Маълумот

Суръати такрории SARS-COV-2


Суръати такрори SC2 чанд аст? Ҳама гуна маълумот, аз ҷумла маълумоти in vitro қадр карда мешавад.

Ман мехоҳам, ки дарозии давраи гирифтани SC2, давраи ниҳонӣ ва чизе ба монанди андозаи таркишро бидонам.

Интихобан, дар як рӯз арзишҳои CT-и qtPCR-и субъектҳои COVID+ низ муфид хоҳанд буд.


Ба гуфтаи Ами Розенфелд, тақрибан 8 соат гирифтани офтоб ва то "анҷоми он" 18-24 соат аст. Боварӣ надоред, ки ин маънои онро дорад, ки то таркиш ё то давраи ниҳонӣ тамом шавад. Ин вақтҳо дар vitro мебошанд ва аз хати ҳуҷайра вобастаанд. Дар vivo метавонад гуногун бошад. Андозаи таркиш инчунин аз ҳуҷайра вобаста аст. Манбаъ: https://youtu.be/NP56XjzyPfQ?t=1301

Дар ин навор https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=152 гуфта мешавад, ки ҳар як ҳуҷайра метавонад то 600к зарраҳои вирусии SC2 тавлид кунад, аммо ман боварӣ надорам, ки ин рақам чӣ маъно дорад. Баъдтар дар он навор: https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=187 гуфта мешавад, ки вирус ба назар мерасад, ки ҳуҷайраҳоро тақрибан 5-6 рӯз намекушад.


Давраи такрории SARS-CoV-2 дар 3D

Вақте ки пандемияи ҷаҳонии коронавирус идома дорад, олимон на танҳо кӯшиш мекунанд, ки ваксинаҳо ва доруҳоро барои мубориза бо он пайдо кунанд, балки пайваста дар бораи худи вирус маълумоти бештар гиранд. Ралф Бартеншлагер, профессори кафедраи бемориҳои сироятӣ, вирусологияи молекулавӣ дар Донишгоҳи Ҳейделберг: "Ҳоло мо метавонем интизор шавем, ки коронавирус мавсимӣ мешавад." "Ҳамин тавр, зарурати таҳия ва татбиқи стратегияҳои профилактикӣ ва табобатӣ алайҳи ин вирус вуҷуд дорад." Дар як таҳқиқоти нав, Бартеншлагер, ки бо кӯмаки гурӯҳи Schwab дар EMBL Heidelberg ва бо истифода аз Facility Core Microscopy Electron Microscopy EMBL, таҳлили муфассали тасвириро барои муайян кардани он, ки вирус ҳуҷайраҳои сироятшударо дубора барномарезӣ мекунад.

Ҳуҷайраҳое, ки аз SARS-CoV-2 сироят шудаанд, хеле зуд мемиранд, танҳо дар давоми 24 то 48 соат. Ин нишон медиҳад, ки вирус ба ҳуҷайраи инсон тавре зарар мерасонад, ки он дубора пайваст карда мешавад ва аслан маҷбур мешавад, ки насли вирусиро тавлид кунад. Аз ин рӯ, ҳадафи асосии лоиҳа муайян кардани тағироти морфологии дохили ҳуҷайра буд, ки ба ин барномасозӣ хосанд. Бартеншлагер шарҳ медиҳад: "Таҳияи доруҳое, ки репликатсияи вирус ва ба ин васила оқибати сироятро, инчунин марги ҳуҷайраҳои ба вирус ба вуҷуд овардаанд, калиди фаҳмиши беҳтари механизмҳои биологии гардиши репликатсияи вирус аст". Даста дастгоҳҳои тасвириро дар EMBL ва усулҳои муосири тасвириро барои муайян кардани меъмории 3D-и ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2 ва инчунин тағироти меъмории ҳуҷайра, ки аз вирус ба вуҷуд омадааст, истифода бурд.

Даста тавонист реконструкцияҳои 3D-и тамоми ҳуҷайраҳо ва қисмҳои зерҳуҷайраҳои онҳоро эҷод кунад. Ралф Бартеншлагер шарҳ медиҳад: "Мо дар бораи тағироти сохтории бо вирус ба вуҷуд омада дар ҳуҷайраҳои инсони омӯхташуда фаҳмиши интиқодӣ медиҳем". Тасвирҳо тағироти ошкор ва азимро дар системаҳои эндомембрани ҳуҷайраҳои сироятшуда нишон доданд - системае, ки ба ҳуҷайра имкон медиҳад, ки қисмҳо ва маконҳои гуногунро муайян кунад. Вирус тағирёбии мембранаро тавре ба вуҷуд меорад, ки вай органеллҳои репликаи худро тавлид кунад. Инҳо қисмҳои хурди такрорӣ мебошанд, ки дар он геноми вирусӣ ба таври назаррас афзоиш ёфтааст. Барои ин вирус сатҳҳои мембранаро талаб мекунад. Инҳо тавассути истифодаи системаи мембранаи ҳуҷайра ва эҷоди органелл, ки намуди зоҳирии хеле равшан доранд, ба вуҷуд меоянд. Олимон онро ҳамчун ҷамъшавии зиёди футурҳо тавсиф мекунанд: ду қабати мембрана пуфаки калонро ташкил медиҳанд. Дар дохили ин пуфакҳо, ки як қисми хеле муҳофизатшавандаро ташкил медиҳанд, геномҳои вирусӣ афзоиш ёфта, ба зарраҳои нави вирус дохил мешаванд.

Ин тағироти аҷибро дар ҳуҷайраҳо танҳо чанд соат пас аз сироят дидан мумкин аст. "Мо дидем, ки вирус дар дохили ҳуҷайра чӣ гуна ва дар куҷо паҳн мешавад ва чӣ гуна он мошини мизбони худро рабуда, пас аз афзоиш озод карда мешавад" мегӯяд Шваб. То кунун дар бораи пайдоиш ва рушди таъсироте, ки SARS-CoV-2 дар бадани инсон ба вуҷуд меорад, маълумоти кам мавҷуд буд. Ин набудани дониш дар бораи механизме, ки тавассути он сироят ба марги ҳуҷайраҳои сироятшуда оварда мерасонад, дохил мешавад. Доштани ин маълумот ҳоло ба рушди терапевтҳо мусоидат хоҳад кард, ки такрори вирусро коҳиш медиҳад ва аз ин рӯ, шиддатнокии беморӣ.

Даста боварӣ ҳосил кардааст, ки маълумоти ҷамъовардашуда ва махсусан, анбори бесобиқаи иттилооти сохтории 3D дар бораи зерсохторҳои вирусӣ аз ҷониби ҳама метавонанд истифода шаванд. Янник Шваб мегӯяд: "Ман боварӣ дорам, ки мо дар бораи он, ки мо ҳама маълумотеро, ки мо бо ҷомеаи илмӣ таҳия кардаем, як намуна гузошта истодаем. Ин як манбаи таъсирбахш барои ҷомеа аст." "Бо ин роҳ мо метавонем саъю кӯшиши умумиҷаҳонии омӯхтани SARS-CoV-2 бо мизбони он чӣ гуна ҳамкорӣ мекунад, дастгирӣ кунем." Даста умедвор аст, ки маълумоти ҷамъовардаи онҳо дар таҳияи доруҳои зидди вирусӣ кӯмак хоҳад кард.

Даста муяссар шуд, ки тадқиқотро дар як муддати бениҳоят кӯтоҳ сарфи назар аз шароити душвор таҳия кунад. "Нисфи ҷаҳон ва албатта Ҳейделберг ҳам дар ҳолати муҳосира қарор дошт ва мо маҷбур шудем, ки қариб ҳар рӯз ба вазъият мутобиқ шавем. Новобаста аз он ки дар EMBL ё аз хона, ҳама ба таври амиқ ҷалб карда шуданд ва саховатмандона вақти худро доданд. ва дониши амиқ," мегӯяд Шваб. "Суръате, ки мо кор кардем ва миқдори маълумоте, ки тавлид шуд, аҷиб аст."


Биологияи SARS-CoV-2

Ин силсилаи аниматсия аз се қисм биологияи вируси SARS-CoV-2-ро меомӯзад, ки боиси пандемияи глобалии бемории COVID-19 шудааст.

SARS-CoV-2 як қисми як оилаи вирусҳо мебошад, ки коронавирусҳо ном доранд. Аввалин аниматсия, Сироят, сохтори коронавирусҳоро ба монанди SARS-CoV-2 ва чӣ гуна онҳо ба одамон сироят мекунанд ва дар дохили ҳуҷайраҳо такрор мешаванд, тавсиф мекунад. Аниматсияи дуюм, Эволютсия, тавсиф мекунад, ки чӣ гуна ин вирусҳо таҳаввул мекунанд ва мутацияҳои мусбат, манфӣ ва нейтралиро муҳокима мекунанд. Аниматсия сеюм, Муайянкунӣ, усулҳоеро, ки барои ошкор кардани сироятҳои фаъол ва гузаштаи SARS-CoV-2 истифода мешаванд, тавсиф мекунад. Ин аниматсияҳо дар рӯйхати навозишҳои YouTube низ мавҷуданд.

Дар “Варақаҳои кории донишҷӯӣ” ҳамроҳшуда мафҳумҳо ва иттилооти аниматсияҳоро дар бар мегиранд. Варақаи кории "Версия 1" барои донишҷӯёни биологияи мактаби миёнаи умумӣ ва варақаи кории "Версия 2" барои биологияи AP/IB ва донишҷӯёни донишгоҳ мувофиқ аст.

Истиноди "Папкаи Google Папка" ба папкаи Google Drive ҳуҷҷатҳои захиравӣ дар формати Google Docs равона мекунад. На ҳама ҳуҷҷатҳои зеркашишавандаи манбаъ метавонанд дар ин формат дастрас бошанд. Ҷузвдони Google Drive ҳамчун "Танҳо Намоиш" таъин шудааст, то нусхаи ҳуҷҷати ин ҷузвдонро дар Google Drive захира кунед, он ҳуҷҷатро кушоед ва баъд Файл → "Нусхабардорӣ" -ро интихоб кунед. Ин ҳуҷҷатҳоро метавон тибқи Шартҳои истифода, ки дар қисмати "Тафсилот" дар зер оварда шудаанд, аз ҷумла кредити BioInteractive нусхабардорӣ, тағир додан ва паҳн кардан мумкин аст.

Варианти тавсифии аудиоии аниматсия тавассути плеери медиаи мо тавассути пахш кардани тугмаи "AD" дар кунҷи чапи поёни плеери медиа дастрас аст.

Ҳадафҳои омӯзиши донишҷӯён
  • Ҷузъҳои сохтории SARS-CoV-2-ро муайян кунед.
  • Қадамҳоро дар давраи репликатсияи SARS-CoV-2 тавсиф кунед.
  • Фаҳмонед, ки чӣ гуна мутатсияҳо дар геноми вирусӣ ба вуҷуд меоянд.
  • Тавсиф кунед, ки чӣ гуна вирус метавонад бо мурури замон аз сабаби мутатсия тағир ёбад.
  • Роҳҳои гуногуни ошкор кардани сирояти вирусиро нишон диҳед.
Тафсилот

антитело, антиген, COVID-19, коронавирус, лифофа, мутация, репликатсия, RT-PCR, SARS-CoV-2 (синдроми шадиди роҳи нафас coronavirus 2), протеини хӯша

Цуй, Цзе, Фанг Ли ва Чжэн-Ли Ши. "Пайдоиш ва эволютсияи коронавирусҳои патогенӣ." НатБаррасиҳои микробиология 17, 3 (2019): 181–192. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9.

Фер, Энтони Р. ва Стэнли Перлман. "Коронавирусҳо: Баррасии такрорӣ ва патогенези онҳо." Дар Коронавирусҳо: Усулҳо ва протоколҳо, таҳрир. Ҳелена Ҷ. Майер, Эрика Бикертон ва Пол Бирттон, 1–23. Ҷилди. 1282 аз Усулҳо дар биологияи молекулавӣ. Ню Йорк: Humana Press, 2015. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2438-7_1.

Хайланй, Рожгар А., Мухамад Сафдар, Мехмет Озаслан. "Хусусияти геномии романи SARS-CoV-2." Ҳисоботи ген 19 (2020): 100682. https://doi.org/10.1016/j.genrep.2020.100682.

Манбаъ дар асоси иҷозатномаи Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International иҷозатнома дорад. Ҳеҷ гуна ҳуқуқ барои истифодаи ном ё логотипи HHMI ё BioInteractive аз ин манбаъ ё дар ҳама гуна корҳои ҳосилшуда дода намешавад.


Давраи такрории SARS-CoV-2 дар 3D

Вақте ки пандемияи ҷаҳонии коронавирус идома дорад, олимон на танҳо кӯшиш мекунанд, ки ваксинаҳо ва доруҳоро барои мубориза бо он пайдо кунанд, балки пайваста дар бораи худи вирус маълумоти бештар гиранд. Ралф Бартеншлагер, профессори кафедраи бемориҳои сироятӣ, вирусологияи молекулавӣ дар Донишгоҳи Ҳейделберг: "Ҳоло мо метавонем интизор шавем, ки коронавирус мавсимӣ мешавад." "Ҳамин тавр, зарурати таҳия ва татбиқи стратегияҳои профилактикӣ ва табобатӣ алайҳи ин вирус вуҷуд дорад." Дар як таҳқиқоти нав, Бартеншлагер, ки бо кӯмаки гурӯҳи Schwab дар EMBL Heidelberg ва бо истифода аз Facility Core Microscopy Electron Microscopy EMBL, таҳлили муфассали тасвириро барои муайян кардани он, ки вирус ҳуҷайраҳои сироятшударо дубора барномарезӣ мекунад.

Ҳуҷайраҳое, ки аз SARS-CoV-2 сироят шудаанд, хеле зуд мемиранд, танҳо дар давоми 24 то 48 соат. Ин нишон медиҳад, ки вирус ба ҳуҷайраи инсон тавре зарар мерасонад, ки он дубора пайваст карда мешавад ва аслан маҷбур мешавад, ки насли вирусиро тавлид кунад. Аз ин рӯ, ҳадафи асосии лоиҳа муайян кардани тағироти морфологии дохили ҳуҷайра буд, ки ба ин барномасозӣ хосанд. "Таҳияи доруҳое, ки репликатсияи вирусҳо ва ба ин васила оқибати сироят, инчунин марги ҳуҷайраҳои ба вирус ба вуҷуд омадаро бозмедоранд, калиди фаҳмиши беҳтари механизмҳои биологии гардиши репликатсияи вирус аст" гуфт Бартеншлагер. Даста дастгоҳҳои тасвириро дар EMBL ва усулҳои муосири тасвириро барои муайян кардани меъмории 3D-и ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2 ва инчунин тағироти меъмории ҳуҷайра, ки аз вирус ба вуҷуд омадааст, истифода бурд.

Даста тавонист реконструксияи 3D-и тамоми ҳуҷайраҳо ва қисмҳои зерҳуҷайраҳои онҳоро эҷод кунад. Ралф Бартеншлагер шарҳ медиҳад: "Мо дар бораи тағироти сохтории бо вирус ба вуҷуд омада дар ҳуҷайраҳои инсони омӯхташуда фаҳмиши интиқодӣ медиҳем". Тасвирҳо тағироти ошкор ва оммавиро дар системаҳои эндомембрани ҳуҷайраҳои сироятшуда нишон доданд - системае, ки ба ҳуҷайра имкон медиҳад, ки қисмҳо ва маконҳои гуногунро муайян кунад. Вирус тағирёбии мембранаро тавре ба вуҷуд меорад, ки вай органеллҳои такрории худро тавлид кунад. Инҳо қисмҳои хурди такрорӣ мебошанд, ки дар он геноми вирусӣ ба таври назаррас афзоиш ёфтааст. Барои ин вирус сатҳҳои мембранаро талаб мекунад. Инҳо тавассути истифодаи системаи мембранаи ҳуҷайра ва эҷоди як органелл, ки намуди зоҳирии хеле равшан доранд, ба вуҷуд меоянд. Олимон онро ҳамчун ҷамъшавии зиёди футурҳо тавсиф мекунанд: ду қабати мембрана пуфаки калонро ташкил медиҳанд. Дар дохили ин пуфакҳо, ки як қисми хеле муҳофизатшавандаро ташкил медиҳанд, геномҳои вирусӣ афзоиш ёфта, ба зарраҳои нави вирус дохил мешаванд.

Ин тағироти аҷибро дар ҳуҷайраҳо танҳо чанд соат пас аз сироят дидан мумкин аст. "Мо дидем, ки вирус дар дохили ҳуҷайра чӣ гуна ва дар куҷо паҳн мешавад ва чӣ гуна он мошинҳои мизбони худро рабуда, пас аз афзоиш озод карда мешавад" мегӯяд Шваб. То ҳол дар бораи пайдоиш ва рушди таъсирҳое, ки SARS-CoV-2 дар бадани инсон ба вуҷуд меорад, маълумоти кам мавҷуд буд. Ин набудани дониш дар бораи механизме, ки тавассути он сироят ба марги ҳуҷайраҳои сироятшуда оварда мерасонад, дохил мешавад. Доштани ин маълумот ҳоло ба рушди терапевтҳо мусоидат хоҳад кард, ки такрори вирусро коҳиш медиҳад ва аз ин рӯ, шиддатнокии беморӣ.

