кардани антибиотикҳо мебошад, ки барои мавҷудияти плазмидҳои генҳои муқовимати антибиотикҳои мувофиқ интихоб карда мешаванд. Бо вуҷуди ин, васеъ кардани ин равиш бо сабаби арзиши антибиотикҳои иловашуда, ки дар ҳуҷайра ҷойгир карда шудаанд, метавонад аз ҷиҳати иқтисодӣ ғайриимкон бошад [14]. (2) Стратегияи шабеҳ истифодаи векторҳои плазмиди репликатсияро дар бар мегирад, ки шумораи нусхаи плазмидҳо дар ҳарорати паст нисбатан паст аст ва ҳангоми баланд шудани ҳарорат зиёд мешавад. Шумораи нусхаи поёнии плазмидҳо дар давоми аксари давраи афзоиши ҳуҷайра сарбории метаболикиро ба ҳуҷайра коҳиш медиҳад ва устувории плазмидҳоро таъмин мекунад. Дар айни замон шумораи зиёдтари нусхаи плазмид барои як қисми давраи афзоиш боиси сатҳи баланди ифодаи гени бегонаи клоншуда мегардад [18].

5.4. Шумораи нусхаҳои ген

Азбаски гени мақсаднок аксар вақт ба системаи вектории плазмид дохил карда мешавад, миқдори ген аз рақами нусхаи плазмид вобаста аст. Тавре ки интизор шудан мумкин аст, афзоиши шумораи нусхабардорӣ ба ҳосилнокии баландтари сафедаи рекомбинантӣ оварда мерасонад, аммо на ба таври номуайян. Шумораи нусхабардории плазмидҳо аз генетикаи плазмид ва мизбон ва инчунин аз шароити парвариш ба монанди суръати афзоиш, васоити ахбори омма ва ҳарорат таъсир мерасонад [19].

5.5. Кодонҳое, ки дар генҳои хориҷӣ истифода мешаванд, дар муқоиса бо намунаи муқаррарии истифодаи кодон дар E. coli

Азбаски 20 аминокислотаҳо бо 61 кодонҳои гуногуни тринуклеотид рамзгузорӣ шудаанд, якчанд кодонҳои тринуклеотид метавонанд иттилоотро барои ворид кардани аминокислотаи аминокислотаҳо ба сафеда рамзгузорӣ кунанд. Организмҳо фарқияти назаррасро дар афзалияти кодон нишон медиҳанд. Дар асл, чунин ба назар мерасад, ки басомади истифодаи кодон дар организм инъикоси мустақими ҳавзи tRNA-ҳои ҳамсоя мебошад [20]. Генҳои баланд ифодаёфта кодонҳоро истифода мебаранд, ки барои онҳо ҳавзи калони tRNA-ҳои ҳамсоя мавҷуд аст, дар ҳоле ки генҳои танзимкунанда аксар вақт кодонҳоро истифода мебаранд, ки барои онҳо танҳо як ҳавзи хеле хурди tRNA-ҳои ҳамсоя мавҷуд аст. Мутаносибан, ифодаи гени хориҷӣ метавонад бо мавҷудияти як tRNA аминоасилӣ маҳдуд бошад [21].

Истифодаи кодон аз ҷониби намудҳои гуногун метавонад хеле гуногун бошад. Ҳамчун мисол, истифодаи кодон барои аргинини чор намуди гуногун дар ҷадвали 2 оварда шудааст.

Аз ҳад зиёд экспресссияи генҳо бо миқдори зиёди кодонҳои нодир метавонад ба синтези нокифояи ферментҳои мувофиқ оварда расонад. Ба ғайр аз миқдор, ҷойгиршавии кодонҳои нодир дар минтақаи рамзгузорӣ метавонад ба сатҳи тарҷума таъсир расонад. Кодонҳои нодире, ки ба ташаббускор наздиканд, метавонанд рибосомаро боздоранд ва воридшавии рибосомаҳои нави воридшударо пешгирӣ кунанд [22].

5.5.1. Роҳҳои ҳалли мушкилоти истифодаи кодон

Ду роҳи ҳалли таҷрибавии ин масъала вуҷуд дорад: (1) зиёд кардани миқдори tRNA-и ҳамсояи мувофиқ, (2) тағир додани ин кодонҳо ба кодонҳои зуд-зуд истифодашаванда бо роҳи мутагенези хоси пайдарпай [22].

5.6. Субот ва самаранокии mRNA

mRNA-и генҳои рекомбинантӣ одатан дар ҳуҷайра ҷамъ мешаванд, аммо, E. coli mRNAs хеле ноустувор мебошанд. Баъзе хусусиятҳои mRNA ба устувории он таъсир мерасонанд. Инҳо иборатанд аз (1) пайдарпаии Shine-Dalgarno (SD) дар охири 5′-и mRNA, ки гумон меравад, ки барои ҷойгиркунии mRNA дар рибосома кӯмак кунад, (2) масофаи байни пайдарпаии SD ва кодони ибтидоӣ ва (3) ) сохтори дуюм ва сеюми mRNA [7].

5.6.1. Ҳалли

(1) Ба наздикӣ гузориш дода шуд, ки илова кардани пайдарпаии кӯтоҳмуддати ДНК (тақрибан 89 ҷуфти асос) ба охири дурдасти генҳои клоншуда метавонад мРНК-ро, ки аз ин ген транскрипсия шудааст, устувор гардонад ва ба ин васила ифодаи генҳоро афзоиш диҳад. Ин пайдарпаии "ретрорегулятор" эҳтимолан дар охири 3'-и mRNA дохил шуда, онро аз ҳазми экзонуклеазҳо муҳофизат мекунад [23]. (2) Нишон дода шудааст, ки сохторҳои устувори дуюмдараҷа, ки дар минтақаи 5' тарҷуманашуда ва 3' терминатори мустақили mRNA сохта шудаанд, метавонанд ба устувории mRNA кӯмак расонанд ва таназзулро аз ҷониби экзонуклеазаҳо пешгирӣ кунанд. Махсусан, як мӯи сари 5′-и 5′ бе ягон изофаи нуклеотиди якқатораи 5′ mRNA-ро бо муқовимати назаррас ба фаъолияти экзонуклеаза дар ситоплазма додааст [24].