Даста боварӣ ҳосил кардааст, ки маълумоти ҷамъовардашуда ва махсусан, анбори бесобиқаи иттилооти сохтории 3D дар бораи зерсохторҳои вирусӣ аз ҷониби ҳама метавонанд истифода шаванд. Янник Шваб мегӯяд: "Ман боварӣ дорам, ки мо дар бораи он, ки мо ҳама маълумотеро, ки мо бо ҷомеаи илмӣ таҳия кардаем, як намуна гузошта истодаем. Ин як манбаи таъсирбахш барои ҷомеа аст." "Бо ин роҳ мо метавонем саъю кӯшиши умумиҷаҳонии омӯхтани SARS-CoV-2 бо мизбони он чӣ гуна ҳамкорӣ мекунад, дастгирӣ кунем." Даста умедвор аст, ки маълумоти ҷамъовардаи онҳо дар таҳияи доруҳои зидди вирусӣ кӯмак хоҳад кард.

Даста муяссар шуд, ки тадқиқотро дар як муддати бениҳоят кӯтоҳ сарфи назар аз шароити душвор таҳия кунад. "Нисфи ҷаҳон - ва албатта, инчунин Ҳейделберг - дар ҳолати муҳосира қарор дошт ва мо маҷбур шудем, ки қариб ҳамарӯза ба вазъ мутобиқ шавем. Новобаста аз он ки дар EMBL ё аз хона, ҳама амиқ ҷалб карда шуданд ва саховатмандона вақт ва амиқ доданд. дониш, ”мегӯяд Шваб. "Суръате, ки мо кор кардем ва миқдори маълумоте, ки тавлид шуд, аҷиб аст."

Радди масъулият: AAAS ва EurekAlert! барои саҳеҳии хабарҳои дар EurekAlert интишоршуда масъул нестанд! аз ҷониби муассисаҳои саҳмгузор ё барои истифодаи ҳама гуна маълумот тавассути системаи EurekAlert.


Мундариҷа

Ҳангоми сар задани ибтидоӣ дар Вуҳани Чин, номҳои мухталиф барои вирус истифода мешуданд, баъзе номҳое, ки аз ҷониби манбаъҳои гуногун истифода мешуданд, аз ҷумла "коронавирус" ё "коронавируси Вуҳан". [25] [26] Моҳи январи соли 2020 Созмони Ҷаҳонии Беҳдошт "коронавируси нави 2019" (2019-nCov) [5] [27] -ро ҳамчун номи муваққатии вирус тавсия дод. Ин мувофиқи дастури ТУТ дар соли 2015 [28] зидди истифодаи маконҳои ҷуғрофӣ, намудҳои ҳайвонот ё гурӯҳҳои одамон дар номҳои беморӣ ва вирусҳо буд. [29] [30]

11 феврали соли 2020 Кумитаи байнулмилалии таксономияи вирусҳо номи расмии "Синдроми шадиди роҳи нафас coronavirus 2" (SARS‑CoV‑2)-ро қабул кард. [31] Барои роҳ надодан ба иштибоҳ бо бемории SARS, ТУТ баъзан SARS‑CoV‑2-ро дар иртибототи тандурустии ҷамъиятӣ ҳамчун "вируси COVID-19" номид [32] [33] ва номи HCoV-19 дар баъзе тадқиқотҳо дохил карда шудааст. мақолаҳо. [8] [9] [10]

Интиқоли SARS‑CoV‑2 аз одам ба одам 20 январи соли 2020 дар вақти пандемияи COVID-19 тасдиқ карда шуд. [15] [34] [35] [36] Дар аввал тахмин карда мешуд, ки интиқол асосан тавассути қатраҳои роҳи нафас аз сулфа ва атса дар масофаи тақрибан 1,8 метр (6 фут) рух медиҳад. [37] [38] Таҷрибаҳои парокандакунии нури лазерӣ нишон медиҳанд, ки суханронӣ як усули иловагии интиқол [39] [40] ва дурдаст [41] ва камтаҳқиқшуда [42] дар дохили бино бо ҷараёни ками ҳаво мебошад. [43] [44] Тадқиқотҳои дигар пешниҳод карданд, ки вирус метавонад тавассути ҳаво низ бошад ва аэрозолҳо эҳтимолан вирусро интиқол диҳанд. [45] [46] [47] Ҳангоми интиқоли одам ба одам, ба ҳисоби миёна 1000 вируси сироятии SARS-CoV-2 сирояти навро оғоз мекунад. [48] ​​[49]

Алоқаи ғайримустақим тавассути сатҳи олудашуда сабаби дигари эҳтимолии сироят мебошад. [50] Тадқиқоти пешакӣ нишон медиҳад, ки вирус метавонад дар пластикӣ (полипропилен) ва пӯлоди зангногир (AISI 304) то се рӯз қобили ҳаёт боқӣ монад, аммо дар картон зиёда аз як рӯз ё дар мис зиёда аз чор соат зинда намемонад [50] 10] вирус тавассути собун ғайрифаъол карда мешавад, ки ду қабати липидҳои онро ноустувор мекунад. [51] [52] РНК-и вирусӣ инчунин дар намунаҳои наҷосат ва нутфа аз шахсони сироятшуда пайдо шудааст. [53] [54]

Дараҷаи сироятӣ будани вирус дар давраи инкубатсия номуайян аст, аммо тадқиқот нишон дод, ки ҳалқ тақрибан чор рӯз пас аз сироят [55] [56] ё ҳафтаи аввали нишонаҳо ба авҷи вирусӣ мерасад ва пас аз он коҳиш меёбад. [57] Давомнокии рехтани РНК SARS-CoV-2 одатан аз 3 то 46 рӯз пас аз фарорасии нишона аст. [58]

Тадқиқоти як гурӯҳи муҳаққиқон аз Донишгоҳи Каролинаи Шимолӣ нишон дод, ки пуфаки бинӣ ба назар макони бартаридошта барои сироят ва паҳншавии минбаъдаи вирус ба шуш дар патогенези SARS-CoV-2 мебошад. [59] Онҳо дарёфтанд, ки градиенти сироятӣ аз баланд дар проксималӣ ба паст дар фарҳангҳои эпителиалии дисталии шуш мавҷуд аст, бо сирояти фокусӣ дар ҳуҷайраҳои кирпикшакл ва пневмоцитҳои навъи 2 дар роҳи нафас ва минтақаҳои алвеолярӣ мутаносибан. [59]

Баъзе далелҳои интиқоли SARS‑CoV‑2 аз одам ба ҳайвон, аз ҷумла мисолҳо дар фелидҳо мавҷуданд. [60] [61] Баъзе муассисаҳо ба шахсони мубталои SARS‑CoV‑2 тавсия додаанд, ки тамос бо ҳайвонотро маҳдуд кунанд. [62] [63]

Интиқоли асимптоматикӣ

1 феврали соли 2020 Созмони Умумиҷаҳонии Тандурустӣ (ТУТ) нишон дод, ки "интиқол аз ҳолатҳои асимптоматикӣ эҳтимолан омили асосии интиқол нест". [64] Як таҳлили мета-таҳлил нишон дод, ки 17% сироятҳо асимптоматикӣ мебошанд ва шахсони асимптоматикӣ 42% эҳтимоли интиқоли вирус камтар буданд. [65]

Аммо, як модели эпидемиологии оғози авҷ дар Чин пешниҳод кард, ки "резиши пеш аз симптоматикӣ метавонад дар байни сироятҳои ҳуҷҷатшуда хос бошад" ва сироятҳои субклиникӣ манбаи аксарияти сироятҳо шуда метавонанд. [66] Ин метавонад тавзеҳ диҳад, ки чӣ гуна аз 217 лайнери круизӣ, ки дар Монтевидео ҷойгир буд, танҳо 24 нафар аз 128 нафаре, ки барои РНК вирусӣ санҷида шудаанд, аломатҳо нишон доданд. [67] Ба ҳамин монанд, як таҳқиқоти наваду чаҳор беморони дар моҳҳои январ ва феврали соли 2020 дар беморхона бистарӣшуда беморон тахмин задаанд, ки миқдори зиёди вирусро ду то се рӯз пеш аз пайдо шудани нишонаҳо мерезанд ва "қисми зиёди интиқол эҳтимол пеш аз нишонаҳои аввал дар ҳолати индекс рух додааст. ". [68]

Реинфексия

Дар бораи сирояти дубора ва иммунитети дарозмуддат номуайянӣ вуҷуд дорад. [69] Маълум нест, ки сирояти такрорӣ то чӣ андоза маъмул аст, аммо гузоришҳо нишон медиҳанд, ки он бо шиддати тағйирёбанда рух медиҳад. [69]

Аввалин ҳодисаи сирояти дубора ба қайд гирифташуда як марди 33-сола аз Ҳонконг буд, ки бори аввал 26 марти соли 2020 мусбат санҷида, 15 апрели соли 2020 пас аз ду санҷиши манфӣ озод карда шуд ва 15 августи соли 2020 дубора мусбат санҷида шуд (баъди 142 рӯз) , ки бо пайдарпаии пурраи геном тасдиқ карда шуд, ки нишон медиҳад, ки геномҳои вирусии байни эпизодҳо ба синфҳои гуногун тааллуқ доранд. [70] Бозёфтҳо чунин маъно доранд, ки масунияти гала метавонад вирусро нест кунад, агар сирояти такрорӣ як ҳодисаи ғайриоддӣ набошад ва ваксинаҳо наметавонанд муҳофизати якумрӣ аз вирусро таъмин кунанд. [70]

Тадқиқоти дигари мисол як марди 25-сола аз Невадаро тавсиф кард, ки 18 апрели соли 2020 ва 5 июни соли 2020 барои SARS‑CoV‑2 мусбатро санҷидааст (бо ду санҷиши манфӣ ҷудо карда шудааст). Азбаски таҳлилҳои геномӣ фарқиятҳои назарраси генетикиро байни варианти SARS‑CoV‑2, ки дар ин ду сана интихоб шудаанд, нишон доданд, муаллифони таҳқиқот муайян карданд, ки ин сирояти дубора аст. [71] Сирояти дуюми мард нисбат ба сирояти аввал симптоматикӣ шадидтар буд, аммо механизмҳое, ки метавонанд инро ҳисоб кунанд, маълум нест. [71]

Аввалин сироятҳои маълум аз SARS‑CoV‑2 дар Вуҳани Чин кашф шудаанд.[17] Сарчашмаи аслии интиқоли вирус ба одамон, инчунин маълум нест, ки вирус пеш аз паҳншавӣ ё пас аз паҳншавӣ патогенӣ шудааст. [19] [72] [9] Азбаски бисёре аз мубталоёни ибтидоӣ коргарони бозори баҳрии Ҳуанан буданд, [73] [74] тахмин зада мешавад, ки вирус шояд аз бозор пайдо шуда бошад. [9] [75] Бо вуҷуди ин, таҳқиқоти дигар нишон медиҳанд, ки меҳмонон шояд вирусро ба бозор ворид карда бошанд, ки пас аз он ба густариши босуръати сироятҳо мусоидат кард. [19] [76] Гузориши ТУТ дар моҳи марти соли 2021 дар бораи як таҳқиқоти муштараки ТУТ ва Чин изҳор дошт, ки паҳншавии одамон тавассути мизбони ҳайвони мобайнӣ шарҳи эҳтимолӣ аст ва эҳтимоли бештари он паҳншавии мустақим аз кӯршапаракҳо мебошад. Муқаддима тавассути занҷири таъминоти озуқаворӣ ва бозори баҳрии Ҳуанан як тавзеҳи дигари имконпазир, аммо эҳтимоли камтар ҳисобида мешуд. [77]

Сатҳи мутатсия, ки аз ҳолатҳои аввали SARS-CoV-2 ҳисоб карда шудааст, 6,54 × 10 -4 дар як сайт дар як сол буд. [77] Эволютсияи вирусии он тавассути қобилияти хондани RNA-и мошини такрории он суст мешавад. [78]

Тадқиқот дар обанбори табиии вирус, ки боиси сар задани SARS дар солҳои 2002-2004 гардид, боиси кашфи бисёр коронавирусҳои ба SARS монанд гардид, ки аксари онҳо дар Ринолофус ҷинси наъл. Таҳлили филогенетикӣ нишон медиҳад, ки намунаҳо аз Rhinolophus sinicus шабеҳи 80% ба SARS‑CoV‑2 нишон медиҳад. [79] [80] [81] Таҳлили филогенетикӣ инчунин нишон медиҳад, ки вирус аз Rhinolophus affinis, ки дар музофоти Юннан ҷамъоварӣ шудааст ва RaTG13 таъин шудааст, 96% ба SARS‑CoV‑2 шабоҳат дорад. [17] [82] пайдарпаии вируси RaTG13 наздиктарин пайдарпаии маълум ба SARS-CoV-2 мебошад. [77] Дигар пайдарпаии бо ҳам алоқаманд низ дар намунаҳо аз популятсияи гурбаҳои маҳаллӣ муайян карда шуданд. [83]

Кӯршапаракҳо обанбори эҳтимолии табиии SARS‑CoV‑2 ҳисобида мешаванд, [84] [85], аммо фарқияти байни коронавируси куршашпарак ва SARS‑CoV‑2 аз он шаҳодат медиҳад, ки одамон тавассути мизбони мобайнӣ сироят шудаанд [75], гарчанде манбаи воридшавӣ ба одамон маълум нест. [86]

Гарчанде ки нақши панголинҳо ҳамчун мизбони мобайнӣ дар ибтидо гузошта шуда буд (таҳқиқоте, ки дар моҳи июли соли 2020 нашр шудааст, нишон дод, ки панголинҳо як мизбони мобайнии коронавирусҳои ба SARS‑CoV‑2 монанданд [87] [88]), таҳқиқоти минбаъда саҳми онҳоро тасдиқ накарданд. ба пошидан. [77] Далелҳо алайҳи ин фарзия аз он иборатанд, ки намунаҳои вируси панголин аз SARS-CoV-2 хеле дуранд: изолятҳое, ки аз панголинҳои дар Гуандун мусодирашуда гирифта шудаанд, танҳо 92% дар пайдарпай ба геноми SARS-CoV-2 шабеҳ буданд. Илова бар ин, сарфи назар аз шабоҳатҳо дар якчанд аминокислотаҳои муҳими, [89] намунаҳои вируси панголин ба ретсептори ACE2-и инсон алоқамандии заиф доранд. [90]

SARS‑CoV‑2 ба оилаи васеи вирусҳо тааллуқ дорад, ки бо номи коронавирусҳо маъруфанд. [26] Он як вируси якқатораи РНК (+ssRNA) дорои ҳисси мусбат буда, сегменти ягонаи РНК дорад. Коронавирусҳо одамон, дигар ширхӯрон ва намудҳои парранда, аз ҷумла чорво ва ҳайвоноти ҳамроҳро сироят мекунанд. [91] Коронавирусҳои инсон қодиранд, ки бемориҳоро аз сармои маъмулӣ то бемориҳои шадидтар ба монанди синдроми роҳи нафасии Ховари Миёна (MERS, сатҳи фавт) ба вуҷуд оранд.