5.7. Ҷойгиршавии протеини клоншуда дар дохили он E. coli Ҳуҷайра

Дар ҳоле ки E. coli сафедањо дар ситоплазма синтез карда мешаванд, мањсули гени клоншударо ба ситоплазма, мембранаи дарунї ё берунї ё фазои периплазмї равона кардан мумкин аст [25]. Секрецияи маҳсулоти генҳои клоншуда ба фазои периплазма аксар вақт имкон медиҳад, ки сатҳи баландтари ифодаи сафедаи хориҷӣ, ки метавонанд тавассути протеазҳо дар ситоплазма вайрон шаванд [26]. E. coli қодир аст, ки пайдарпайии сигналҳоро эътироф ва дуруст коркард кунад, то секретсияи ферментҳо ба E. coli фазои периплазмӣ имконпазир аст [27].

5.7.1. Чор сабаб барои интиқол додани протеинҳои рекомбинантӣ ба периплазма мавҷуданд

(1) муҳити оксидкунанда ба ташаккули пайвандҳои дисульфидӣ мусоидат мекунад, (2) он танҳо 4% сафедаи умумии ҳуҷайраро дар бар мегирад (

100 сафедаи гуногун), (3) таназзули сафедаҳо камтар аст ва (4) тозакунии осон тавассути зарбаи осмотикӣ [3].

5.7.2. Камбудии ифодаи периплазми

Дар ҳоле ки аз ҷиҳати техникӣ равона кардани маҳсулоти сафедаи генҳои хориҷӣ ба мембранаи дохилӣ ё берунӣ имконпазир аст, сатҳи баланди сафедаи хориҷӣ дар мембрана метавонад ба функсияҳои муқаррарии ҳуҷайра халал расонад ва барои ҳуҷайра марговар бошад [28].

5.7.3. Ҳалли

Ба наздикӣ векторҳои экспрессия сохта шудаанд, ки генҳои сафедаҳои хориҷиро, ки одатан ҷудо намешаванд, дар паси порчаи ДНК ҷойгир мекунанд, ки пайдарпаии сигналро рамзгузорӣ мекунанд. Ин боиси он мегардад, ки протеини хориҷӣ ба таври муассир (ба миқдори зиёд) ба фазои периплазмӣ ҷудо мешавад, бидуни далели ҷамъшавии шакли коркарднашуда дар ситоплазма [29].

5.8. Устувории ферментҳои клоншуда дар E. coli

Секрецияи маҳсулоти генҳои клоншуда ба фазои периплазма аксар вақт имкон медиҳад, ки сатҳи баландтари ифодаи сафедаи хориҷӣ, ки метавонад тавассути протеазҳо дар ситоплазма вайрон карда шавад [26]. Истеҳсоли калони сафедаҳои эукариотӣ дар E. coli аксар вақт бо ноустувории ин полипептидҳо дар дохили мизбони бактерия маҳдуд мешавад [30].

Ҳассосияти протеаза метавонад аз ҷониби пайдарпаии N- ва C-терминали сафедаи рекомбинантӣ таъсир расонад. Мавҷудияти Arg, Leu, Lys, Phe, Trp ё Tyr дар N-terminus сафедаҳо барои таназзули тезтар (қоидаи N-охири) нигаронида шудааст. Кислотаҳои аминокислотаҳои ғайриқутбӣ дар терминали C метавонанд ба таназзули зуд оварда расонанд, аммо сафедаҳо бо панҷ аминокислотаҳои охирини қутбӣ ё заряднок вайрон намешаванд [31].

Дигар омилҳои ҳассосияти протеазҳо иборатанд аз (1) мавҷудияти маҳсулоти сафедаи вайроншуда ё зиёдатӣ, ки дар натиҷаи ташаккули полипептидҳои нопурра, (2) синтези аз ҳад зиёди зерқисмҳо аз комплексҳои мултимерикӣ, (3) зарари пас аз трансляция ё муҳандисии генетикии сафедаи мақсаднок , ва (4) параметрҳои афзоиши фарҳанг ба монанди таркиби маводи ғизоии ВАО, ҳарорати афзоиш ва рН [32].

5.8.1. Ҳалли мушкилот

(1) Стратегияи маъмуле, ки барои бартараф кардани ин мушкилот истифода шудааст, муттаҳид кардани ген барои сафедаи эукариотӣ ба як қисми гени бактериявӣ мебошад [33]. (2) Равиши алтернативӣ барои устувор кардани сафедаи клоншуда ин клон кардани нусхаҳои сершумори ген дар тандем ба як плазмид аст [34].

5.9. Ҷисмҳои фарогирӣ ва чӣ гуна пешгирии ташаккули онҳо

Истеҳсоли босуръати сафедаҳои рекомбинантӣ метавонад ба ташаккули агрегатҳои ҳалнашаванда оварда расонад, ки ҳамчун ҷисмҳои дохилшавӣ таъин шудаанд [35]. Инҳо зарраҳои калон ва сферикӣ мебошанд, ки аз ситоплазма ба таври возеҳ ҷудо шудаанд ва дар натиҷаи нокомии системаи назорати сифат барои таъмир ё хориҷ кардани протеини нодуруст қатшуда ё кушодашуда натиҷа медиҳанд [36]. Дар ин ҳолат, клон кардани ген ба вектори секреция метавонад муфид бошад, то сафедаи клоншуда дар ситоплазма ҷамъ нашавад [37].

5.9.1. Ҳалли

Стратегияҳо барои пешгирии ташаккули ҷисмҳои дохилшавӣ ба суст кардани истеҳсоли сафедаҳои рекомбинантӣ нигаронида шудаанд ва (1) векторҳои шумораи ками нусхабардорӣ, (2) промоутерҳои заиф, (3) ҳарорати паст, (4) экспрессияи шаперонҳои молекулавӣ, ( 5) истифодаи шарики ҳалкунанда ва (6) ферментатсия дар арзишҳои шадиди рН [3]. (7) Стратегияи маъмуле, ки барои бартараф кардани ин мушкилот истифода шудааст, муттаҳид кардани ген барои сафедаи эукариотӣ ба як қисми гени бактериявӣ мебошад [33].