34%). SARS-CoV-2 пас аз 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV ва аслии SARS-CoV, ҳафтумин коронавируси маълум аст, ки ба одамон сироят мекунад. [92]

Мисли коронавируси марбут ба SARS, ки дар сар задани SARS дар соли 2003 алоқаманд аст, SARS‑CoV‑2 узви зерҷинс мебошад Сарбековирус (насади бета-CoV B). [93] [94] Коронавирусҳо низ зуд-зуд рекомбинатсия мешаванд. [95] пайдарпаии РНК-и он тақрибан 30,000 асос аст, [96] барои коронавирус нисбатан дароз аст (ки дар навбати худ дар байни ҳама оилаҳои РНК бузургтарин геномҳоро дорад) [97] Геномии он тақрибан пурра аз пайдарпаии рамзгузории сафедаҳо иборат аст, ки як хислат аст. бо дигар коронавирусҳо мубодила карда мешавад. [95]

Хусусияти фарқкунандаи SARS‑CoV‑2 дохилшавии макони полибазивии аз фурин ҷудошуда мебошад, [89], ки як унсури муҳими баланд бардоштани вируснокии он ба назар мерасад. [98] Фурин протеаза пайдарпаии пептидҳои каноникии RX[R/K]R↓X-ро эътироф мекунад, ки дар он макони тақсимшавӣ бо тирчаи поён нишон дода шудааст ва X ягон кислотаи аминокислота аст. [99] [100] Дар SARS-CoV-2 макони шинохтан аз ҷониби пайдарпаии нуклеотиди 12 кодон CCT CGG CGG GCA, ки ба пайдарпаии аминокислотаҳои PRRA мувофиқ аст, ташкил карда мешавад. [101] Ин пайдарпаӣ дар болооби аргинин ва серин ҷойгир аст, ки макони ҷудошавии S1/S2 (PRRAR↓S)-и сафедаи хӯшаро ташкил медиҳад. [102] Гарчанде ки чунин сайтҳо як хусусияти маъмули табиии дигар вирусҳо мебошанд, [101] аз ҷумла баъзе аъзоёни генуси Beta-CoV ва дигар наслҳои коронавирусҳо, [103] SARS-Cov-2 дар байни аъзоёни зерҷинси он беназир аст. барои чунин сайт. [89]

Маълумот дар бораи пайдарпайии генетикии вирусҳо метавонад маълумоти муҳимро дар бораи он, ки оё вирусҳои аз рӯи вақт ва фазо ҷудошуда аз ҷиҳати эпидемиологӣ алоқаманданд, пешниҳод кунанд. [104] Бо миқдори кофии геномҳои пайдарпай, имкон дорад, ки дарахти филогенетикии таърихи мутатсияҳои як оилаи вирусҳоро барқарор кард. То 12 январи соли 2020, панҷ геноми SARS-CoV-2 аз Вуҳан ҷудо карда шуд ва аз ҷониби Маркази Чин оид ба назорат ва пешгирии бемориҳо (CCDC) ва дигар муассисаҳо гузориш дода шуд [96] [105] шумораи геномҳо ба 42 то 30 адад афзоиш ёфт. Январи соли 2020. [106] Таҳлили филогенетикии он намунаҳо нишон дод, ки онҳо "бо ҳадди аксар ҳафт мутатсия нисбат ба аҷдоди умумӣ алоқамандии зиёд доштанд" ва ин маънои онро дорад, ки аввалин сирояти инсон дар моҳи ноябр ё декабри соли 2019 рух додааст. [106] Баррасии топология. Дарахти филогенетикӣ дар оғози пандемия низ байни изолятсияҳои инсон шабоҳатҳои зиёд пайдо карданд. [107] То 7 майи соли 2020, [навсозӣ] 4,690 геноми SARS-CoV-2, ки дар шаш қитъа намуна гирифта шудааст, дастраси омма буданд. [108] [ равшанӣ лозим аст ]

11 феврали соли 2020 Кумитаи байнулмилалии таксономияи вирусҳо эълон кард, ки тибқи қоидаҳои мавҷуда, ки муносибатҳои иерархӣ байни коронавирусҳоро дар асоси панҷ пайдарпаии нигоҳдошташудаи кислотаҳои нуклеинӣ ҳисоб мекунанд, фарқияти байни он чизе, ки он вақт 2019-nCoV номида мешуд ва вирус аз SARS дар соли 2003 буд. сар задани онҳо барои намудҳои алоҳидаи вирусҳо нокифоя буд. Аз ин рӯ, онҳо 2019-nCoV-ро ҳамчун як вирус муайян карданд Синдроми шадиди роҳи нафас, ки бо коронавирус алоқаманд аст. [109]

Дар моҳи июли соли 2020 олимон гузориш доданд, ки як варианти сироятии SARS‑CoV‑2 бо варианти сафедаи хушаи G614 D614-ро ҳамчун шакли бартаридошта дар пандемия иваз кардааст. [110] [111]

Геномҳо ва зергеномҳои коронавирус шаш чаҳорчӯбаи хониши кушодро (ORFs) рамзгузорӣ мекунанд. [112] Дар моҳи октябри соли 2020 муҳаққиқон як гени эҳтимолии такроршавандаро кашф карданд, ки ном дорад ORF3d, дар геноми SARS‑CoV‑2. Маълум нест, ки протеин аз ҷониби ORF3d ягон вазифа дорад, аммо он вокуниши сахти иммуниро ба вуҷуд меорад. ORF3d қаблан дар як варианти коронавирус, ки панголинҳоро сироят мекунад, муайян карда шуда буд. [113] [114]

Дарахти филогенетикӣ

Дарахти филогенетикӣ дар асоси пайдарпайии тамоми геноми SARS-CoV-2 ва коронавирусҳои алоқаманд ин аст: [115] [116] [117]

Панголин SARSr-COV-GX, 89% ба SARS-COV-2, Манис Яваника, Аз Осиёи Чануби Шаркй кашонда оварда шудааст [120]

Панголин SARSr-COV-GD, 91% ба SARS-COV-2, Манис Яваника, Аз Осиёи Чануби Шаркй кашонда оварда шудааст [121]

Вариантҳо

Ҳазорҳо вариантҳои SARS-CoV-2 мавҷуданд, ки онҳоро метавон ба синфҳои калонтар гурӯҳбандӣ кард. [123] Якчанд номенклатураҳои гуногуни кладӣ пешниҳод шудаанд. Nextstrain вариантҳоро ба панҷ синф (19A, 19B, 20A, 20B ва 20C) тақсим мекунад, дар ҳоле ки GISAID онҳоро ба ҳафт тақсим мекунад (L, O, V, S, G, GH ва GR). [124]

Якчанд вариантҳои намоёни SARS-CoV-2 дар охири соли 2020 пайдо шуданд. Созмони Ҷаҳонии Беҳдошт дар айни замон чаҳор варианти нигаронкунандаро эълон кардааст, ки инҳоянд: [125]

  • Алфа: Lineage B.1.1.7 дар Британияи Кабир моҳи сентябри соли 2020 бо далели афзоиши интиқол ва вирусият пайдо шуд. Мутацияҳои намоён N501Y ва P681H мебошанд.
    • Мутацияи E484K дар баъзе вирионҳои насли B.1.1.7 қайд карда шудааст ва аз ҷониби муассисаҳои гуногуни тандурустии ҷамъиятӣ низ пайгирӣ карда мешавад.

    Дигар вариантҳои намоён 6 варианти дигари аз ҷониби ТУТ мавриди таҳқиқ қарордошта ва Кластери 5-ро дар бар мегиранд, ки дар байни норкаҳо дар Демарк ба вуҷуд омадаанд ва дар натиҷа маъракаи эвтаназияи норка, ки онро амалан аз байн бурданд. [126]

    Сохтор

    Ҳар як вируси SARS-CoV-2 диаметри 50-200 нанометр аст. [74] Мисли дигар коронавирусҳо, SARS-CoV-2 дорои чор сафедаи сохторӣ мебошад, ки бо номи S (хӯша), E (лифофа), M (мембрана) ва N (нуклеокапсид) сафедаҳои N геноми РНК-ро нигоҳ медорад ва сафедаҳои S, E ва M якҷоя лифофаи вирусиро эҷод мекунанд. [127] Протеинҳои Coronavirus S гликопротеинҳо мебошанд, ки ба ду қисми функсионалӣ (S1 ва S2) тақсим мешаванд. [91] Дар SARS-CoV-2, протеини хӯшае, ки бо истифода аз микроскопияи электронии криогенӣ дар сатҳи атом тасвир шудааст, [128] [129] протеинест, ки барои пайваст шудан ва пайвастани вирус бо мембранаи ҳуҷайра масъул аст. ҳуҷайраи мизбон [127] махсусан, зербахши S1 он замима, синтези зербахши S2-ро катализ мекунад. [130]

    Геном

    SARS-CoV-2 дорои як геноми якқатораи РНК-и хаттӣ, ҳисси мусбӣ ва дарозии тақрибан 30,000 асос мебошад. [91] Геномии он ба мисли дигар коронавирусҳо бар зидди цитозин (С) ва гуанин (G) нуклеотидҳо дорад. [131] Геном дорои таркиби баландтарини U (32,2%), пас аз он A (29,9%) ва таркиби шабеҳи G (19,6%) ва C (18,3%) мебошад. [132] Тағйирёбии нуклеотидҳо аз мутатсияи гуанинҳо ва ситозинҳо ба аденозинҳо ва урацилҳо ба вуҷуд меояд. [133] Тахмин меравад, ки мутатсияи динуклеотидҳои CG барои пешгирӣ кардани механизми муҳофизати сафедаи антивирусии ангушти руҳ ба ҳуҷайраҳо, [134] ва кам кардани энергия барои ҷудо кардани геном ҳангоми репликатсия ва тарҷума (ҷуфти пойгоҳи аденозин ва урацил тавассути ду гидроген) пайвандҳо, ситозин ва гуанин тавассути се). [133] Камшавии динуклеотидҳои CG дар геноми он боиси он гардид, ки вирус дар истифодаи кодон як ғарази намоён дошта бошад. Масалан, шаш кодонҳои гуногуни аргинин дорои кодонҳои нисбии синоними AGA (2.67), CGU (1.46), AGG (.81), CGC (.58), CGA (.29) ва CGG (.19) мебошанд. [132] Тамоюли шабеҳи истифодаи кодон дар дигар коронавирусҳои марбут ба SARS дида мешавад. [135]

    Давраи такрорӣ

    Сироятҳои вирусӣ вақте оғоз мешаванд, ки зарраҳои вирусӣ ба ретсепторҳои рӯизаминии ҳуҷайра пайваст мешаванд. [136] Таҷрибаҳои моделсозии сафеда дар протеини хӯшаи вирус ба зудӣ нишон доданд, ки SARS‑CoV‑2 ба ретсептори ферменти табдилдиҳандаи ангиотензин 2 (ACE2) дар ҳуҷайраҳои инсон наздикии кофӣ дорад, то онҳоро ҳамчун механизми воридшавии ҳуҷайра истифода барад. [137] То 22 январи соли 2020, гурӯҳе дар Чин бо геноми пурраи вирус кор мекунанд ва гурӯҳе дар Иёлоти Муттаҳида бо истифода аз усулҳои генетикии баръакс мустақилона ва таҷрибавӣ нишон доданд, ки ACE2 метавонад ҳамчун ресептор барои SARS-CoV-2 амал кунад. [17] [138] [139] [140] Таҳқиқотҳо нишон доданд, ки SARS‑CoV‑2 нисбат ба вируси аслии SARS наздикии бештар ба ACE2-и инсонӣ дорад. [128] [141] SARS‑CoV‑2 инчунин метавонад basigin-ро барои кӯмак дар вуруди ҳуҷайра истифода барад. [142]

    Пешниҳоди ибтидоии сафедаи хӯша тавассути протеазаи трансмембранӣ, серин 2 (TMPRSS2) барои ворид шудани SARS-CoV-2 муҳим аст. [23] Протеини мизбон нейропилин 1 (NRP1) метавонад ба вирус дар воридшавии ҳуҷайраи мизбон бо истифода аз ACE2 кӯмак кунад. [143] Пас аз пайваст шудани вирион SARS‑CoV‑2 ба ҳуҷайраи мавриди ҳадаф, TMPRSS2-и ҳуҷайра протеини хӯшаи вирусро мекушояд ва пептиди синтезро дар зербахши S2 ва ресептори мизбон ACE2 фош мекунад. [130] Пас аз синтез, эндосома дар атрофи вирион пайдо шуда, онро аз боқимондаи ҳуҷайраи мизбон ҷудо мекунад. Вақте ки рН-и эндосома паст мешавад ё вақте ки катепсин, протеази систеин мизбон онро пора мекунад, вирион хориҷ мешавад. [130] Сипас вирион РНК-ро ба ҳуҷайра мебарорад ва ҳуҷайраро маҷбур мекунад, ки нусхаҳои вирусро тавлид ва паҳн кунад, ки ҳуҷайраҳои бештарро сироят мекунанд. [144]

    SARS‑CoV‑2 ҳадди аққал се омили вирулентиро ба вуҷуд меорад, ки ба рехтани вирионҳои нав аз ҳуҷайраҳои мизбон мусоидат мекунанд ва аксуламали иммуниро боздоранд. [127] Новобаста аз он ки онҳо танзими пасти ACE2-ро дар бар мегиранд, тавре ки дар коронавирусҳои шабеҳ дида мешавад, таҳти таҳқиқ қарор дорад (то моҳи майи соли 2020). [145]

    Бар асоси тағирёбии пасти байни пайдарпаии геномии маълуми SARS‑CoV‑2, мақомоти тандурустӣ эҳтимолан вирусро дар давоми ҳафтаҳои пайдоиши он дар байни аҳолии инсонӣ дар охири соли 2019 ошкор карданд. [19] [146] Аввалин ҳодисаи сироятёбӣ, ки ҳоло маълум аст, санаи муайян дорад. то 1 декабри соли 2019, гарчанде ки як парвандаи қаблӣ метавонист 17 ноябри соли 2019 рух диҳад. [147] [148] Сар задани пандемия аз рӯи таҳлили tMRCA тахмин карда шуд, ки то охири моҳи декабри соли 2019 рух додааст, аммо ин хулосаи оморӣ далели қатъӣ намедиҳад. замони пайдоиш. [77] Вирус баъдан ба тамоми музофотҳои Чин ва ба зиёда аз 150 кишвари дигар дар саросари ҷаҳон паҳн шуд. [149] Дар ҳамаи ин минтақаҳо интиқоли вирус аз одам ба одам тасдиқ шудааст. [150] 30 январи соли 2020, SARS‑CoV‑2 аз ҷониби ТУТ ҳолати изтирории тандурустии ҷамъиятии дорои аҳамияти байналмилалӣ таъин карда шуд, [151] [12] ва 11 марти соли 2020 ТУТ онро пандемия эълон кард. [13] [152]

    Санҷишҳои ретроспективӣ, ки дар дохили системаи назоратии Чин ҷамъоварӣ шудаанд, ҳеҷ нишонаи равшани гардиши назарраси эътирофнашудаи SARS-CoV-2 дар Вуҳанро дар давоми нимаи охири соли 2019 ошкор накарданд. [153]

    Мета-таҳлил аз моҳи ноябри соли 2020 рақами асосии такрористеҳсоли вирусро ( R 0 > ) аз 2,39 то 3,44 тахмин кардааст. [20] Ин маънои онро дорад, ки ҳар як сироят аз вирус боиси 2,39 то 3,44 сирояти нав мешавад, вақте ки ҳеҷ як аъзои ҷомеа эмин нестанд ва чораҳои пешгирикунанда андешида намешаванд. Шумораи такрористеҳсолкунӣ метавонад дар шароити сераҳолӣ зиёдтар бошад, ба монанди онҳое, ки дар киштиҳои круизӣ мавҷуданд. [154] Шаклҳои зиёди кӯшишҳои пешгирикунанда метавонанд дар ҳолатҳои мушаххас барои кам кардани паҳншавии вирус истифода шаванд. [112]

    Тақрибан 96,000 ҳолати тасдиқшудаи сироят дар материкии Чин ба қайд гирифта шудааст. [149] Дар ҳоле ки таносуби сироятҳое, ки ба ҳолатҳои тасдиқшуда ё пешрафт ба бемории ташхисшаванда оварда мерасонанд, норавшан боқӣ мемонад, [155] як модели математикӣ тахмин кардааст, ки танҳо дар Вуҳан 75,815 нафар дар 25 январи соли 2020, дар ҳоле, ки шумораи ҳолатҳои тасдиқшуда ба қайд гирифта шудааст. дар саросари ҷаҳон танҳо 2,015 буд. [156] То 24 феврали соли 2020, беш аз 95% фавт аз COVID-19 дар саросари ҷаҳон дар музофоти Ҳубей, ки дар он ҷо Вуҳан ҷойгир аст, рух додааст. [157] [158] То 20 июни соли 2021, фоиз то 0,083% коҳиш ёфт. [149]

    То 20 июни соли 2021, дар пандемияи давомдор 178,333,628 ҳолати умумии сирояти SARS-CoV-2 тасдиқ шудааст. [149] Шумораи умумии фавтидагон аз вирус 3,862,271 нафарро ташкил медиҳад. [149]


    Мавод ва усул

    Ҳайвонот ва хатҳои ҳуҷайра

    ICR-и занона, мушҳои hACE2, 6-8 ҳафта, аз Маркази ҳайвоноти таҷрибавии тиббии Академияи илмҳои тиббии Чин (Пекин, Чин) харида шудаанд. Ин ҳайвонҳо дар муассисаҳои ҳайвоноти Академияи илмҳои тиббии Чин дар шароити мушаххас аз патогенҳо нигоҳ дошта мешуданд. Тадқиқотҳои ҳайвонот бо штамм SARS-CoV-2 WH-09 дар як муассисаи сатҳи 3 бехатарии биологии ҳайвонот (BASL3) бо истифода аз изоляторҳои филтршудаи HEPA анҷом дода шуданд ва ин тартибҳо аз ҷониби Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти институтсионалӣ (Рақами протоколи IACUC: ZH20005) тасдиқ карда шуданд. Институти ҳайвоноти лабораторӣ, Коллеҷи тиббии Пекин (BLL20001). Тадқиқоти муррин бидуни сирояти вирусӣ аз ҷониби Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи ҳайвоноти Академияи илмҳои тиббии Чин тасдиқ карда шудааст. Хатти ҳуҷайраҳои макрофагҳои муррин Raw264.7, хати ҳуҷайраҳои моноцитҳои инсон THP-1 ва ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои маймун - Vero E6 аз Маркази ҷамъоварии фарҳанги навъи Чин (Пекин, Чин) харида шудаанд ва дар муҳити DMEM ё RPMI-1640 парвариш карда шудаанд ( Gibco, ИМА) бо 10% FBS.