Афзалиятҳои ифода ё сафедаҳои гетерологӣ ҳамчун протеинҳои Fusion ё бо Protein Tag. Бисёр векторҳо мавҷуданд, ки барои ифодаи сафедаҳои гетерологӣ, ки дар шарикони N- ё C-терминали онҳо муттаҳид мешаванд, аксар вақт теги сафеда номида мешаванд [38]. Масалан, теги Гистидин (Ӯ) як протеини синтез аст. Чунин шарикони синтез якчанд бартариҳои эҳтимолиро пешниҳод мекунанд. Ифодаи беҳтаршуда: омезиши N терминалҳои сафедаи гетерологӣ ба C-терминуси шарики синтези баланд аксар вақт имкон медиҳад, ки сатҳи баланди ифодаи сафедаи синтез [39]. Ҳалшавандагии беҳтаршуда: омезиши N терминали сафедаи гетерологӣ ба C-терминуси шарики синтези ҳалшаванда аксар вақт маҳлулияти сафедаро беҳтар мекунад [40]. Муайянкунии беҳтаршуда: омезиши сафеда дар ҳар як нуқтаи ниҳоӣ ба пептиди кӯтоҳ ё полипептид, ки аз ҷониби антитело ё сафедаи ҳатмӣ эътироф карда мешавад, имкон медиҳад, ки протеинро ҳангоми экспрессия ва тозакунӣ таҳлил кунад [41]. Тозакунии беҳтаршуда: ин падидаи васеъ истифодашаванда аст. Схемаҳои оддии тозакунӣ барои сафедаҳо дар ҳар ду канори тегҳо, ки қатронҳои наздикро мепайванданд, тавсиф карда шудаанд. Барчаспҳои дастрас дорои Ӯ мебошанд6 (шаш тандем боқимондаҳои Гистидин), ки ба Ni-NTA (нитрилотриацетати хелатдор бо ионҳои Ni 2+) GST (глутатион-S-трансфераза, ки ба глутатион-сефароза мепайвандад) мепайвандад. Ин барчаспҳо ба қатронҳои мушаххаси худ мепайванданд ва ба осонӣ ҷудо мешаванд. Таъсири тегҳо ба сафеда ва ба осонӣ буридашуда вуҷуд надорад [42].

5.10. Пӯшидани протеинҳои дуруст ва самаранок

Ҳангоми тарҷума ё пас аз он, полипептид бояд печида шавад, то конформатсияи аз ҷиҳати функсионалӣ фаъолро қабул кунад [43]. Азбаски бисёре аз сафедаҳои денатуратшуда метавонанд дубора қабат карда шаванд in vitro, чунин ба назар мерасад, ки маълумот дар бораи қабати дуруст дар сохтори полипептидҳои ибтидоӣ мавҷуд аст [44]. Бо вуҷуди ин, печиш марҳилаҳои маҳдудкунандаи суръатро дар бар мегирад, ки дар давоми он баъзе молекулаҳо метавонанд ҷамъ шаванд, махсусан дар суръати баланди синтез ва дар ҳарорати баланд. Дар муқоиса бо сафедаҳои дохили ҳуҷайра, сафедаҳои табиатан ҷудошуда дар цитоплазма ба муҳити ғайримуқаррарӣ дучор меоянд, ки ташаккули пайванди дисульфиди ситоплазма мусоидат намекунад ва гликозилизатсия ба амал намеояд [45].

5.10.1. Ҳалли

(1) Ҳамоҳангсозии шаперонҳои иловагӣ барои кӯмак дар қабати сафедаҳо. Ин метавонад боиси коҳиши ифодаи фермент гардад, аммо он ба ҳалшавандагӣ мусоидат мекунад. Далелҳо мавҷуданд, ки сафедаҳои зарбаи гармии муайян ҳамчун чаперонҳои молекулавӣ барои пешгирӣ кардани ташаккул ва ҷамъшавии агрегатҳои кушодашуда ва суръат бахшидан ба реаксияҳои қатшаванда амал мекунанд. (2) Барои ташаккули пайванди дисульфид, тиоредоксинро коэкспресс кунед (ё ҳамчун шарики синтез истифода баред) ё штаммҳоеро, ки дар тиоредоксин редуктаза каманд, истифода баред. Як алтернативаи баррасӣ ин ҳадафи сафеда ба периплазма мебошад, ки дар он ҷо ташаккули пайванди дисульфидҳо рух медиҳад (аксарияти онҳо). E. coli сафедаҳое, ки пайвандҳои дисульфидӣ доранд, дар периплазма ҷойгиранд) [46].

5.11. Хусусиятҳои афзоиши ҳуҷайра

Хусусиятҳои афзоиши ҳуҷайраҳо ба экспрессияи ферментҳои рекомбинантӣ таъсири назаррас доранд. Баъзе аз манипуляцияҳои расонаҳои фарҳангӣ инҳоянд. (а) Ҳарорати афзоиши фарҳангро паст кунед: афзалияти паст шудани ҳарорати афзоиш инҳоянд. (1) Рушд дар 37 ° C метавонад ба ташаккули бадани дохилшавӣ барои баъзе сафедаҳо мусоидат кунад, дар ҳоле ки афзоиш дар ҳарорати пасттар (масалан, 30 ° C, 25 ° C, 15 ° C) наметавонад. (2) Ҳарорати паст низ фаъолияти протеазҳоро коҳиш медиҳад. Камбудиҳо инҳоянд. (1) Парвариши фарҳанг дар ҳарорати пасттар афзоиши онро ба таври назаррас суст мекунад E. coli, ва аз ин рӯ, барои ба даст овардани миқдори кофии протеини рекомбинантӣ давраи тӯлонии индуксия (масалан, якшаба) лозим аст. (2) Парвариши фарҳанг дар ҳарорати паст суръати синтези сафедаҳоро суст мекунад ва эҳтимолан сафедаҳои рекомбинантиро аз сер кардани мошинҳои қабати ҳуҷайра ва ҷамъшавӣ нигоҳ медорад [47]. (б) Илова кардани кофакторҳо: кофакторхои потенсиалй бояд ба мухити нашъунамо илова карда шаванд. Баъзе сафедаҳо бе кофактори худ дуруст ҷамъ шуда наметавонанд ва аз ин рӯ метавонанд ҷисмҳои дохилкуниро ташкил кунанд. (в) тағирёбии рН: тағир додани рН-и муҳити афзоиш метавонад ифодаро беҳтар кунад. pH як тағирёбандаи фарҳанг аст, ки метавонад ба фаъолияти протеолитикӣ, секреция ва сатҳи истеҳсоли сафеда таъсир расонад [48].

5.12. Сарбории метаболикӣ ба организм

Новобаста аз хусусияти гени хориҷӣ ё тарҳи ферментатор, ворид кардани плазми экзогенӣ ба E. coli ҳуҷайра маҷбур аст, ки сарбории метаболикиро ба бор орад [49].

5.12.1. Ҳалли

Инро метавон пешгирӣ кард (1) тавассути ворид кардани гени хориҷӣ ба ген E. coli хромосома тавассути истифодаи лизогени ноқиси бактериофаги ламбда, ки гени хориҷиро дорад [50], (2) тавассути ворид кардани мустақими гени хориҷӣ ба макони мушаххаси хромосомаи мизбон [51].

6. Хулоса

Дар ҳоле ки ифодаи самараноки генҳои хориҷӣ дар E. coli аз як қатор омилҳо вобаста аст, бо вуҷуди ин интизор шудан оқилона аст, ки аксари генҳои хориҷӣ метавонанд дар сатҳи баланд ифода карда шаванд. E. coli ва ин ифода барои васеъ кардани миқёс мувофиқ хоҳад буд. Гарчанде ки стратегияи ифодаи генҳо ва миқёси васеъшавӣ гуногун аст, аммо нисбат ба фарқиятҳо аз як ген ба генҳои дигар шабоҳатҳои бештар вуҷуд доранд, ки дар натиҷа як равиши "система" ба клонизатсия, ифода ва миқёси ферментҳо таҳия шудааст. генҳо дар E. coli. Ҳадафи ниҳоии истеҳсоли сафедаи дилхоҳ дар як мизбони гетерологии иқтисодӣ аз омилҳои гуногун таъсир мерасонад. Бо вуҷуди ин, ба ҳадди аксар расонидани истеҳсоли сафедаҳои гетерологӣ барои истифодаи тиҷоратӣ то ҳол санъат аст. Мо ба фаҳмидани омилҳое, ки ба истеҳсолоти ниҳоӣ таъсир мерасонанд, оғоз кардем. Ин омилҳо, ки дар ин мақола ба таври муфассал тавсиф шудаанд, гуногунанд ва баъзан суст фаҳмида мешаванд. Муносибат асосан таҷрибавӣ боқӣ мемонад. Бо вуҷуди ин, таҷрибаи коллективии мо ба мо имкон медиҳад, ки муносибати худро дар тарҳрезии истеҳсоли гетерологии ферментҳои аз ҷиҳати тиҷоратӣ муҳим дар системаҳои гуногуни экспрессия оқилона кунем. Пас аз истеҳсол, мӯътадилсозӣ ва ташаккули сафедаҳо дар истифодаи катализаторҳои табиии биологӣ ва дигар сафедаҳо барои мақсадҳои табобатӣ ва саноатӣ монеаҳои ҷиддӣ эҷод мекунанд.