    Реактивхо

    Хлорокин, Z-VAD-FMK, Жасплакинолид, Липополисахаридҳо ва Цитохалазин D аз Sigma-Oldrich (MO, ИМА) харида шудаанд. Мурини рекомбинатии IL-4, IFN-γ ва рекомбинати инсон IL-4, IFN-γ аз PeproTech (NJ, ИМА) харида шудаанд. Липосомаҳои клодронат аз FormuMax (CA, ИМА) харида шудаанд. Latrunculin A аз Millipore (MA, ИМА) харида шудааст.

    Ҷудокунии макрофагҳои ибтидоии алвеолярӣ ва ҳуҷайраҳои эпителиалии навъи II

    Макрофагҳои ибтидоии алвеолярӣ аз моеъи шустани бронхоалвеолярии мурӣ (BALF) ҷудо карда шуданд. Ба таври мухтасар, мушҳо фавран пеш аз шустан наркоз карда шуданд ва трахея ҷудо карда шуд. Шушҳо панҷ маротиба бо 1 мл PBS шуста шуданд ва BALF нигоҳ дошташуда дар 600 × центрифуга карда шуд. г барои 5 дақиқа дар 4 ° C. Пелети ҷамъовардашуда дар муҳити мукаммали RPMI 1640 дубора боздошта шуд ва дар табақи фарҳангӣ барои 2 соат инкубатсия карда шуд. Пас аз 2 соат, ҳуҷайраҳои ғайрифаъол бо шустани нарм бо PBS хориҷ карда шуданд. Ҳуҷайраҳои эпителиалии ибтидоии алвеолярӣ (AT2) аз мушҳои hACE2, тавре ки қаблан гузориш дода шуда буд, ҷудо карда шуданд 45 . Ба таври мухтасар, мушҳо бо 10 мл PBS хунук тавассути меъдачаи рост перфузия карда шуданд. Пеш аз он ки бофтаҳои шуш бо диспази 2 мл дар 37 °C барои 20 дақиқа инкубатсия карда шаванд, шушҳо бо диспази 2 мл (BD Bioscience, ИМА) ва агарозаи ҳарорати пасти гелӣ (Сигма Олдрих, ИМА) пур карда шуданд. Сипас, бофтаҳои шуш молида шуданд ва шлам тавассути торҳои нейлонии 70-мкм ва 40-мкм (JETBIOFIL, Чин) филтр карда шуд. Суспензияи ҳуҷайра бо анти-CD45 (Biolegend, clone 30-F11, Cat. 103104), анти-CD16/32 (BD Pharmingen™, клон 2.4G2, Кат. 553143), анти-CD31 (Bioleg143) инкуб карда шуд. .3, кат. 102504), зидди TER119 (Biolegend, клон TER119, кат. 116104) ва анти-CD104 (Biolegend, клон 346-11A, кат. 12603) антитело дар 4 °C барои 30 дақиқа ва баъд аз Dynabe Маҳтобҳои магнитии TM стрептавидин T1 (Thermo Fisher Scientific, кат. 65601) ба таваққуфи ҳуҷайра илова карда шуд, то лейкоцитҳо, моноситҳо/макрофагҳо, ҳуҷайраҳои NK, нейтрофилҳо, ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ ва ҳуҷайраҳои эритроидро истисно кунанд. Интихоби манфии фибробластҳо тавассути пайвастшавӣ ба плитаҳои пластикии пӯшидашуда анҷом дода шуд. Тозагии ҳуҷайра ба таври мунтазам тавассути цитометрияи ҷараён арзёбӣ карда шуд.

    Иммунофлуоресцент

    Ҳуҷайраҳо дар 4% параформальдегид собит карда шуданд ва бо 0,2% Triton X-100 гузаранда шуданд. Ҳуҷайраҳои собит дар 5% BSA маҳкам карда шуданд ва бо протеини зидди Lamp2 (Abcam, Кат. ab25339, 1:200) протеини нуклеокапсиди SARS (Abcam, Кат. Ab273434, 1:200), зидди Rab7 (Abcam,) инкубатсия карда шуданд. Кат. ab137029, 1:200) антитело ё антитело зидди Rab5 (Abcam, Кат. ab18211, 1:200) дар 4 °C шабона, ҳуҷайраҳо шуста шуданд ва бо антителоҳои дуюмдараҷа барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд. Ниҳоят, слайдҳо бо DAPI муқоиса карда шуданд ва барои таҳлили конфокалӣ насб карда шуданд. Шиддати иммунофлуоресцент тавассути нармафзори Image J 9.0 таҳлил карда шуд.

    Рангҳои гистологӣ ва иммуногистохимикӣ

    Бофтаҳои шуши мушҳо дар 10% формалин ҷойгир карда шуда, дар парафин ҷойгир карда шуданд ва барои ранг кардани H&E қисмҳо ҷудо карда шуданд. Тибқи тағйироти морфологӣ пас аз сирояти SARS-CoV-2, бофтаҳои шуш сабук (1), миёна (2), вазнин (3) ё ба ҳаёт таҳдидкунанда (4) баҳогузорӣ карда шуданд. Мутахассиси патологӣ, ки аз озмоиш нобино буд, дар асоси инфилтратсияи ҳуҷайраҳои илтиҳобӣ, пневмонияи паренхималӣ, хунравии алвеолярӣ ва экссудати люминалӣ/бронхиалӣ ё алвеолярӣ баҳо дод.Рангкунии иммуногистохимикӣ тибқи протоколе, ки қаблан тавсиф шудааст 46 анҷом дода шуд. Хулоса, қисмҳои бофтаҳои бо парафин ҷойгиршуда бо анти-F4/80 (Santa Cruz Biotechnology, Кат. SC-52664, 1:500) антитело, анти-муцин 1 (1:200, Abcam, Кат. ab45167) инкубатсия карда шуданд. , зидди муцин 5a (1:200, Abcam, Кат. ab24071), зидди муцин 5b (1:200, Abcam, Кат. ab77995) ё протеини зидди нуклеокапсиди SARS (Abcam, Кат. ab273434, 1:1000) антитело шабона дар ҳарорати 4 ° C. Пас аз он, слайдҳо пайдарпай бо ду антителоҳои дуюмдараҷаи бо HRP пайвастшуда барои 1 соат дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд. Слайдҳо бо ANO Reagent PPD520 ё PPD570 бо истифода аз маҷмӯаи PANO 4-plex IHC (Panovue, Чин) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда инкубатсия карда шуданд, пас бо ранги муқобил бо DAPI (Thermo, ИМА) ва дар ниҳоят барои таҳлил насб карда шуданд. Қисмҳои шуши рангшуда бо истифода аз System TissueFaxs Plus, ки ба микроскопи Zeiss Axio Imager Z2 ё микроскопи конфокалии Nikon A1 пайваст карда шудаанд, скан ва рақамӣ карда шуданд. Шиддати рангкунии мусбӣ аз ҷониби нармафзори Image J 9.0 таҳлил карда шуд.

    PCR дар вақти воқеӣ

    РНК-и умумӣ аз ҳуҷайраҳо бо истифода аз Trizol (Invitrogen) истихроҷ карда шуд ва бо истифода аз маҷмӯаи транскрипсияи баръакси cDNA (Applied Biosystems, CA) ба cDNA транскрипт карда шуд. Пайдарпаии ибтидоӣ ба таври зерин нишон дода шудааст: GAPDH, 5'-ACAACTTTGGTATCG TGGAAGG-3' (ҳиссос) ва 5'-GCCATCACGCCACAGT TTC-3' (антисенс) Гапд, 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' (ҳиссос) ва 5'-TGTAGACCATGTAGTTGA GGTCA-3' (антисенс) SARS-CoV-2 primer1 (ORF1ab): 5'-CCCTGTGGGTTTTAC ACTTAA-3' (ҳиссос) ва 5'-ACGATTGTGCA TCAGCTGA-3' (антисенс) SARS-CoV-2 primer2 (Нуклеопротеин): 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3' (ҳиссос) ва 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3' (антисенс) ACE2, 5'-CAAGAGCAAACG GTTGAACAC-3' (ҳиссос) ва 5'-CCAGAGCCTCTCTCATTGTAGTCT-3' (антисенс) №2, 5'-GATGTTGAACTATGTCCTATCTCC-3' (маъно) ва 5'-GAACACCACTTT CACCAAGAC-3' (антисенс) Arg1, 5'-CAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3' (маъно) ва 5'-TGGCTTATGGTTACCCTCCC-3' (антисенс). ПТР дар вақти воқеӣ бо истифода аз ABI QuantStudio 3 (Applied Biosystems, CA, ИМА) анҷом дода шуд. Арзишҳо маънои ± SD аз се таҷрибаҳои мустақил мебошанд, ки дар ду нусха иҷро шудаанд. Муқоисаи оморӣ байни гурӯҳҳо бо истифода аз як донишҷӯ анҷом дода шуд т-озмоиш. Қиматҳои ҳамаи параметрҳо бо арзиши оморӣ муҳим ҳисобида шуданд П < 0,05.

    Гибридизатсияи RNA in situ (RNA-ISH)

    RNA-ISH дар макрофагҳои ибтидоии алвеолярӣ, ки дар пӯшишҳои шишагӣ ё бахшҳои бофтаи шуш бо парафини 5 мкм ҷойгир шудаанд, бо истифода аз RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v2 мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда (Advanced Cell Diagnostics, ИМА) гузаронида шуд. Хулоса, ҳуҷайраҳо дар 4% параформальдегид ҷойгир карда шуданд ва бо пероксиди гидроген дар RT барои 10 дақиқа ва 1:15 протеазаи III дар RT барои 10 дақиқа инкубатсия карда шуданд. Қисмҳои бофтаи шуш бо ксилол депарафинизатсия карда шуданд ва бо этаноли дараҷавӣ регидрат карда шуданд, бо пероксиди гидроген инкубатсия карда шуданд ва сипас дар буфери ҷустуҷӯи Ҳадаф барои 15 дақиқа ҷӯшонида шуданд ва пас аз инкубатсия бо Protease Plus барои 15 дақиқа дар 40 ° C. Слайдҳо бо зондҳои SARS-CoV-2 дар танӯри гибридизатсия дар 40 °C барои 2 соат гибридизатсия карда шуданд ва сигналҳои флуоресцентӣ мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда тақвият дода шуданд. Ҳуҷайраҳое, ки дар зарфҳои шишагӣ ва қисмҳои рангшудаи шуш парвариш карда шудаанд, бо истифода аз системаи TissueFaxs Plus, ки ба микроскопи Zeiss Axio Imager Z2 пайваст карда шудаанд, скан ва рақамӣ карда шуданд. Шиддати флуоресцентсия ва суръати мусбати ҳуҷайраҳо тавассути нармафзори Image J 9.0 таҳлил карда шуданд.

    Андозаи рН лизосомалӣ

    LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 (Термо Фишер, ИМА) барои муайян кардани рН-и лизосомаҳои макрофагҳо мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда истифода шудааст, ки спектри ҳаяҷонбахши дугонаи аз рН вобастаро дар ҳуҷайраҳои зинда нишон медиҳад. LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 дорои флуорессенсияи зард дар муҳити туршӣ ва флуорессенсияи кабуд дар муҳити сілтӣ мебошад. Хулоса, ҳуҷайраҳо бо 5 мкм LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 дар муҳити пешакӣ гармшуда барои 5 дақиқа дар 37 °C коркард карда шуданд. Пас аз шустани ду маротиба бо PBS хунук, ҳуҷайраҳои нишонашуда дар 37 °C барои 5 дақиқа бо 10 мкМ моненсин ва 10 мкМ нигерицин дар Маҳлули зиндаи тасвирии ҳуҷайра (Термо Фишер, ИМА) инкубатсия карда шуданд. Шиддати флуоресцент дар Ex-330/Em-550 ва Ex-380/Em-550 чен карда шуд. Каҷи стандартии арзиши рН аз ҷониби маҷмӯаи буферии калибркунии дохили ҳуҷайра (Термо Фишер, ИМА) иҷро карда шуд. Барои кислотаи нисбии лизосома, макрофагҳо бо 5 мкМ LysoSensor TM Green DND-189 (Термо Фишер, ИМА) дар тӯли 30 дақиқа дар шароити мувофиқи афзоиш инкубатсия карда шуданд. Сипас маҳлули боркунӣ бо муҳити тару тоза иваз карда шуд ва ҳуҷайраҳои доғдор бо истифода аз микроскопи конфокалии Nikon A1 мушоҳида ва рақамӣ карда шуданд. Шиддати нисбӣ тавассути нармафзори Image J 9.0 таҳлил карда шуд.

    Муайян кардани кислотаи эндосомӣ

    Барои муайян кардани кислотаи эндосомӣ, pHrodo TM сурх декстран (Термо Фишер, ИМА) истифода шудааст, ки дорои партови флуоресцентии ба рН ҳассос мебошад, ки шиддат бо афзоиши кислотаҳо зиёд мешавад ва аслан дар муҳити берун аз ҳуҷайра ғайрифлуоресцентӣ аст. Бо риояи дастурҳои истеҳсолкунанда, AMs ё PAECs бо 50 мкг/мл pHrodo TM сурх декстран дар Маҳлули Live Imaging Cell барои 10 дақиқа дар 37 °C парвариш карда шуданд. Пас аз шустани ду маротиба бо муҳити қаблан гармшуда, ҳуҷайраҳо тавассути цитометрияи ҷараён таҳлил карда шуданд ва тавассути микроскопи конфокалии Nikon A1 бо филтри мувофиқ тасвир карда шуданд.

    Таҷрибаҳои ҳайвонот ва протоколи табобат

    мушҳои hACE2 бо SARS-CoV-2 сироят ёфтаанд (1 × 10 5 TCID50) тавассути маъмурияти intratracheal ва сипас бо назорати автомобил табобат карда мешавад (H2О ё липосомаи назоратӣ), CQ (35 мг/кг, i.p.) ё CQ дар якҷоягӣ бо липосомаҳои клодронат (50 мкл тавассути воридкунии дохили трахея ва 100 мкл тавассути тазриқи дохили вена, танҳо як маротиба) дар як рӯз як маротиба дар тӯли 5 рӯз (Н. = 4 муш/гурӯҳ). Пас аз 5 рӯзи табобат, мушҳо эвтаниз карда шуданд ва бофтаҳои шуш барои санҷиши PCR дар вақти воқеӣ ва рангкунии гистологӣ ва иммуногистохимикӣ ҷамъ карда шуданд.

    Муайян кардани қобилияти мавҷудияти ҳуҷайра

    Барои арзёбии қобилияти ҳуҷайраҳои AM-ҳои мубталои SARS-CoV-2, мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда маҷмӯаи таҳлили қобилияти қобилияти ҳуҷайраҳои CellTiter-Glo ® Luminescent Cell (Promega, ИМА) истифода шудааст. Хулоса, 1 × 10 5 / чоҳ AM дар плитаҳои 24-чоҳ ҷойгир карда шуда, бо 10 5 TCID сироят карда шуданд.50 SARS-CoV-2 барои 4 соат. Пас аз он ҳуҷайраҳо бо реагенти дуҷонибаи системаи таҳлили Reporter люцифераза лизис карда шуданд ва сигнали люцифераза тавассути люмиометри микроплата муайян карда шуд.

    Таҳлили миқдорӣ ва оморӣ

    Ҳама таҷрибаҳо на камтар аз се маротиба гузаронида шуданд. Натиҷаҳо ҳамчун миёна ± SD тавре нишон дода шудаанд ва аз ҷониби донишҷӯёни дуҷониба таҳлил карда мешаванд т-озмоиш ё ANOVA яктарафа пас аз санҷиши Бонферрони ё санҷиши Крускал-Уоллис. Дар П-арзиши < 0,05 аз ҷиҳати омор муҳим ҳисобида шуд. Таҳлил бо истифода аз нармафзори Graphpad 8.0 гузаронида шуд.


    Муқаддима

    Коронавирусҳо, ки бо рӯи тоҷ барин ном доранд, аз ҷиҳати генетикӣ гуногунанд ва метавонанд намудҳои зиёди ҳайвонот, аз ҷумла кӯршапаракҳо, хукҳо, гурбаҳо, хояндаҳо ва одамонро сироят кунанд [1]. Коронавирусҳо ба 4 насл тақсим мешаванд: алфа, бета, гамма ва дельта. Танҳо коронавирусҳои алфа ва бета маълуманд, ки одамонро сироят мекунанд, ки дар натиҷа патология аз аломатҳои роҳҳои болоии нафаскашӣ хос аст, ки ба бемории сармои маъмулӣ то бемории роҳи поёнии нафас таҳдид мекунад. Коронавирусҳои маъмулии сармохӯрӣ 229E ва OC43 бори аввал дар миёнаҳои солҳои 1960 кашф шуда буданд, ки 2 коронавируси иловагӣ, NL63 ва HKU1 мутаносибан дар солҳои 2004 ва 2005 муайян карда шудаанд. Ҳама патогенҳои дар ҳама ҷо паҳншавандаи инсон мебошанд [2]. Аз соли 2003 то нимаи соли 2019, 2 коронавируси бета, ки пайдоиши зоонотикӣ доранд, боиси хуруҷи бемориҳои шадиди роҳи нафас шуданд: Синдроми шадиди роҳи нафас Коронавирус (SARS-CoV) ва Синдроми роҳи нафасии Шарқи Наздик Coronavirus (MERS-CoV). SARS-CoV моҳи феврали соли 2003 дар Осиё пайдо шуд ва то ҷилавгирӣ аз авҷ ба 26 кишвар паҳн шуд [3,4]. Зиёда аз 8,000 нафар одамон бо суръати марги тақрибан 10% сироят ёфтаанд [5]. MERS-CoV бори аввал дар соли 2012 пайдо шуда буд, ки ҳолатҳои ибтидоӣ аз Арабистони Саудӣ ва Урдун пайдо шуданд. Сироятҳо ҳоло ҳам рух медиҳанд ва дар 27 кишвари ҷаҳон гузориш дода шудаанд, ки аксари ҳолатҳо дар нимҷазираи Араб ҷудо шудаанд [6]. Гарчанде ки интиқоли MERS-CoV аз одам ба одам хеле кам аст, сатҳи фавт аз 30% зиёдтар аст [3,7].

    Дар моҳи декабри соли 2019, дар Вуҳани Чин [8] хуруҷи табларза ва бемории роҳи нафас, ки сабабаш номаълум ба қайд гирифта шуда буд, ва дар нимаи моҳи январи соли 2020, агенти этиологӣ ҳамчун як вируси бета-коронаи нав пайдошуда, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2 муайян карда шуд. (SARS-CoV-2) [9,10]. Дар ҳоле ки бисёре аз мубталоён бо SARS-CoV-2 асимптоматикӣ ҳастанд ё бемории сабукро ба вуҷуд меоранд, барои дигарон, COVID-19 метавонад оқибатҳои потенсиалии дарозмуддат дошта бошад ва дар аҳолии осебпазир ба монанди пиронсолон ва онҳое, ки шароити тиббии зеризаминӣ доранд, он метавонад боиси бемориҳо ва оқибатҳои назаррас гардад. дар тангии шадиди роҳи нафас, дар беморхона бистарӣ ва ҳатто марг [11]. Аз он вақт инҷониб, SARS-CoV-2 дар саросари ҷаҳон паҳн шуда, Созмони Ҷаҳонии Беҳдоштро водор кард, ки бемории нави коронавирус, Бемории Coronavirus 2019 ё COVID-19-ро дар моҳи марти соли 2020 пандемия эълон кунад. Ҳамагӣ дар 12 моҳ, вирус боиси бӯҳрони бузурги ҷаҳонии саломатӣ гардид, ки дар он зиёда аз 81 миллион ҳолати COVID-19 дар 190 кишвар, беш аз 1,777,000 фавт ва сатҳи тахминии фавт дар ин ҳолат тақрибан 2,6% мебошад [12].

    Ба ғайр аз ремдесивир доруи зиддивирусии ба дохили варид воридшаванда дар беморони гирифтори бемории шадиди COVID-19, ягон агенти табобатӣ барои табобати сироят ё бемории SARS-CoV-2 тасдиқ нашудааст [13]. Арзёбии бисёрмарказии 4 доруи зиддивирусии такрорӣ (ремдесивир, гидроксихлорокин, лопинавир ва интерферон β 1а), ки аз ҷониби ТУТ гузориш дода шудааст, ҳеҷ гуна таъсирро ба оғози умумии вентилятсия ва давомнокии бистар дар беморхона қайд кард [14]. Таҳлилҳои охирини зергурӯҳҳо нишон доданд, ки истифодаи барвақти глюкокортикоидҳо дар беморони дорои сатҳи назарраси сафедаи C-реактивӣ (≥20 мг/дл) бо коҳиши назарраси фавт ё вентилятсияи механикӣ алоқаманд аст, дар ҳоле ки табобати глюкокортикоидҳо дар беморони дорои сатҳи пасти сафедаи реактивии С бо оқибатҳои бадтар алоқаманд буд [15]. Вақте ки пандемияи SARS-CoV-2 идома дорад, зарурати таъҷилии таҳияи терапевтҳои муассир барои маҳдуд кардани паҳншавии минбаъда вуҷуд дорад. Кӯшишҳои барвақт барои муайян кардани усулҳои муассири терапевтӣ барои COVID-19 асосан ба кӯшишҳои бозсозии маводи мухаддир тамаркуз кардаанд, ки дар он доруҳои мавҷудаи аз ҷиҳати клиникӣ пешрафта ё ба фурӯш баровардашуда барои фаъолияти зиддивирусӣ бар зидди SARS-CoV-2 in vitro дар системаҳои сирояти ҳуҷайравӣ тафтиш карда мешаванд. Гарчанде ки ин гуна экранҳо хитҳои ҷолиб ба даст овардаанд, саволҳо дар бораи аҳамияти физиологӣ ва патологии сироят кардани хатҳои ҳуҷайраҳои ҷовидона, ки аз пайдоиши шуш ё меъдаву рӯда ба даст омадаанд, пайдо шуданд. Дар бораи механизмҳои пайвастшавии вирусҳо ва воридшавӣ ба ҳуҷайраҳои инсон, ки метавонанд дар ҳуҷайраҳои пайдоиши бофтаҳои гуногун фарқ кунанд, саволҳои мушаххас ба миён омадаанд. Илова бар ин, хатҳои скринингии ҳуҷайраҳо метавонанд механизмҳои маҳдуди дохили ҳуҷайра дошта бошанд, ба монанди ферментҳои катаболизатсия, ки ҷузъи асосии ҳуҷайраи ибтидоии сироят дар беморони инсон мебошанд. Аз ин рӯ, такмил додани фаҳмиши мо дар бораи таъсири мутақобилаи асосии молекулавӣ ва ҳуҷайравӣ, ки дар сирояти SARS-CoV-2 алоқаманданд, барои таҳияи асбобҳои мувофиқ дар vitro барои дастгирии кӯшишҳои кунунӣ ва ояндаи кашфи маводи мухаддир муҳим аст.

    Доираи / баррасиҳои қаблӣ

    Ҳадафи ин мақола баррасии ҷанбаҳои калидии биологияи SARS-CoV-2, аз ҷумла муайянкунандаи воридшавии вирус ба хатҳои сершумори ҳуҷайраҳо ва системаҳое мебошад, ки барои афзоиши вирус, тропизми бофтаҳо ва генҳои мизбон, ки ба воридшавӣ, паҳншавӣ ва воридоти маводи мухаддири нуклеотид таъсир мерасонанд. ва табдилдиҳӣ барои SARS-CoV-2 бо мақсади мусоидат намудан ва фароҳам овардани кӯшишҳои кашфи маводи мухаддир.

    Барои баррасии ҳамаҷонибаи механизмҳои воридшавӣ ва коркарди протеазҳо дар коронавирусҳо, хонанда ба дигар мақолаҳои охирин равона карда мешавад [16-19]. Баррасиҳои васеъ дар бораи MERS-CoV [20], SARS-CoV [21,22] ва SARS-CoV-2 [19] ингибиторҳо мавҷуданд. Мо экранҳои такрории SARS-CoV-2-ро дар бахши "Механизмҳои воридшавӣ ва протеазаҳо" муҳокима мекунем.

    Механизмҳои воридшавӣ ва протеазҳо

    То имрӯз, скрининги аввалия барои муайян кардани антивирусҳои SARS-CoV-2 асосан хатти ҳуҷайраҳои гурдаи маймуни сабзи африқоии Vero E6 ҳамчун ҳуҷайраи мизбон барои таҳлилҳои ҷилавгирӣ аз эффекти ситопатикӣ (CPE) истифода шудааст. Илова бар он, ки дар экспрессияи ангиотензин табдилдиҳандаи 2 (ACE2) ва TMPRSS2, механизмҳои дохилии эндоситикии қабули вирусҳо барои воридшавии вирус ба Vero E6 ва намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳо масъуланд [23-26]. Ҳамин тариқ, як қатор молекулаҳое, ки камолоти эндосомӣ-лизосомалӣ ва роҳҳои аутофагияро танзим мекунанд, дар ҳуҷайраҳои Vero E6 фаъолияти пурқуввати антивирусӣ нишон доданд, ки метавонанд ба ҳуҷайраҳои эпителиалии ибтидоии шуш табдил наёбанд. Ин имкон медиҳад, ки ҷилавгирии антивирусии бисёре аз ин пайвастагиҳо бар зидди SARS-CoV-2 дар экранҳои Vero E6 метавонад як фаъолияти in vitro хоси ҳуҷайраҳои эндоситикии баланд бошад ва ҳамчун терапевтҳои SARS-CoV-2 мувофиқ ва тарҷумашаванда набошад. Тавре дар зер муфассал шарҳ дода шудааст, вируси SARS-CoV-2 нишон дода шудааст, ки РНК-и вирусиро мустақиман тавассути мембранаи плазма бидуни иштироки назарраси азхудкунии эндоцитикӣ интиқол медиҳад.

    Сирояти ҳуҷайраҳои эпителиалии шуши ширхӯрон аз ҷониби SARS-CoV-2 ва инчунин аз дигар коронавирусҳо аз пайвастани вирус тавассути протеини хӯшаи он ба як ретсептори мушаххаси рӯи ҳуҷайра оғоз меёбад. Ресептори ҳуҷайравии SARS-CoV-2 ва вируси марбут ба SARS-CoV, ACE2-и инсон аст [16,27,28], ки дар ҳуҷайраҳои эпителиалии шуш ва рӯда ва ба андозаи камтар дар гурда, дил, равған ва ҳам бофтаҳои репродуктивии мардона ва занона [29–35]. Пайвастшавӣ ба ретсептор пас аз фаъол шудани протеини хӯша тавассути тақсимоти протеолитикӣ аз ҷониби протеазаи мизбон дар наздикии пайванди байни доменҳои S1 ва S2 он сурат мегирад [17,36]. Домени N-терминуси нав озодшудаи S2 ба мембранаи ҳуҷайра боиси омезиши мембранаҳои вирусӣ ва ҳуҷайра мегардад, ки дар натиҷа РНК-и вирусӣ ба ситоплазмаи ҳуҷайраи мизбон интиқол дода мешавад, ки дар он репликатсияи вирус метавонад ба амал ояд [17,36].

    Гарчанде ки қадамҳои дар боло зикршуда барои сирояти ҳуҷайраҳои мизбон аз коронавирусҳо муҳим ҳисобида мешаванд, ин тавсиф ҷанбаҳои асосии раванди воридшавии вирусро, яъне хусусияти протеаза(ҳо)-и мизбонро, ки барои фаъол кардан (ё омода кардани) сафедаи хӯша барои синтез ва ҷойгиршавии ҳуҷайравии худи ҳодисаи синтез. Кор дар тӯли 20 соли охир ва асосан барои SARS-CoV-2 дар тӯли чанд моҳи охир тасдиқ карда шудааст, нишон медиҳад, ки коронавирусҳо ба ҳуҷайраҳои мизбон тавассути 1 аз 2 роҳи ҷудогона ворид мешаванд: (i) роҳи сатҳи ҳуҷайра пас аз фаъол шудан бо протеазаҳои серин ба монанди TMPRSS2 ё (ii) роҳи эндоситикӣ дар дохили қисмҳои эндосомӣ-лизосомалӣ, аз ҷумла коркард бо катепсинҳои лизосомалӣ (расми 1) [16-18]. Тадқиқоти нав тасдиқ мекунад, ки коронавирусҳо барои озодшавӣ роҳи лизосомалии экзоцитозро истифода мебаранд [37]. Саҳми ҳар як роҳ дар як намуди ҳуҷайра асосан аз ифодаи протеазҳо, бахусус TMPRSS2 вобаста аст. Вақте ки TMPRSS2 (ё дигар протеазҳои серин ба монанди TMPRSS4 ё протеазаи ба трипсин монанд ба роҳи нафасии инсон [HAT]) ифода карда мешавад, роҳи воридшавии барвақт бартарӣ дорад, дар ҳоле ки дар сурати набудани ин протеаза, вирус ба роҳи дер бо эндоцитоз ва фаъолсозӣ такя мекунад. аз ҷониби cathepsin L (CTSL) [27,38].

    Протеини хӯшаи куртаи вирусӣ ба ACE2 ва дар баъзе ҳолатҳо, шояд NRP1, дар ҳуҷайраҳои ҳассос пайваст мешавад. Протеини хӯшаи вирус ё аз ҷониби TMPRSS2 ва дигар протеазҳои серин коркард карда мешавад, ки воридшавии сатҳи ҳуҷайраҳоро осон мекунад ё ба эндосомаҳо эндоситоз карда мешавад, ки дар он хӯша тавассути CTSL дар лизосома коркард мешавад. РНК-и вирусӣ, ки аз воридшавӣ тавассути TMPRSS2 ё барориши эндосома бароварда шудааст, ҳамчун нусхаҳои қисман ва пурраи геном такрор карда мешавад ва дар ER тарҷума карда мешавад, то вирионҳои нави SARS-CoV-2 ташкил карда шавад. Коркарди протеини хӯша тавассути фурин пеш аз баровардани вирусҳои нав ба муҳити берун аз ҳуҷайра ба амал меояд. ACE2, ферменти табдилдиҳандаи ангиотензин 2 CTSL, катепсин L ER, ретикулуми эндоплазми NRP1, Нейропилин 1 SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    Фаҳмидани он, ки кадом роҳи воридшавии вирус дар намудҳои мушаххаси ҳуҷайраҳо паҳн шудааст, на танҳо барои фаҳмидани биологияи коронавирус, балки инчунин барои тафсири дурусти экранҳои генетикӣ ва молекулаҳои хурд дар асоси ҳуҷайра муҳим аст. То имрӯз, экранҳое, ки ба муайян кардани доруҳои бозоршуда ё клиникӣ пешрафта барои бозгардонидани эҳтимолӣ барои табобати COVID-19 нигаронида шудаанд, ба истифодаи хатҳои ҳуҷайраҳои эпителиалии гурда ба монанди Vero E6 (маймуни сабзи африқоӣ) ва 293T (ҷанини одам) такя мекунанд [39] –42]. Чунин экранҳо якчанд зарбаҳоро ба даст оварданд, ки маълуманд, ки эндоцитоз ё камолоти эндосомиро манъ мекунанд ё халалдор мекунанд [39,40,42,43]. Ин тааҷҷубовар нест, зеро ҳуҷайраҳои Vero E6 ва 293T протеазаи сатҳи ҳуҷайра TMPRSS2-ро ифода намекунанд, аз ин рӯ, сирояти коронавирус дар ин ҳуҷайраҳо аз роҳи воридшавии дер эндоцитикӣ/катепсин вобаста аст. Ҳамин тариқ, агентҳое, ки ба ин роҳ халал мерасонанд, аз ҷумла ингибиторҳои катепсин, агентҳое, ки кислоташавии эндосомаро пешгирӣ мекунанд (ки аз онҳо катепсинҳо ба фаъолият вобастаанд) ва ингибиторҳои камолоти эндосомӣ (масалан, ингибитори apilimod PIKfyve) метавонанд воридшавии вирусро ба ин ҳуҷайраҳо боздоранд. 38,44,45]. Муҳим он аст, ки ифодаи гетерологии TMPRSS2 дар ҳуҷайраҳои Vero E6 ва HeLa самаранокии фармакологии ингибиторҳои катепсинро тавассути имкон додани роҳи воридшавии вирус дар рӯи ҳуҷайра бекор мекунад [38,46]. Ба ҳамин монанд, пеш аз фаъолсозии вирус бо трипсин протеазаи серин инчунин имкон медиҳад, ки роҳи воридшавии сатҳи ҳуҷайра, ҳатто дар ҳуҷайраҳое, ки TMPRSS2-ро ифода намекунанд [45,47,48]. Мувофиқи ин мушоҳидаҳо, ҳуҷайраҳое, ки TMPRSS2-ро ба таври эндогенӣ ифода мекунанд, аз ҷумла ҳуҷайраҳои аз эпителияи шуш ва рӯда ҳосилшуда, инчунин ба воридшавии коронавирус тавассути роҳи сатҳи ҳуҷайра ҳассос мебошанд. Дар ин ҳуҷайраҳо ингибиторҳои катепсин танҳо қисман самараноканд, ингибиторҳои TMPRSS2 ба монанди камостат ва нафамостат ба таври назаррас самараноктаранд ва маҷмӯи 2 намуди ингибиторҳои протеаз дар пешгирии сирояти коронавирус ҳадди аксар самаранок мебошанд [27,38,49-52]. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки коронавирусҳо метавонанд ба ин ҳуҷайраҳо тавассути ҳарду роҳ ворид шаванд ва бартарӣ ба роҳи сатҳи ҳуҷайра.