Иқтибосҳо

  1. М.Девасахаям, «Омилхое, ки ба ифодаи гликопротеинхои рекомбинантй таъсир мерасонанд». Маҷаллаи Ҳиндустон оид ба тадқиқоти тиббӣ, ҷилди. 126, №. 1, саҳ. 22–27, 2007. Намоиш дар: Google Scholar
  2. M. J. Carrier, M. E. Nugent, W. C. A. Tacon ва S. B. Primrose, "Ифодаи баланди генҳои клононидашуда дар E. coli ва оқибатҳои он” Тамоюлҳо дар биотехнология, ҷилди. 1, не. 3𠄵, саҳ. 109–113, 1983. Намоиш дар: Google Scholar
  3. В.Шуман ва Л.К.С. Escherichia coli,” Генетика ва биологияи молекулавӣ, ҷилди. 27, №. 3, саҳ. 442–453, 2004. Намоиш дар: Google Scholar
  4. B. R. Glick ва G. K. Whitney, "Омилҳое, ки ба ифодаи сафедаҳои хориҷӣ дар Escherichia coli,” Маҷаллаи микробиологияи саноатӣ, ҷилди. 1, не. 5, саҳ. 277–282, 1987. Намоиш дар: Google Scholar
  5. R. Crowl, C. Seamans, P. Lomedico, and S. McAndrew, "Векторҳои ифодаи гуногунҷабҳа барои синтези сатҳи баланди маҳсулоти генҳои клоншуда дар Escherichia coli,” Ген, ҷилди. 38, не. 1𠄳, саҳ. 31–38, 1985. Намоиш дар: Google Scholar
  6. Т.А.Браун, Клонкунии ген - Муқаддима, Уайли-Блэквелл, нашри 4, 1995.
  7. ГД Стормо, ТД Шнайдер ва Л.М. E. coli,” Тадқиқоти кислотаҳои нуклеинӣ, ҷилди. 10, нест. 9, саҳ. 2971–2996, 1982. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  8. Т.М.Грубер ва С.А.Гросс, «Зерқисматҳои сершумори сигма ва тақсимоти фазои транскрипсияи бактериявӣ», Баррасии солонаи микробиология, ҷилди. 57, саҳ. 441–466, 2003. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  9. В. Рамеш, А.Де, ва В.Нагараҷа, "Гиперэкспрессияи муҳандисии протеини бактериофаги Mu C тавассути бартараф кардани сохтори дуюмдараҷа дар минтақаи оғози тарҷума," Муҳандиси протеин, ҷилди. 7, нест. 8, саҳ. 1053–1057, 1994. Намоиш дар: Google Scholar
  10. Ҷ. Коулман, М. Иноуе ва К. Накамура, "Мутацияҳо дар болооби макони пайвастшавӣ ба рибосомаҳо ба самаранокии тарҷума таъсир мерасонанд" Маҷаллаи биологияи молекулавӣ, ҷилди. 181, №. 1, саҳ. 139–143, 1985. Намоиш дар: Google Scholar
  11. G. Gross, C. Mielke, I. Hollatz, H. Blockers, and R. Frank, "Пайдарбандии ибтидоии РНК ё сохтори дуюмдараҷа дар минтақаи ибтидоии тарҷума ифодаи ду варианти интерферонро назорат мекунад.β генҳо дар Escherichia coli,” Маҷаллаи химияи биологӣ, ҷилди. 265, №. 29, саҳ. 17627–17636, 1990. Дидан дар: Google Scholar
  12. J. R. Swartz, "Пешрафтҳо дар Escherichia coli истеҳсоли протеинҳои табобатӣ, Андешаи ҷорӣ дар биотехнология, ҷилди. 12, №. 2, саҳ. 195–201, 2001. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  13. S. Ringquist, S. Shinedling, D. Barrick et al., «Оғози тарҷума дар Escherichia coli: пайдарпаӣ дар дохили макони пайвасти рибосома," Микробиологияи молекулавӣ, ҷилди. 6, нест. 9, саҳ. 1219–1229, 1992. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  14. Ҷ. Пирс ва С.Гуттеридҷ, «Тайёр кардани миқёси васеъи карбоксилазаи рибулозебифосфат аз системаи рекомбинантӣ дар Escherichia coli ки бо ноустувории шадиди плазмидӣ хос аст," Микробиологияи амалӣ ва муҳити зист, ҷилди. 49, №. 5, саҳ. 1094–1100, 1985. Намоиш дар: Google Scholar
  15. R. E. Ashby ва K. A. Stacey, "Устодияти плазми F trim дар популятсияҳои штаммҳои рекомбинатсияи камбуд Escherichia coli дар фарҳанги доимӣ" Антони ван Левенгук, ҷилди. 50, нест. 2, саҳ. 125–134, 1984. Намоиш дар: Google Scholar
  16. Р.Мина ва П.Хариш, «Системаҳои экспрессия барои истеҳсоли сафедаҳои гетерологӣ», Илми ҷорӣ, ҷилди. 80, нест. 9, саҳ. 1121–1128, 2001. Намоиш дар: Google Scholar
  17. С.Айба, Х.Цунекава ва Т.Иманака, «Муносибати нав ба истеҳсоли триптофан Escherichia coli: манипуляцияи генетикии плазмидҳои таркибӣ in vitro,” Микробиологияи амалӣ ва муҳити зист, ҷилди. 43, №. 2, саҳ. 289–297, 1982. Намоиш дар: Google Scholar
  18. М. Биттнер ва Д. Вапнек, «Векторҳои клонкунии гуногунҷабҳа аз плазми репликатсияи фирори pKN402,» Ген, ҷилди. 15, нест. 4, саҳ. 319–329, 1981. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  19. J. E. Hughes ва D. L. Welker, "Назорати рақами нусхабардорӣ ва мутобиқати плазмидҳои ядроӣ дар dictyostelium discoideum", Плазмид, ҷилди. 22, №. 3, саҳ. 215–223, 1989. Намоиш дар: Google Scholar
  20. ОГ Берг ва К.Г. Курланд, "Суръати афзоиш, фаровонии tRNA ва истифодаи кодон оптимизатсияшуда", Маҷаллаи биологияи молекулавӣ, ҷилди. 270, №. 4, саҳ. 544–550, 1997. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  21. Н.Столецки ва А.Эйр-Уолкер, «Истифодаи синоними кодон дар Escherichia coli: интихоб барои дақиқии тарҷума," Биологияи молекулавӣ ва эволютсия, ҷилди. 24, №. 2, саҳ. 374–381, 2007. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  22. G. F. T. Chen ва M. Inouye, "Нақши кодонҳои AGA/AGG, нодиртарин кодонҳо дар ифодаи генҳои глобалӣ дар Escherichia coli,” Инкишофи генҳо, ҷилди. 8, не. 21, саҳ. 2641–2652, 1994. Намоиш дар: Google Scholar
  23. Ҳ.С.Вонг ва С.Чанг, "Муайян кардани ретрорегулятори мусбӣ, ки mRNA-ро дар бактерияҳо устувор мекунад," Маҷмӯаҳои Академияи миллии илмҳои Иёлоти Муттаҳидаи Амрико, ҷилди. 83, №. 10, саҳ. 3233–3237, 1986. Намоиш дар: Google Scholar
  24. С.А.Эмори, П.Бувет ва Ҷ.Г.Беласко, “Сохтори ҳалқаи 5-терминалӣ метавонад mRNA-ро дар Escherichia coli,” Инкишофи генҳо, ҷилди. 6, нест. 1, саҳ. 135–148, 1992. Намоиш дар: Google Scholar
  25. F. Baneyx, «Ифодаи сафедаи рекомбинантӣ дар Escherichia coli,” Андешаи ҷорӣ дар биотехнология, ҷилди. 10, нест. 5, саҳ. 411–421, 1999. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  26. C. S. Hoffman ва A. Wright, "Омезишҳои сафедаҳои секретсияшуда ба фосфатазаи сілтӣ: равиш барои омӯзиши секрецияи сафеда", Маҷмӯаҳои Академияи миллии илмҳои Иёлоти Муттаҳидаи Амрико, ҷилди. 82, №. 15, саҳ. 5107–5111, 1985. Намоиш дар: Google Scholar