    Новобаста аз ин, ин маълумоти мобилӣ, то ҳол баҳс аст, ки оё монеаи инфиродии сатҳи ҳуҷайра ё роҳҳои эндоситикӣ бар зидди COVID-19 манфиати табобатӣ фароҳам меорад. SARS-CoV-2 намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳоро сироят мекунад [46,53,54], гарчанде ки тахмин кардан оқилона ба назар мерасад, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии роҳҳои нафас ва меъдаю рӯда аз аввалинҳоянд, ки дар шароити клиникӣ бо вирус дучор меоянд. Тадқиқотҳои in vivo бо коронавируси марбут ба SARS-CoV ақидаро дастгирӣ мекунанд, ки ингибиторҳои роҳи вуруди сатҳи ҳуҷайра метавонанд ҳадди аққал қисман муҳофизат кунанд. Муҳосираи генетикӣ [55] ва фармакологӣ [56] аз TMPRSS2 муҳофизати қисман аз SARS-CoV дар моделҳои сирояти мушро таъмин кард.Дар таҳқиқоти охирин, ингибитори васеи катепсин SMDC256160 на танҳо ва на дар якҷоягӣ бо камостат ҳеҷ фоидае надод. Таҳқиқоти минбаъда, махсусан дар моделҳои сирояти SARS-CoV-2 барои муайян кардани саҳми ҳар як роҳи воридшавии вирус ба патологияи COVID-19 талаб карда мешаванд. Қобили зикр аст, ки ба наздикӣ пешниҳод шудааст, ки муҳосираи вуруди SARS-CoV-2 метавонад ҷилавгирӣ аз сатҳи ҳуҷайра ва роҳҳои эндоситикиро талаб кунад [57].

    TMPRSS2 ва фурин дар вуруди сатҳи ҳуҷайра

    Ген TMPRSS2 протеазаи навъи II трансмембрании серин (TTSP)-ро рамзгузорӣ мекунад, ки дар ибтидо зиёда аз 2 даҳсола пеш кашф шуда буд [58] ва баъдан нишон дод, ки аз ҷониби андроген танзим карда мешавад ва дар эпителияи простата хеле ифода ёфтааст [59]. TMPRSS2 ба мембранаи плазма тавассути спирали трансмембрании якгузар дар наздикии N-терминали он ҷойгир карда шудааст. Фермент инчунин метавонад дар Arg255 автоклаватсияро аз сар гузаронад, ки шакли 32 кДа-и протеазро ба вуҷуд меорад [60]. Мушҳое, ки протеазаи TMPRSS2 (TMPRSS2 [-/-]) надоранд, фенотипи ғайримуқаррарии ғайриоддӣ нишон намедиҳанд, ки ин нишон медиҳад, ки протеаз ба вазифаи муҳими зиёдатӣ хизмат намекунад [61], мушоҳидае, ки баъдтар таҳқиқи нақши TMPRSS2 дар моделҳои муши коронавирус имкон дод. беморӣ.

    Фаҳмиши кунунии мо дар бораи муносибати байни TMPRSS2 ва сирояти SARS-CoV-2 дар чанд моҳи аввал пас аз пайдоиши SARS-CoV-2 пешрафти босуръатро мушоҳида кардааст. Қисми зиёди ин пешрафт дар зиёда аз даҳсолаи таҳқиқот аз далелҳои аввалини он, ки ифодаи TMPRSS2 бо сирояти SARS-CoV дар бофтаи шуш алоқаманд аст ва боиси фаъол шудани протеини хӯша мегардад, ки ба синтези мембрана имкон медиҳад [62]. Тадқиқотҳо бо истифода аз таҳлилҳои синтези ҳуҷайраҳо нишон доданд, ки ифодаи TMPRSS2 дар ҳуҷайраҳои мавриди ҳадаф, на ҳуҷайраҳои тавлидкунандаи вирус, барои фаъолсозии сафедаи хӯша муҳим аст, ки маҳдудиятҳои фазоӣ ва муваққатиро дар амали TMPRSS2 дар мембранаи плазма дар марҳилаҳои аввали воридшавии вирус ба сатҳи ҳуҷайра дастгирӣ мекунад. Ду макони тақсимшавӣ дар хӯшаи SARS-CoV - R667, ки дар макони ҷудошавии S1/S2 ҷойгир аст ва R797, ки дар макони шикастани S2 ҷойгир аст, пешниҳод шудааст, ки макони дахлдори амали TMPRSS2 ва инчунин дигар протеазаҳои серин бошанд. ки метавонад протеини хӯшаеро дар фарҳанги ҳуҷайра, ба монанди трипсин ва HAT, пешбарӣ кунад. Мутацияи R797 дар S2' фаъолсозии протеини хӯшаи TMPRSS2-ро бекор мекунад ва ин сайт дар саросари коронавирусҳо хеле нигоҳ дошта мешавад, ки ин аз ҷиҳати функсионалӣ ба воридшавии сатҳи ҳуҷайра аз TMPRSS2 дар SARS-CoV-2 мувофиқ аст.

    Фурини протеини конвертаза кайҳо боз маълум аст, ки дар воридшавии вирус нақш мебозад ва маълумоти охирин нақши ин ферментро, махсусан дар воридшавии сатҳи ҳуҷайра тавассути TMPRSS2 дастгирӣ мекунанд. Гумон меравад, ки коркарди протеини хӯша тавассути фурин дар макони ҷудошавии S1/S2 пас аз такрори вирусӣ дар қисмати мобайнии ретикулуми Голги (ERGIC) ба амал меояд [63]. Нақши мураккаби фуринро дар синтез ва воридшавии вирус таъкид намуда, макони ҷудошавии фурин S1/S2 дар SARS-CoV-2 ва MERS мавҷуд аст, аммо на дар SARS-CoV [64]. Ғайр аз он, макони SARS-CoV-2 furin S1/S2 ҳангоми гузаштан дар ҳуҷайраҳои Vero E6 зуд гум мешавад [65] ва як изолятсияи сабуктари SARS-CoV-2 ZJ01 нишон дода шудааст, ки ин сайтро низ аз даст додааст [30]. Фурин инчунин метавонад протеини хӯшаеро дар синтез пора кунад, ки макони S2' -ро ҳангоми биогенез дар MERS-CoV ва SARS-CoV фаъол созад [30,36,65-67]. Дар маҷмӯъ, маълумотҳои мавҷуда як модели қобили қабули коркарди хӯшаи SARS-CoV-2-ро дастгирӣ мекунанд, ки дар он ҷудошавии фурин дар макони S1/S2 протеини хӯшаро дар вақти биогенез пешакӣ ба кор медарорад ва ба фаъолсозии минбаъдаи синтези мембрана тавассути ҳодисаи дуюми тақсимшавӣ дар S2 мусоидат мекунад. ' аз ҷониби TMPRSS2 пас аз бастани ретсепторҳои ACE2 ба ҳуҷайраҳои мавриди ҳадаф [46,50].

    Ресептори VEGF-A Neuropilin 1 (NRP1) ба наздикӣ нишон дода шуд, ки як ретсептори омили мизбон барои пептид хӯшаи аз фурин ҷудошуда SARS-CoV-2 [68-71]. Муҳосираи NRP1 сироят ва вурудро коҳиш медиҳад ва тағир додани макони фурин боиси аз байн рафтани вобастагии NRP1 мегардад. Нобудшавии пептидҳои фурин дар хӯша боиси коҳиши репликатсия дар Калу3, афзояндаи такрорӣ ва беҳтар шудани фитнес дар Vero E6 ва бемории сустшуда дар модели патогенези бемории хамстер мегардад [70].

    Ба наздикӣ, далелҳои дар vivo алоқамандии TMPRSS2 дар моделҳои муш барои сирояти SARS-CoV ва MERS-CoV аз мушҳои TMPRSS2 (-/-) оварда шудаанд, ки шиддати бемориро коҳиш медиҳанд [55]. Тадқиқотҳои шикастани TMPRSS2 shRNA барои нақши мушаххас ва зиёдатӣ дар сирояти SARS-CoV-2 далелҳо пешниҳод мекунанд [72].

    Катепсинҳои лизосомалӣ ва эндоцитоз

    Гарчанде ки далелҳои дар боло зикршуда нақши TMPRSS2 ва дигар протеазаҳои серинро дар фаъол кардани протеини хӯшаи коронавирус барои синтези мембранаи плазма равшан нишон медиҳанд, таҳқиқоти in vitro бо истифода аз системаҳои гуногуни фарҳанги ҳуҷайра роҳи алтернативии эндосомӣ-лизосомалиро барои воридшавии вирус нишон доданд. Тадқиқотҳои аввал ҳассосияти репликатсияи SARS-CoV-ро дар фарҳанги ҳуҷайра ба агентҳои лизосомотропӣ нишон доданд ва пас аз он таҳқиқоти иловагӣ, ки нақши катепсинҳоро барои коркард ва фаъол кардани хӯша барои синтези мембранаҳо тақсим мекунанд, нишон доданд. Мавҷудияти ингибиторҳои хеле қавӣ ва мушаххаси катепсинҳои хурд калиди ҷудо кардани рӯйдодҳои молекулавии дар ин роҳ иштирокдошта ва тавсиф кардани таъсири функсионалии дахлдор ба CTSL, 1 аз 11 катепсинҳо дар одамон буд [73,74]. Таҳқиқоти иловагӣ макони ҷудошавии CTSL дар протеини хӯшаи SARS-CoV ба T678, терминали 11 аминокислотаҳои карбоксил то R667 макони ҷудошавии фуринро муайян карданд. Мушоҳида, ки макони ҷудошавии CTSL дар 120 аминокислотаҳо дар болотари макони S2' ҷойгир аст, ки аз ҷониби TMPRSS2 ҷудо шудааст, холигоҳро дар фаҳмиши мо дар бораи рӯйдодҳои молекулавӣ, ки дар роҳи воридшавии эндосомаҳо иштирок мекунанд, фош мекунад. Тадқиқотҳои қаблӣ имкони як протеазаи дигареро пешниҳод карданд, ки метавонад дар S2' дар муҳити пасти рН-и эндосомаҳо/лизосомаҳо барои пурра фаъол кардани потенсиали синтези мембранаи хӯша [36], ё ба таври дигар, фарқият дар таркиби липидҳо байни мембранаҳои плазма ва эндосомӣ/ мембранаҳои лизосомалӣ метавонанд охиринро ба синтези вирусӣ бештар мутобиқ созанд [75]. Сарфи назар аз ин ихтилоф дар фаҳмиши кунунии мо дар бораи воридшавии вирусҳои эндоцитикӣ, маълум аст, ки коронавирусҳо дар маҷмӯъ ва бахусус SARS-CoV-2 қодиранд тавассути воридшавии эндосомӣ дар системаҳои фарҳанги ҳуҷайраҳои дар vitro маъмулан истифодашаванда сирояти устуворро таъсис диҳанд.

    Тропизм / ифодаи хати ҳуҷайра

    Бо мураккабии механизмҳои воридшавии сершумори SARS-CoV-2, интихоби хат(ҳо)-и оптималии ҳуҷайра барои арзёбии мураккаб ва скрининг ҳатмӣ аст, алахусус дар таҳқиқоте, ки механизмҳои васеи зиддивирусии амали берун аз ҷилавгирӣ аз сафедаҳои ғайрисохтории вирусиро меҷӯянд. Бо ин мақсад, тадқиқотҳо барои беҳтар фаҳмидани тропизми ҳуҷайравии вирус гузориш дода шудаанд. Вируси псевдотипии вируси стоматити везикулярӣ (VSV), ки дорои протеини хӯшаи SARS-CoV-2 ё протеини хӯшаи SARS-CoV ва панели хатҳои хуб тавсифшудаи ҳуҷайраҳои инсон ва ҳайвонот барои муайян кардани тропизми васеътари вирус истифода шудааст [46]. Спектри хатҳои ҳуҷайраҳои ба сирояти вирус ҳассос барои протеини хӯшаи SARS-CoV ва SARS-CoV-2 шабеҳ буд ва вуруд дар A549, BEAS-2B, Calu-3, H1299, 293T, Huh7, Caco-2, Vero E6, ва намудҳои ҳуҷайраҳои MDCK2 [27]. Кӯшишҳои иловагӣ барои фаҳмидани тропизми вирусӣ иборатанд аз мониторинги сироятпазирии вирус дар тӯли 120 соат бо 0,1 миқдори сирояти (MOI) SARS-CoV-2 HKU-001a дар панели 9 хати ҳуҷайраҳои инсон ва 11 хати инсонӣ [53]. Монанди натиҷаҳое, ки бо вируси псевдотипӣ мушоҳида шудааст, сирояти устувортарин дар байни хати ҳуҷайраҳои инсон барои ҳуҷайраҳои Calu-3 (шуш) ва Caco-2 (рӯда) мушоҳида шудааст, ки сироят дар Huh7 (ҷигар), 293T (гурда) низ мушоҳида шудааст. , ва ба андозаи камтар, ҳуҷайраҳои U251 (нейронӣ). Дар байни 11 намуди ҳуҷайраҳо, ки дар таҳқиқот ба сироят иҷозат медиҳанд, CPE танҳо дар Vero E6 ва FRhK4 (гурдаи резус) 120 соат пас аз сироят мушоҳида карда шуд, ки бо осеб аз ҷумла яклухткунии ҳуҷайра, ҷудошавӣ, таназзул ва ташаккули синцитий мушоҳида шуд. Ҳатто то 7 рӯз пас аз сироят, CPE дар ҳуҷайраҳои Calu-3, Caco 2, LLCMK2, PK-15 ва RK-13 ​​бо SARS-CoV-2 мушоҳида нашудааст.

    Дар сатҳи баландтари MOI як, омӯзиши тағироти кинетикии протеомикӣ дар сироят ҳам такрори вирусӣ ва ҳам CPE-ро дар ҳуҷайраҳои Caco-2 нишон дод [76]. Бо мониторинги сатҳи ифодаи сафедаҳо, муаллифони ин тадқиқот мушоҳида карданд, ки сироят боиси тағирёбии роҳҳои марказии ҳуҷайра, ба монанди тарҷума, пайвастшавӣ, мубодилаи карбон ва мубодилаи кислотаи нуклеинӣ мегардад. Ин таҳлил бо роҳи паст кардани MOI аз 1 то 0,01 ва зиёд кардани вақти инкубатсия аз 24 то 48 соат тағир дода шуд, то ба якчанд давраҳои такрори вирусҳо барои скрининги антивирусҳо дар таҳлили тасвири дорои мундариҷаи баланд имкон диҳад [77]. Аз экрани 5,632 пайвастагиҳо, аз ҷумла зиёда аз 3,400 номзадҳои клиникӣ, муаллифон 6 пайвастагиро қайд карданд, ки қаблан гузориш дода шуда буданд, ки бар зидди SARS-CoV-2, SARS-CoV ё MERS дар таҳлилҳои антивирусӣ дар Vero E6, Calu-3, ё ҳуҷайраҳои BHK21 (фибробласт гурдаҳои хамстер), бо намунаи монеъшавӣ нисбат ба ҳуҷайраҳои ғайриинсонии Vero E6 ва BHK21 ба ҳуҷайраҳои Калу-3-и одам бештар мувофиқат мекунад. Масалан, камостат ва нафамостат, ингибиторҳои TMPRSS2, ки дар роҳи сатҳи ҳуҷайра барои воридшавии ҳуҷайраҳои вирусӣ нақш мебозанд, нисбат ба ҳуҷайраҳои Vero E6 нисбат ба SARS-CoV-2 дар ҳуҷайраҳои Caco-2 100 маротиба тавонотаранд. Аммо, пайвастагиҳо ба монанди ремдесивир, лопинавир ва мефлокин дар байни намудҳои ҳуҷайра нисбатан мувофиқ буданд.

    Тафсири минбаъдаи механизмҳои гуногуни воридшавӣ ва сирояти SARS-CoV-2, Диттмар ва ҳамкасбон барои муқоисаи фаъолияти зиддивирусии як панели тақрибан 3,000 пайвастагӣ як таҳлили тасвири дорои мундариҷаро истифода бурданд. Камтар аз 1% сироят дар якчанд намуди ҳуҷайраҳо, аз ҷумла ҳуҷайраҳои A549, Calu-1, Huh7, HepG2, HaCaT, IMR90, NCI-H292, CFBE41o ва U2OS мушоҳида карда шуд, аммо сирояти устувор дар хати ҳуҷайраҳои гепатоцити инсон Huh7.5 мушоҳида карда шуд. , ҳуҷайраҳои аз шуш ҳосилшуда Calu-3 ва ҳуҷайраҳои Vero CCL81. Дар байни 3 намуди ҳуҷайра, пайвастагиҳои дорои механизмҳои гуногуни таъсир фаъолияти зиддивирусии тағйирёбанда мушоҳида карда шуданд. Масалан, ингибиторҳои вуруди эндосомӣ, ба монанди ингибитори катепсин Z-FA-FMK ва ингибитори PIKfyve apilimod, дар ҳуҷайраҳои Huh7.5 ва Vero E6 фаъол буданд, аммо на ҳуҷайраҳои Calu-3. Баръакси ин, камостат, як ингибитори протеазаи плазмаи мембранаи TMPRSS2, дар ҳуҷайраҳои Calu-3 фаъол буд, аммо на ҳуҷайраҳои Huh7.5 ва Vero E6, ки минбаъд аҳамияти фаҳмидани тарҷумаи модели ҳуҷайравии сироятро таъкид мекунад.

    Тропизми вирусии SARS-CoV-2 барои намудҳои гуногуни ҳуҷайра эҳтимолан ифодаи дифференсиалии сафедаҳои асосии мизбонро инъикос мекунад, ки дар пайвастшавӣ ва воридшавии вирус иштирок мекунанд. Љадвали 1 љамъбасти маълумотњои ифодаи оммавї барои ретсептори њуљайравии SARS-CoV-2 ACE2 ва барои 5 протеазњо, ки дар синтез ва воридшавии вирус иштирок мекунанд (фурин, TMPRSS2, CTSL, эластаза ва трипсин). Ҳангоме ки CTSL дар ҳама сатрҳои тафтишшуда ифода карда мешавад, сатҳҳои ACE2 ва TMPRSS2 фарқ мекунанд, ки истифодаи ифодаи гетерологии ин генҳоро дар таҳқиқоти қаблӣ бо иштироки Vero E6 ва дигар хатҳои ҳуҷайра шарҳ медиҳад.

    Нуклеотидҳо / воридот ва табдилдиҳӣ

    Скрининги хатҳои ҳуҷайра барои арзёбии пешгузаштаҳои нуклеотидҳо ва нуклеозидҳо ҳамчун ингибиторҳои полимеразаи РНК-и вирусӣ (RdRp) бояд қобилияти воридот ва табдил додани пайвастагиҳоро ба метаболитҳои фаъоли нуклеозид трифосфат (NTP) ба назар гиранд [78]. Ремдесивир [79-81] як доруи фосфорамидати протид мебошад [82], ки воридот ва табдилро дар ҳуҷайраҳои мизбон барои боздор кардани такрори муҳими SARS-CoV-2 RdRp талаб мекунад.

    Гирифтани ҳуҷайраҳои нуклеозидҳои тағирёфта бештар аз ифодаи интиқолдиҳандаҳои консентратсионии мембрана (cNTs) ё интиқолдиҳандагони мембранаи мувозинатӣ/фасилитатсионӣ (ENTs) вобаста аст [83,84]. Табдили дохили ҳуҷайра ба нуклеозидҳо ба нуклеотидҳо тавассути фосфоризатсияи киназаҳои ҳуҷайравӣ сурат мегирад ва ифодаи нокифоя метавонад потенсиали антивирусро коҳиш диҳад [39,85,86].

    Баъзе пешгузаштаҳо экспрессия ва табдили ферментативиро тавассути эстеразҳо ва катепсин А лизосомалӣ талаб мекунанд.

    Аз ин рӯ, мо 5 хати ҳуҷайраҳоро барои қобилияти фосфоризатсия кардани рибонуклеозидҳои аденозин MK-0608 ва GS-441524 (нуклеозиди волидайни ремдесивир) дар муқоиса бо пешгузаштаи ремдесивир GS-5734 озмоиш кардем ва нишон додем, ки ҳуҷайраҳои мизбон қобилияти дифференсиалӣ (қобилияти фаъолсозии доруи 2) доранд. Хатҳои ҳуҷайраҳои гепатоцитҳои HepG2 ва Huh7 фаъолсозии назарраси пешгӯии монофосфати фосфорамидити GS-5734-ро нисбат ба ҳуҷайраҳои гурдаи маймуни сабзи африқоӣ Веро E6, ҳуҷайраҳои гурдаи гурдаи Кранделл-Рис (CRFK) ё ҳуҷайраҳои калу-3-и одам аз сабаби зиёд шудани ҳуҷайраҳои шуш аз сабаби зиёд шудани ҳуҷайраҳои шуш нишон доданд. гепатоцитҳо дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои экстрагепатикӣ [87].

    Консентратсияи 24-соатаи дохили ҳуҷайравии NTP-и доруҳои зиддивирусии аденозин (MK-0608, Gilead Sciences remdesivir prodrug GS-5734 ва Gilead Sciences remdesivir нуклеозиди волидайн GS-441524) пас аз инкубатсия дар 1 мкМ ҳуҷайраҳои E-ро нишон медиҳад. табдил ба шакли фаъоли трифосфат дар муқоиса бо дигар хатҳои ҳуҷайраҳои омӯхташуда. NTP, нуклеозид трифосфат.

    Ҳуҷайраҳои ибтидоӣ/системаҳои намунавӣ

    Хатҳои ячейка усули зудро барои тафтиш ва ҷамъоварии маълумот бо суръати баланд таъмин мекунанд, аммо дар тарҷумаи онҳо маҳдудиятҳо мавҷуданд. Системаҳои парвариши ҳуҷайраҳои ибтидоӣ метавонанд физиологияи мувофиқи ҳуҷайраро дақиқтар модел кунанд. Фаҳмиши ҷараёни сирояти SARS-CoV-2 бо истифода аз натиҷаҳои пайдарпайии як ҳуҷайра аз Атласи инсонӣ (шахсони сироятнашуда) барои муайян кардани ифодаи транскрипсияи ретсепторҳои вирусӣ ба даст оварда шудааст. Ранги сафедаи ин ретсепторҳо нишондиҳандаи беҳтари ифодаи воқеии рӯизаминӣ мебошад, аммо чунин маълумот дар айни замон каманд. Таҳлили РНК аз намунаҳои бофтаи бемори сироятшуда тасвири лаҳзае медиҳад, ки мо аксар вақт вақти фарорасии сироятро намедонем. Системаҳои модели ибтидоии in vitro имкон медиҳанд, ки гипотезаҳоро дар бофтаҳои инсон санҷанд ва ба мо имкон медиҳанд, ки маълумоти муваққатиро дар бораи ифодаи ген/протеин ҷамъоварӣ кунем.

    Бисёр тадқиқотҳо дар бораи сатҳи баланди ифодаи ACE2 ва TMPRSS2 дар ҳуҷайраҳои шуш AT2 бо истифода аз маълумот аз пойгоҳи додаҳои ҷамъиятӣ ва резекцияҳои шуш гузориш доданд [29,88,89]. Фарҳангҳои ҳаво ва моеъи шуш (ALI), ки аз минтақаҳои гуногуни шуш аз шахсони солим гирифта шудаанд, бузургтарин муштараки ACE2 ва TMPRSS2-ро дар ҳуҷайраҳои секретории муваққатии шохаҳои бронхҳо нишон доданд. Инчунин нишон дода шудааст, ки ифодаи сегонаи ACE2, TMPRSS2 ва FURIN ҳангоми дидани бофтаи шуш бо бартарӣ барои ифодаи муштараки ҳадди аққал 2 ретсепторҳо мавҷуд аст [29]. Дар як таҳқиқоти ба наздикӣ, пайдарпаии як ҳуҷайраи (sc) РНК (секв) барои пайгирии РНК-и вирусӣ дар асоси ҳар як ҳуҷайра дар тӯли вақти ҳуҷайраҳои эпителиалии бронхҳои сироятшуда (модели ALI) истифода шуд ва муайян кард, ки ҳадафи асосии SARS-CoV- 2 дар роҳи нафаси болоӣ ҳуҷайраҳои шушҳои кирпнок ҷойгиранд, ҳуҷайраҳое, ки барои хориҷ кардани луоб ва зарраҳои бегона аз шуш масъуланд. Бо пешравии сироят, вирус бо мурури замон ҳуҷайраҳои базавӣ ва клубиро сироят кард, ки онҳо бо истифода аз микроскопияи электронӣ тасдиқ карданд. Илова бар ин, танзими болоравии интерферонҳои навъи I ва III (IFNs), IL-6 ва химокинҳои CXCL9, CXCL10 ва CXCL11 (барои ҷалби ҳуҷайраҳои T/NK муҳим) дар ҳуҷайраҳои сироятшуда ва васеъ бо интерферон ҳавасмандшуда мушоҳида карда шуд. танзими болоравии ген (ISG) дар ҳуҷайраҳои сироятшуда ва инчунин ҳуҷайраҳои нозирон [90]. Дар ҳоле, ки ин пайдарпайии ҳуҷайраҳои ягона ва пайдарпаии як ядро ​​​​дар бораи ифодаи транскриптҳои РНК тафсилоти зиёд медиҳанд, як таҳқиқоти кӯҳна ранг кардани сафедаи ACE2 ва TMPRSS2-ро дар қисмҳои шуш тавассути иммуногистохимия тасдиқ мекунад [91].

    Баръакси ин, дигарон гузориш доданд, ки ҳуҷайраҳои эпителиалии бинӣ баландтарин ифодаи ACE2 дар роҳи нафас доранд. Илова бар ин, тавассути омезиши пойгоҳи додаҳои дастрас, маълум шуд, ки роҳи нафаси болоӣ ифодаи баландтарини генҳои мутаносиби ACE2 дорад ва генҳои дорои функсияи иммунии модарзодӣ ба таври номутаносиб муаррифӣ мешаванд [92]. Махсусан, онҳо гузориш доданд, ки ҳуҷайраҳои косаи бинӣ ифодаи баландтарини ин генҳои иммуниро доранд.

    Дар ҳоле ки фарҳангҳои ALI шуш як модели ибтидоии аз ҷиҳати физиологӣ мувофиқтар аз сабаби таъсири мембранаи апикалӣ ба ҳаво мебошанд, органоидҳои шуш дар омӯзиши SARS-CoV-2 муфиданд. Монанди фарҳангҳои ALI шуш, органоидҳои шуш аз ҳуҷайраҳои бунёдии шуш (калонсолон) ё ҳуҷайраҳои бунёдии плюрипотентии индуксионӣ (ҷанинӣ) гирифта мешаванд ва дар матритсаи дастгирии 3D парвариш карда мешаванд [93]. Бартарии истифодаи фарҳангҳои органоид дар он аст, ки ҳуҷайраҳои бунёдӣ метавонанд пайваста паҳн карда шаванд ва баъдан ба навъҳои ҳуҷайраи баркамолтари эпителий фарқ карда шаванд, ки имкон медиҳад, ки тезтар тавсеа ва тафриқаи ҳуҷайраҳои ибтидоӣ ба рақамҳои кофӣ барои дастгирии скрининги баландтари интиқол дар муқоиса бо фарҳангҳои ALI , ки барои расидан ба камолот аз 21 то 28 рӯз лозим аст. Як гурӯҳ гузориш доданд, ки органоидҳои шушро бомуваффақият тафтиш кардани китобхонаи доруҳои аз ҷониби Идораи озуқа ва доруворӣ (FDA) тасдиқшудаи Прествик бо псевдовируси люциферазаи SARS-CoV-2 [94]. Илова бар ин, онҳо 3 аз 4 зарбаро дар органоидҳои колоники аз hPSC ҳосилшуда тасдиқ карданд.

    Дар ҳоле ки сатҳи луобпардаи луобпарда эҳтимол макони вуруди SARS-CoV-2 аст, санҷиши бофтаҳои дигар нишон дод, ки сатҳи баланди коэкспрессияи ACE2/TMPRSS2 дар энтероситҳои рӯдаи рӯдаи рӯда ва рӯдаи рӯда мавҷуд аст ва рӯда метавонад ифодаи баландтар дошта бошад. аз ин ретсепторҳо нисбат ба шуш [30,31]. Мушоҳидае, ки баъзе беморони COVID-19 пеш аз пайдо шудани нишонаҳои нафаскашӣ ва инчунин ҳангоми пешрафти беморӣ мушкилоти меъдаю рӯда доранд, метавонад роҳи интиқоли наҷосат-даҳониро пешниҳод кунад [95,96] далелҳои тасдиқкунандаи ин ба наздикӣ баррасӣ шуданд [97,98]. Ба ҳамин монанд, сирояти меъдаву рӯда / изтироб қаблан барои коронавирусҳои бо ҳам алоқаманди SARS ва MERS мушоҳида шуда буд [99,100]. Маълумоти транскриптсиониро намунаҳои эндоскопии як бемори COVID-19 (суруд, меъда, рӯдаи дувоздаҳ ва рӯдаи рост) дастгирӣ мекунанд, ки ранги ретсептори ACE2-ро дар ҳуҷайраҳои эпителиалии меъдаю рӯда нишон медоданд, аммо на дар эпителийи сурхчатоб [101].

    Тадқиқотҳо фенотипи мушоҳидашудаи меъдаю рӯдаро бо ифодаи ҳуҷайраҳои ACE2+/TMPRSS2+ дар рӯда, бо сатҳи баландтарини ифода дар рӯдаи рӯдаи рӯда ва баъдан рӯдаи рӯда пайваст карданд. Хулоса, сирояти органоидҳои рӯда бо SARS-CoV-2 бомуваффақият буд ва онҳо репликатсияи вирусро бо энтероситҳо, ки навъи асосии ҳуҷайраҳои ҳадафнок мебошанд, дастгирӣ карданд [31]. Ҷолиб он аст, ки мушоҳида карда шуд, ки навъи III IFN, аммо на навъи I IFN, пас аз сирояти колоноидҳо бо SARS-CoV-2 боло танзим карда шуд, ки ин ситокин метавонад дар ин сироят нақши муҳофизатӣ дошта бошад [102].

    Модели органоидҳои рӯда имкон дод, ки тавсифи минбаъдаи воридшавии вирусҳо. Бо истифода аз псевдовируси VSV-SARS-CoV-2 (ифодаи протеини хӯшаи SARS-CoV-2), нишон дода шуд, ки TMPRSS2 ва TMPRSS4 ҳарду барои воридшавии фузогенӣ ба энтероцитҳои дувоздаҳ заруранд [103]. Илова бар ин, муаллифон сирояти афзалиятноки мембранаи апикалии энтероцитҳоро мушоҳида карданд ва тасвирҳо ҷамъшавии қутбшудаи вирусӣ ва озодшавӣ аз мембранаи апикалӣ пешниҳод карданд. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки чӣ гуна маълумотро аз ҳуҷайраҳо/бофтаҳои ибтидоӣ ҳангоми нусхабардорӣ дар системаи модели ибтидоии аз ҷиҳати физиологӣ мувофиқ боз тақсим кардан мумкин аст.Истифодаи системаҳои модели ибтидоии шуш ва рӯда барои омӯзиши SARS-CoV-2 хеле муҳим аст, зеро онҳо ифодаи ретсепторҳо ва эҳтимолан аксуламалҳои физиологии дар vivo дидашударо дақиқтар такрор мекунанд.

    Бояд қайд кард, ки дигар системаҳои ex vivo, ба монанди эксплантҳои бофта, барои омӯзиши сироятҳои вирусии роҳи нафас истифода шудаанд ва эҳтимолан барои омӯзиши SARS-CoV-2 истифода мешаванд. Моделҳои гуногунҷанбаи in vivo низ барои беҳтар фаҳмидани вокунишҳои мизбон ба ин вирус босуръат таҳия карда мешаванд. Моделҳои in vivo ва ex vivo, ки ба наздикӣ таҳия шуда буданд ё дар ҳоли таҳия қарор доранд, аз ҷумла муш, паром, хомяк ва моделҳои ҳайвоноти ғайриинсонӣ баррасӣ карда шуданд [104,105].

    Ҳуҷайраҳои иммунии модарзод

    Норасоии иммунӣ дар беморони COVID-19 ба таври васеъ тавсиф шудааст, ба монанди танзими ҳуҷайраҳои Т, B-ҳуҷайраҳо ва ҳуҷайраҳои иммунии модарзод [106,107]. Махсусан, афзоиши паҳншавӣ ва фаъолшавии ҳуҷайраҳои иммунии модарзод дар беморони гирифтори бемории вазнини COVID-19 мушоҳида шудааст [108]. Ҷолиб он аст, ки гузориш дода шуд, ки дар моноситҳои аз беморони COVID-19 гирифташуда дар муқоиса бо донорҳои солими инсон фарқиятҳои назарраси морфологӣ ва функсионалӣ мавҷуданд [109]. Таҳлилҳои пас аз марги узвҳои дуюмдараҷаи лимфоидӣ аз беморони COVID-19 ифодаи ретсептори ACE2 ва мавҷудияти нуклеопротеини SARS-CoV-2 дар макрофагҳои CD169+ тасдиқ карданд [110]. Аммо, маълум нест, ки оё SARS-CoV-2 метавонад ба ҳуҷайраҳои иммунии модарзод сироят кунад ва такрор кунад.

    Дараҷаҳои гуногуни воридшавӣ ва такрори вирус дар ҳуҷайраҳои иммунии модарзодии мубталои SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-OC43 ва HCoV 229E мушоҳида шудааст [111]. Ба наздикӣ дар приматҳои ғайриинсонӣ [112] ва одамон [30] ифодаи ҳадди ақали ретсепторҳои калидӣ барои воридшавии SARS-CoV-2, аз ҷумла ACE2 ва TMPRSS2 дар ҳуҷайраҳои иммунии модарзод ба монанди моноцитҳо ва макрофагҳо гузориш дода шудааст. Илова бар ин, моноцитҳо метавонанд сатҳи баланди CD147 [113] -ро, як ретсептори эҳтимолӣ барои воридшавии SARS-CoV-2-ро ифода кунанд [114].