  27. Г.Л.Грэй, Ҷ.С.Болдридж, К.С.МакКеоун, Ҳ.Л.Хейнекер ва Ч.Н.Чанг, “Истеҳсоли периплазмии гормонҳои дуруст коркардшудаи афзоиши инсон дар Escherichia coli: пайдарпаии сигналҳои табиӣ ва бактериявӣ ивазшавандаанд," Ген, ҷилди. 39, №. 2-3, саҳ. 247–254, 1985. Намоиш дар: Google Scholar
  28. ФЖ Мергулх ва Г.А.Монтейро, «Таҳлили омилҳое, ки ба истеҳсоли периплазмии сафедаҳои рекомбинантӣ таъсир мерасонанд Escherichia coli,” Маҷаллаи микробиология ва биотехнология, ҷилди. 17, №. 8, саҳ. 1236–1241, 2007. Намоиш дар: Google Scholar
  29. Ҷ. Грайеб, Ҳ. Кимура, М. Такахара, Ҳ. Ҳсиунг, Ю. Масуи ва М. Иноуе, «Векторҳои клонкунии секреция дар Escherichia coli,” Маҷаллаи EMBO, ҷилди. 3, не. 10, саҳ. 2437–2442, 1984. Намоиш дар: Google Scholar
  30. Л.С.Симрнонс ва Д.Г.Янсура, “Сатҳи тарҷума омили муҳими секрецияи сафедаҳои гетерологӣ дар Escherichia coli,” Биотехнологияи табиат, ҷилди. 14, №. 5, саҳ. 629–634, 1996. Намоиш дар: Google Scholar
  31. С.Готтесман, С.Викнер ва М.Р.Мауризи, «Назорати сифати протеин: триаж аз ҷониби чаперонҳо ва протеазҳо», Инкишофи генҳо, ҷилди. 11, не. 7, саҳ. 815–823, 1997. Намоиш дар: Google Scholar
  32. Н.Дедхиа, Р.Ричинс, А.Месина ва В.Чен, «Бехтар кардани истеҳсоли сафедаи рекомбинантӣ дар ppGppdeficient. Escherichia coli,” Биотехнология ва биоинженерия, ҷилди. 53, саҳ. 379–386, 1997. Намоиш дар: Google Scholar
  33. К.Итакура, Т.Хиросе, Р.Креа ва А.Д.Риггс, «Ифода дар Escherichia coli гени аз ҷиҳати кимиёвӣ синтезшудаи гормони соматостатин, Илм, ҷилди. 198, №. 4321, саҳ. 1056–1063, 1977. Намоиш дар: Google Scholar
  34. J. L. Hartley ва T. J. Gregori, "Клон кардани нусхаҳои сершумори сегменти ДНК" Ген, ҷилди. 13, №. 4, саҳ. 347–353, 1981. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  35. С.Беттс ва Ҷ. Кинг, «Роҳи дуруст ва роҳи нодуруст вуҷуд дорад: дар vivo ва in vitro печидан, нодуруст печидан ва васлкунии зербахши tailspike P22," Сохтор, ҷилди. 7, нест. 6, саҳ. R131–R139, 1999. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  36. Ҷ.Р.Блэкуэлл ва Р.Ҳорган, "Стратегияи нав барои истеҳсоли сафедаи рекомбинатии баланд дар шакли фаъол" Номаҳои FEBS, ҷилди. 295, No. 1𠄳, саҳ. 10–12, 1991. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  37. B. Fahnert, H. Lilie ва P. Neubauer, "Мақомҳои дохилшавӣ: ташаккул ва истифода", Пешрафтҳо дар муҳандисии биохимиявӣ/биотехнология, ҷилди. 89, саҳ. 93–142, 2004. Намоиш дар: Google Scholar
  38. D. Esposito ва D. K. Chatterjee, "Такмили ифодаи сафедаи ҳалшаванда тавассути истифодаи тегҳои синтез", Андешаи ҷорӣ дар биотехнология, ҷилди. 17, №. 4, саҳ. 353–358, 2006. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  39. HP Sørensen ва K. K. Mortensen, “Ифодаи ҳалшавандаи сафедаҳои рекомбинантӣ дар ситоплазмаи Escherichia coli,” Заводҳои ҳуҷайраҳои микробҳо, ҷилди. 4, моддаи 1, 2005. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  40. С.Штал ва П.А.Нигрен, «Истифодаи синтези генҳо ба протеини А ва сафедаи G дар иммунология ва биотехнология», Патологияи биология, ҷилди. 45, №. 1, саҳ. 66–76, 1997. Намоиш дар: Google Scholar
  41. С.С.Макридес, «Стратегияҳо барои ноил шудан ба ифодаи сатҳи баланди генҳо дар Escherichia coli,” Баррасиҳои микробиологӣ, ҷилди. 60, не. 3, саҳ. 512–538, 1996. Намоиш дар: Google Scholar
  42. T. Moks, L. Abrahms'n, E. Holmgren et al., "Ифодаи омили афзоиши инсулин монанд ба инсон I дар бактерияҳо: истифодаи векторҳои оптимизатсияи синтези генҳо барои осон кардани тозакунии сафедаҳо," Биохимия, ҷилди. 26, №. 17, саҳ. 5239–5244, 1987. Дидан дар: Google Scholar
  43. Ҷ.Г. Томас ва Ф.Банейкс, "Парҳиши нодурусти сафедаҳо ва ташаккули бадан дар рекомбинант Escherichia coli ҳуҷайраҳои аз ҳад зиёд сафедаҳои зарбаи гармӣ, ” Маҷаллаи химияи биологӣ, ҷилди. 271, №. 19, саҳ. 11141–11147, 1996. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  44. М. Ҷ. Гетинг ва Ҷ. Самбрук, "Пешгирии сафеда дар ҳуҷайра", Табиат, ҷилди. 355, №. 6355, саҳ. 33–45, 1992. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  45. C.H.Schein ва M.H.M.Noteborn, "Ташаккули сафедаҳои рекомбинати ҳалшаванда дар Escherichia coli бо ҳарорати пасти афзоиш мусоидат мекунад " Био/технология, ҷилди. 6, нест. 3, с. 291—294, 1988.Намоиш дар: Google Scholar
  46. Андерсен ва Л.Круммен, "Ифодаи сафедаи рекомбинантӣ барои барномаҳои терапевтӣ" Андешаи ҷорӣ дар биотехнология, ҷилди. 13, №. 2, саҳ. 117–123, 2002. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  47. С.Ҳунке ва Ҷ.М.Беттон, "Таъсири ҳарорат ба ташаккули бадан ва вокуниши стресс дар периплазмаи Escherichia coli,” Микробиологияи молекулавӣ, ҷилди. 50, нест. 5, саҳ. 1579–1589, 2003. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  48. Ҷ. Ҳ. Чой ва С. Ю. Ли, "Истеҳсоли секреторӣ ва берун аз ҳуҷайраҳои сафедаҳои рекомбинантӣ бо истифода аз Escherichia coli,” Микробиология ва биотехнологияи амалӣ, ҷилди. 64, нест. 5, саҳ. 625–635, 2004. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  49. P. Neubauer, H. Y. Lin, ва B. Mathiszik, "Сарбории метаболикии истеҳсоли сафедаи рекомбинантӣ: ҷилавгирӣ аз қобилияти ҳуҷайра барои азхудкунии глюкоза ва нафаскашӣ пас аз индуксияи гени гетерологӣ дар Escherichia coli,” Биотехнология ва биоинженерия, ҷилди. 83, №. 1, саҳ. 53–64, 2003. Намоиш дар: Сайти нашрия | Google Scholar
  50. Н.Э.Мюррей, С.А.Брус ва К.Мюррей, «Клонкунии молекулавии гени лигаза ДНК аз бактериофаги Т4. II. амплификация ва тайёр кардани махсулоти ген». Маҷаллаи биологияи молекулавӣ, ҷилди. 132, №. 3, саҳ. 493–505, 1979. Намоиш дар: Google Scholar
  51. О.Райбо, М.Мок ва М.Шварц, «Техникаи муттаҳидсозии ҳар як порчаи ДНК ба хромосомаи Escherichi coli,” Ген, ҷилди. 29, №. 1-2, саҳ. 231–241, 1984. Намоиш дар: Google Scholar

Ҳуқуқи муаллифӣ

Ҳуқуқи муаллифӣ © 2013 доктор Факруддин ва дигарон. Ин мақолаи дастрасии кушодаест, ки дар доираи Литсензияи Creative Commons Attribution паҳн шудааст, ки ба истифодаи бемаҳдуд, паҳн кардан ва дубора тавлид кардан дар ҳама гуна васоити ахбори омма иҷозат медиҳад, ба шарте ки асари аслӣ дуруст иқтибос оварда шавад.


Эҷоди клон

Қадамҳои клонкунӣ чунинанд. ДНК аз организми мавриди омӯзиш гирифта мешавад ва ба порчаҳои хурди андозае, ки барои клонкунӣ мувофиқ аст, бурида мешавад. Аксар вақт ин тавассути ҷудо кардани ДНК бо ферментҳои маҳдудкунанда ба даст оварда мешавад. Ферментҳои маҳдудкунанда аз якчанд намудҳо ва штаммҳои бактерияҳо гирифта мешаванд, ки дар онҳо ҳамчун механизми муҳофизатӣ аз вирусҳо амал мекунанд. Онҳоро метавон ҳамчун "қайчии молекулавӣ" ҳисоб кард, ки ДНК-ро дар пайдарпаии мушаххаси ҳадаф буридааст. Аз ҳама муфидтарин ферментҳои маҳдудкунанда буришҳои зичро ба вуҷуд меоранд, яъне онҳо дар ҷои кандашавӣ як риштаи якқаторро мегузоранд. Ин изофаҳо дар клонкунӣ хеле муфиданд, зеро нуклеотидҳои ҷудонашуда бо изофаҳои дигаре, ки бо истифода аз ҳамон ферментҳои маҳдудкунанда сохта шудаанд, ҷуфт мешаванд. Ҳамин тавр, агар ДНК-и донорӣ ва ДНК векторӣ ҳарду бо як фермент бурида шаванд, эҳтимолияти қавӣ вуҷуд дорад, ки порчаҳои донор ва вектори бурида аз сабаби изофаҳои иловагӣ ба ҳам пайваст шаванд. Молекулаи ҳосилшуда ДНК-и рекомбинантӣ номида мешавад. Он ба он маъно рекомбинант аст, ки он аз ДНК аз ду манбаи гуногун иборат аст. Ҳамин тариқ, он як намуди ДНК аст, ки табиатан ғайриимкон аст ва артефактест, ки бо технологияи ДНК сохта шудааст.

Қадами навбатӣ дар раванди клонкунӣ ин буридани вектор бо ҳамон ферменти маҳдудкунанда, ки барои буридани ДНК-и донор истифода мешавад, мебошад. Векторҳо барои бисёр ферментҳои маҳдудкунандаи гуногун маконҳои мақсаднок доранд, аммо қулайтаринҳо онҳое мебошанд, ки танҳо як маротиба дар молекулаи векторӣ пайдо мешаванд. Ин аз он иборат аст, ки ферменти маҳдудкунанда танҳо ҳалқаи векторро мекушояд ва барои ворид кардани сегменти ДНК донор ҷой фароҳам меорад. ДНК-и вектори бурида ва ДНК-и донорӣ дар найчаи озмоишӣ омехта карда мешаванд ва нӯгҳои иловагии ҳарду намуди ДНК ба таври тасодуфӣ муттаҳид мешаванд. Албатта, якчанд намуди иттифоқҳо имконпазиранд: порчаи донор ба порчаи донор, порчаи векторӣ ба порчаи вектор ва муҳимтар аз ҳама, порчаи векторӣ ба порчаи донор, ки барои онҳо интихоб кардан мумкин аст. Ассотсиатсияҳои ДНК-и рекомбинантӣ ба таври стихиявӣ ба таври дар боло зикршуда ба вуҷуд меоянд, аммо ин ассотсиатсияҳо устувор нестанд, зеро гарчанде ки нӯгҳо ҷуфт шудаанд, устухони қанд-фосфати ДНК мӯҳр карда нашудааст. Ин тавассути татбиқи як фермент бо номи лигаза ДНК анҷом дода мешавад, ки ду сегментро мӯҳр зада, як спирали дугонаи доимӣ ва устуворро ташкил медиҳад.

Омехта акнун бояд популятсияи векторҳоро дар бар гирад, ки ҳар кадоми онҳо дорои иловаи донорҳои гуногун мебошанд. Ин маҳлул бо ҳуҷайраҳои бактериявии зинда омехта карда мешавад, ки махсус барои гузариши ҳуҷайраҳои онҳо ба ДНК табобат карда шудаанд. Молекулаҳои рекомбинантӣ ба ҳуҷайраҳои зинда дар раванде, ки трансформатсия номида мешавад, ворид мешаванд. Одатан, танҳо як молекулаи рекомбинати ягона ба ҳар як ҳуҷайраи инфиродии бактерия ворид мешавад. Пас аз ворид шудан, молекулаи рекомбинатии ДНК мисли ҳама гуна дигар молекулаҳои ДНК плазмидӣ такрор мешавад ва баъдан нусхаҳои зиёде тавлид мешаванд. Ғайр аз он, вақте ки ҳуҷайраи бактериявӣ тақсим мешавад, ҳамаи ҳуҷайраҳои духтар плазмиди рекомбинантиро мегиранд, ки боз дар ҳар як ҳуҷайраи духтар такрор мешавад.

Омехтаи аслии ҳуҷайраҳои бактериявии табдилшуда дар рӯи муҳити афзоиш дар табақ ҳамвор (табаки Петри) паҳн карда мешавад, то ҳуҷайраҳо аз ҳамдигар ҷудо шаванд. Ин ҳуҷайраҳои инфиродӣ ба чашми бараҳна ноаёнанд, аммо вақте ки ҳар як ҳуҷайра давраҳои пайдарпайи тақсимоти ҳуҷайраҳоро аз сар мегузаронад, колонияҳои намоён ба вуҷуд меоянд. Ҳар як колония як клони ҳуҷайра аст, аммо он инчунин як клони ДНК аст, зеро вектори рекомбинантӣ ҳоло тавассути репликатсия дар ҳар даври тақсимоти ҳуҷайраҳо афзоиш ёфтааст. Ҳамин тариқ, табақчаи Петри, ки метавонад садҳо колонияҳои гуногунро дар бар гирад, шумораи зиёди клонҳои пораҳои гуногуни ДНК-ро ифода мекунад. Ин маҷмӯаи клонҳо китобхонаи ДНК номида мешавад. Бо дарназардошти андозаи геноми донор ва андозаи миёнаи замимаҳо дар молекулаи рекомбинатии ДНК, муҳаққиқ метавонад шумораи клонҳоро барои фаро гирифтани тамоми геноми донорҳо ё ба ибораи дигар, шумораи клонҳои заруриро ҳисоб кунад китобхонаи геномӣ.

Навъи дигари китобхона китобхонаи cDNA мебошад. Эҷоди китобхонаи cDNA аз кислотаи рибонуклеинӣ (mRNA) ба ҷои ДНК оғоз меёбад. Мессенджер РНК иттилооти рамзшударо аз ДНК ба рибосомаҳо барои тарҷума ба сафеда интиқол медиҳад. Барои сохтани китобхонаи cDNA, ин молекулаҳои mRNA бо ферментҳои транскриптазаи баръакс коркард карда мешаванд, ки барои сохтани нусхаи ДНК аз mRNA истифода мешавад. Молекулаҳои ДНК ҳосилшударо ДНК комплементарӣ (cDNA) меноманд. Китобхонаи cDNA намунаи генҳои транскрипсияшударо ифода мекунад, дар ҳоле ки китобхонаи геномӣ минтақаҳои транскрипсиянашударо дар бар мегирад.

Ҳам китобхонаҳои геномӣ ва ҳам cDNA бе назардошти ба даст овардани порчаҳои функсионалии донорҳои клоншуда сохта мешаванд. Клонҳои геномӣ ҳатман нусхаҳои пурраи генҳоро дар бар намегиранд. Ғайр аз он, ДНК-и геномии эукариотҳо (ҳуҷайраҳо ё организмҳое, ки ядро ​​доранд) дорои интронҳо мебошанд, ки минтақаҳои ДНК мебошанд, ки ба сафеда табдил дода намешаванд ва аз ҷониби ҳуҷайраҳои бактериявӣ коркард карда намешаванд. Ин маънои онро дорад, ки ҳатто генҳои калонҳаҷм пурра тарҷума карда намешаванд. Илова бар ин, сигналҳои танзимкунандаи эукариотӣ аз сигналҳои прокариотҳо (ҳуҷайраҳо ё организмҳое, ки мембранаҳои дохилӣ надоранд, яъне бактерияҳо) фарқ мекунанд. Бо вуҷуди ин, имкон дорад, ки бо буридани замимаҳои cDNA дар наздикии минтақаи промотори бактериявӣ дар вектор дар ин китобхонаҳои экспрессӣ китобхонаҳои экспрессиявӣ эҷод карда шаванд, протеинҳои эукариотӣ дар ҳуҷайраҳои бактериявӣ сохта мешаванд, ки ин имкон медиҳад, ки якчанд барномаҳои муҳими технологӣ, ки дар зер дар пайдарпаии ДНК баррасӣ мешаванд.

Якчанд вирусҳои бактериявӣ низ ҳамчун векторҳо истифода шудаанд. Аз ҳама бештар истифодашаванда фаги лямбда мебошад. Қисми марказии геноми лямбда барои такроршавии вирус муҳим нест Escherichia coli, аз ин рӯ, онро метавон бо истифода аз ферментҳои мувофиқи маҳдудкунанда ҷудо кард ва замимаҳои ДНК-и донорро ба холигоҳ пайваст кардан мумкин аст. Дарвоқеъ, вақте ки фаг ДНК-ро ба капсулаи сафедаи худ дубора бастабандӣ мекунад, он танҳо порчаҳои ДНК-ро бо дарозии якхелаи геноми фагҳои муқаррарӣ дар бар мегирад.

Векторҳо вобаста ба миқдори умумии ДНК, ки бояд ба китобхона дохил карда шаванд, интихоб карда мешаванд. Космидҳо векторҳои муҳандисишуда мебошанд, ки гибридҳои плазмид ва фагҳои ламбда мебошанд, аммо онҳо метавонанд нисбат ба плазмидҳои pUC (плазмидҳо барои тавлиди шумораи хеле зиёди нусхаҳои ДНК тарҳрезӣ шудаанд, аммо онҳо танҳо ҷузъҳои хурдро дар бар гиранд) ё танҳо фагҳои ламбда дошта метавонанд. Хромосомаҳои сунъии бактериявӣ (BACs) векторҳое мебошанд, ки ба плазмидаҳои F-омили ҳосилхезӣ асос ёфтаанд. E. coli ва метавонад миқдори зиёди ДНК-ро бардорад. Хромосомаҳои сунъии хамиртуруши (YACs) векторҳое мебошанд, ки ба плазмидҳои мустақили такроршаванда асос ёфтаанд. Saccharomyces cerevisiae (хамиртуруши нонпазӣ). Дар хамиртуруш (организми эукариотӣ) як YAC мисли хромосомаи хамиртуруш рафтор мекунад ва дуруст ба ҳуҷайраҳои духтар ҷудо мешавад. Ин векторҳо метавонанд бузургтарин ҷузъҳои ҳамаро дошта бошанд ва дар клон кардани геномҳои калон ба монанди геноми инсон ба таври васеъ истифода мешаванд.