    Ду нашрияи охирин муайян карданд, ки моноситҳои ибтидоии CD14+ аз донорҳои солими инсон ба сирояти SARS-CoV-2 ба осонӣ ҳассосанд. Понтелли ва ҳамкасбон инро тавассути сироят кардани моноситҳои ибтидоии инсон ex vivo бо SARS-CoV-2 ва чен кардани антигенҳои вирусӣ ва объектҳои dsRNA дар ҳуҷайраҳои сироятшуда нишон доданд [115]. Онҳо коҳиши назарраси воридшавии вирусро ҳангоми сироят ёфтани моноситҳо дар ҳузури хлориди аммоний мушоҳида карданд, ки эҳтимолан муҳим будани роҳи эндоситикиро нишон медиҳад. Ба ҳамин монанд, Кодо ва ҳамкорон сирояти SARS-CoV-2-ро дар моноситҳои ибтидоии инсон дар асоси андозагирии транскриптҳои вирусӣ тавассути qPCR мушоҳида карданд [116]. Ғайр аз он, онҳо мушоҳида карданд, ки сирояти SARS-CoV-2 аз моноситҳо боиси индуксияи гликолиз ва баланд шудани сатҳи транскрипти якчанд генҳо, аз ҷумла ретсептори асосии воридшавии вируси ACE2 мегардад.

    Бо назардошти ифодаи ҳадди ақали ретсепторҳои ACE2 дар моноцитҳо, ин мушоҳидаҳо хеле тааҷҷубоваранд. Таҳлили амиқи вирусологии такрори ҳосилхез дар моноситҳо мушоҳидаҳоро дар ин 2 нашрияи дар боло зикршуда хеле тақвият хоҳад дод. Ғайр аз он, барои беҳтар фаҳмидани он, ки оё (i) моноцитҳо/макрофагҳо тавассути сирояти мустақим тавассути пайвасти ACE2 ё тавассути фагоцитоз ба SARS-CoV-2 дучор мешаванд (ii) ACE2 дар моноцитҳои сироятшуда ва ҳуҷайраҳои нозир тавассути секрецияи медиаторҳои илтиҳобӣ ба вуҷуд омадаанд, таҳқиқоти иловагӣ лозим аст. ва (iii) ифодаи ретсепторҳои иловагии воридшавии мизбон ба монанди CD147 ва Neuropilin-1 метавонад дар моноситҳо ифода карда шавад, то сироятро ба таври мустақил аз ACE2 осон кунад [69].

    Арзёбии идомаи ҳассосияти ҳуҷайраҳои иммунии модарзод ба SARS-CoV-2 фаҳмиши кунунии моро дар бораи таъсири мутақобилаи мизбон SARS-CoV-2 ва инчунин иммунопатогенези дар беморони COVID-19 мушоҳидашуда хеле беҳтар хоҳад кард.

    Суханони ҷамъбастӣ

    Скрининги фенотипӣ барои муайян кардани ингибиторҳои нав барои бемориҳои сироятӣ як кӯшиши гаронарзиш ва вақтталаб аст. Муҳимтарин қарорҳо интихоби хати ҳуҷайра ё системаҳои моделӣ, ки дар он экран гузаронида мешавад ва мавҷудияти экранҳои дуюмдараҷаи дахлдор барои аз байн бурдани хитҳои номатлуб ва афзалият додани онҳое, ки таваҷҷӯҳи эҳтимолиро доранд, мебошанд. Дар робита ба ин, арзёбии потенсиали антивирусӣ барои такрори вируси SARS-CoV-2 бояд мулоҳизаҳои асосии зеринро ба инобат гирад. Ифодаи ресепторҳои ACE2 ва протеазҳои асосии мизбон ба табиати хитҳои муайяншуда таъсир мерасонанд [117]. Экранҳо дар ҳуҷайраҳои Vero E6 агентҳоеро, ки ба роҳи эндоситикӣ таъсир мерасонанд, ҳамчун дорои фаъолияти зиддивирусӣ муайян кардаанд, аммо дар заминаи сирояти клиникӣ муҳосираи ҳам роҳҳои вуруди вирусии эндоситикӣ ва рӯи ҳуҷайра метавонад талаб карда шавад. Илова ба фаҳмидани роҳи воридшавии вирус, ки SARS-CoV-2 дар намудҳои мушаххаси ҳуҷайраҳои барои скрининг истифодашаванда истифода мебарад, бояд ба дараҷаи фаъолсозии нуклеотидҳо ва фосфоризатсия дар системаи скрининги in vitro мушоҳида карда шавад. ба наздикй нишон дода шудааст [39]. Системаҳои модели пайдошаванда, аз ҷумла фарҳангҳои ALI ва органоид, системаҳои миметикии мизбон барои арзёбии номзадҳо мебошанд, гарчанде ки онҳо маҳдудиятҳои худро доранд. Ниҳоят, нақши эҳтимолии ҳуҷайраҳои иммунии модарзод дар сироят як баррасии муҳими иловагӣ мебошад. Интихоби системаҳои мувофиқи модели in vitro, ки ҷанбаҳои сершумори биологияи SARS-CoV-2-ро инъикос мекунанд, барои беҳтар кардани муваффақият дар кӯшишҳои кунунӣ ва ояндаи кашфи маводи мухаддир муҳим хоҳад буд.


    Маълумоти дастгирӣ

    S1 Расми Таҳлили филогенетикии изолятҳои SARS-CoV-2, ки дар ин таҳқиқот тавлид шудаанд.

    Таҳлили филогенетикии пайдарпаӣ, ки аз 14 изолятсияи SARS-CoV-2 P2, дар якҷоягӣ бо пайдарпаии SARS-CoV-2 аз Alm et al. [26], ки гуногунрангии вирусиро дар минтақаи аврупоии ТУТ дар як вақт нишон медиҳанд. Вуҳан/WH04/2020 (EPI_ISL_406801), ки ба синфи 19В тааллуқ дорад, ҳамчун гурӯҳи берунӣ интихоб карда шуд. Дарахт дар асоси қабатҳои SARS-CoV-2 Nextstrain ранг карда шудааст ва доираҳо мавқеъи 14 изолятсияи SARS-CoV-2-ро, ки дар ин таҳқиқот тавлид шудаанд, нишон медиҳанд. Сатри миқёс шумораи ивазкунии нуклеотидҳоро дар як сайт нишон медиҳад. SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S2 Расми. Хусусиятҳои изолятҳои интихобшудаи SARS-CoV-2 дар ҳуҷайраҳои Vero-E6.

    (А) Ҳуҷайраҳои Vero-E6 бо изолятҳои нишондодашудаи SARS-CoV-2 дар MOI 0,01 PFU/ҳуҷайра сироят ёфтаанд. Супернатантҳо дар вақтҳои нишондодашуда пас аз сироят ҷамъоварӣ карда шуданд ва титрҳои SARS-CoV-2 тавассути таҳлили лавҳа муайян карда шуданд. Маълумот воситаҳо ва инҳирофоти стандартиро аз 3 таҷрибаҳои мустақил бо ҳар як озмоиш бо истифода аз 1 чоҳи инфиродӣ нишон медиҳад. Хати нуқтае, ки аз меҳвари Y дар 10 2 PFU/mL убур мекунад, санҷиши LoD-ро нишон медиҳад. (Б.) Қиматҳои AUC барои маълумоти репликатсияи вирус, ки дар (A) нишон дода шудаанд, ба титри инкулятсияи изолятсияи мувофиқ нормал карда шудаанд. Маълумот воситаҳо ва инҳирофҳои стандартиро аз 3 таҷрибаи мустақил ифода мекунад. Барои санҷидани фарқиятҳои назаррас байни изолятсияҳои инфиродӣ ANOVA-и яктарафа дар маълумотҳои бо log2 табдилёфта анҷом дода шуд (саҳ < 0,0001). Барои санҷидани аҳамияти оморӣ бар зидди BavPat1, ҷуфтшуда т санҷиш дар маълумоте, ки бо log2 табдил дода шудааст, истифода шудааст (**саҳ < 0,005 ***саҳ < 0,0005). Барои маълумоти асосӣ, нигаред Маълумоти S1. AUC, майдони зери каҷ LoD, лимити ошкоркунии MOI, зиёдшавии сирояти PFU, воҳиди плака ташкилкунандаи SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S3 Расми Хусусият ва тасдиқи фарҳангҳои ибтидоии BEpC инсон.

    (А) Ҳангоми тафриқаи ибтидоии BEpC инсон (донори 1) ба эпителияи псевдостратификацияшудаи роҳи нафас дар ALI, TEER ҳар ҳафта чен карда мешуд. Маълумот арзишҳои миёнаи TEER ва инҳирофҳои стандартиро аз 3 чоҳи мустақил дар ҳар як вақт нишон медиҳанд. (Б.) BEpC-ҳои тафовутшуда аз донори 1 барои ҳуҷайраҳои кирмакдор (кабуди β-тубулин), пайвандҳои зич (ZO-1 магента) ва ядроҳо (кабуди DAPI) собит ва ранг карда шуданд. Сатри миқёс 25 мкмро нишон медиҳад. (C) BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 1 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU аз ҳар як изолятсияи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд (нигаред ба расми 2B). Дар вақтҳои зикршуда пас аз сироят, намунаҳои базолатералӣ ҷамъоварӣ карда шуданд ва титрҳои вирус тавассути таҳлили лавҳа муайян карда шуданд. Маълумот воситаҳо ва инҳирофҳои стандартиро аз 2 нусхаи мустақил ифода мекунад. Хати нуқтае, ки аз меҳвари Y дар 10 2 PFU/mL убур мекунад, санҷиши LoD-ро нишон медиҳад. Барои маълумоти асосӣ, нигаред Маълумоти S1. ALI, интерфейси ҳаво ва моеъи BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ LoD, маҳдудияти муайянкунии PFU, воҳиди плаксози SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2 TEER, муқовимати электрикии трансепителиалӣ ZO-1, минтақаи occludens протеини 1.

    S4 Расми. Тавсифи изолятҳои интихобшудаи SARS-CoV-2 дар донорҳои иловагии BEpC инсон.

    (А ва С) BEpC-ҳои фарқкунанда аз донорҳои 2 (A) ва 3 (C) бо 6,000 PFU аз изолятсияи SARS-CoV-2 аз ҷониби апикалӣ сироят карда шуданд. Дар вақтҳои зикршуда пас аз сироят, шустани апикалӣ ҷамъоварӣ карда шуд ва титрҳои вирус тавассути таҳлили лавҳа муайян карда шуданд. Маълумот воситаҳо ва инҳирофоти стандартиро аз 3 нусхаи мустақил ифода мекунад. Хатҳои нуқтае, ки меҳварҳои y-ро дар 10 2 PFU/mL убур мекунанд, санҷиши LoD-ро нишон медиҳанд. (Б ва Д) Қиматҳои AUC барои маълумоти репликатсияи вирус, ки дар (A ва C) нишон дода шудаанд, ба титри эмкунии изолятсияи мувофиқ нормал карда шудаанд. Маълумот воситаҳо ва инҳирофҳои стандартиро аз 3 таҷрибаи мустақил ифода мекунад. ANOVA-и 1-роҳӣ дар маълумоти бо log2 табдилёфта анҷом дода шуд, то фарқияти ҷиддии байни изолятсияҳои инфиродӣ (н.ҳо. барои донор 2) санҷида шавад. саҳ < 0,0001 барои донор 3). Барои санҷидани аҳамияти оморӣ бар зидди BavPat1 (D), ҷудонашаванда т санҷиш дар маълумоте, ки бо log2 табдил дода шудааст (*) истифода шудаастсаҳ < 0,05 **саҳ < 0,01). Бояд қайд кард, ки BavPat1 дар BEpCs аз донори 2 (B) як фенотипи нофаҳмошудаи заифшударо нишон дод. т санҷиш дар маълумоти бо log2 табдилёфта барои санҷидани аҳамияти оморӣ нисбат ба IMV3 истифода шудааст (*саҳ < 0,05 **саҳ < 0,01). (Э) Намоиши қуттии қимматҳои AUC барои маълумоти репликатсияи вирус аз 3 донори мустақил (маълумот аз B ва D ва расми 2С), ки ба титри инкулятсияи изолятсия ва донори мувофиқ ба эътидол оварда шудааст. Инҳирофоти миёна ва стандартӣ нишон дода шудааст. Секунҷаҳои сурх маълумотеро, ки аз донори 1 гирифта шудаанд, ифода мекунанд. Барои маълумоти асосӣ, нигаред Маълумоти S1. AUC, майдони зери каҷ BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ LoD, маҳдудияти муайянкунии PFU, воҳиди плаксози SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S5 Расм. Рангкунии ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятёфтаи SARS-CoV-2 ва ҳуҷайраҳои кирмакдор дар BEpCs аз донори 2.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 2 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU аз изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо собит карда шуданд, гузаранда шуданд ва барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta) ва ҳуҷайраҳои кирпикшакл (cyan β-тубулин) ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калонкунӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плаксоз SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S6 Расми рангкунии ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2 ва ҳуҷайраҳои гоблет дар BEpCs аз донори 2.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 2 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU аз изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta) ва ҳуҷайраҳои гоблет (MUC5AC cyan) собит карда шуданд, гузаранда ва ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калонкунӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плаксоз SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S7 Расми рангкунии ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2, ҳуҷайраҳои клубӣ ва ҳуҷайраҳои базавӣ дар BEpCs аз донори 2.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 2 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU аз изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta), ҳуҷайраҳои клубӣ (кабуди утероглобин) ва ҳуҷайраҳои базалӣ (P63 зард) собит карда шуданд, гузаранда шуданд ва ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калонкунӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плаксоз SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S8 Расм. Рангкунии ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятёфтаи SARS-CoV-2 ва ҳуҷайраҳои кирмакдор дар BEpCs аз донори 3.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 3 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо собит карда шуданд, гузаранда шуданд ва барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta) ва ҳуҷайраҳои кирпикшакл (cyan β-тубулин) ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калонкунӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плака ташкилкунандаи SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S9 Расми рангкунии ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2 ва ҳуҷайраҳои гоблет дар BEpCs аз донори 3.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 3 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta) ва ҳуҷайраҳои гоблет (MUC5AC cyan) собит карда шуданд, гузаранда ва ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калонкунӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плаксоз SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    S10 Расм. Рангҳои ғайримустақими иммунофлуоресцентии ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2, ҳуҷайраҳои клубӣ ва ҳуҷайраҳои базавӣ дар BEpCs аз донори 3.

    BEpC-ҳои фарқкунанда аз донори 3 аз ҷониби апикалӣ бо 6,000 PFU аз изолятсияи нишондодашудаи SARS-CoV-2 сироят карда шуданд. Дар 72 соат пас аз сироят, ҳуҷайраҳо барои мавҷудияти ҳуҷайраҳои сироятшуда (dsRNA magenta), ҳуҷайраҳои клубӣ (кабуди утероглобин) ва ҳуҷайраҳои базалӣ (P63 зард) собит карда шуданд, гузаранда ва ранг карда шуданд. Ядроҳо бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд. Тирчаҳо ҳамҷояшавиро нишон медиҳанд. Сутунҳои миқёс 50 мкм барои 20 × калоншавӣ ва 8 мкм барои 100 × калоншавиро ифода мекунанд. Намояндаи тасвирҳои максималии проексияи z-стекҳо аз як озмоиш нишон дода шудаанд. BEpC, ҳуҷайраи эпителиалии бронхиалӣ PFU, воҳиди плака ташкилкунандаи SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    Ҷадвали S1. Арзишҳои Ct ва натиҷаҳои муваффақият/нокомии кӯшишҳои ҷудокунии вирус, аз 67 намунаи беморон, ки барои SARS-CoV-2 PCR мусбат буданд.

    Ct, ҳадди сикли SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    Ҷадвали S2. Вариантҳои пайдарпаии SARS-CoV-2, ки аз ҷониби NGS дар маводи бемор ва гузариши 2 изолятҳои вирус муайян карда шудаанд.

    NGS, пайдарпайии насли оянда SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    Ҷадвали S3. Вариантҳои пайдарпайи SARS-CoV-2, ки аз ҷониби NGS дар захираҳои корӣ (гузариши 3) изолятҳои вирус муайян карда шудаанд.

    NGS, пайдарпайии насли оянда SARS-CoV-2, Синдроми шадиди роҳи нафас Coronavirus 2.

    Маълумоти S1. Арзишҳои ададии инфиродӣ, ки дар асоси маълумоти ҷамъбастӣ дар панелҳои расм нишон дода шудаанд.


    Муҳокима

    Пандемияи босуръати глобалии SARS-CoV-2 аллакай ба саломатии инсон, системаи тандурустии иҷтимоӣ, иқтисоди ҷаҳонӣ ва ҳатто идоракунии ҷаҳонӣ таҳдиди бузург дорад ва ин таъсирҳо шояд муддати тӯлонӣ идома диҳанд. Мо бояд мантиқи эпидемияи SARS-CoV-2-ро омӯзем ва вирусҳои номаълуми ҳайвоноти ваҳшӣ дар табиатро пешакӣ омӯзем, то огоҳии барвақт кунем. Дафъаи дигар, ба истиснои SARS-CoV-2, мумкин аст хуруҷи дигар намудҳои вирусҳо рух диҳад. Таҷрибаҳои омӯзишӣ ва дарсҳо дар бораи вирусҳои гуногун метавонанд ба ҳамдигар ишора кунанд.

    Фаҳмиши кофӣ дар бораи фарқиятҳои сафедаҳои сохторӣ ва ғайрисохторӣ дар байни SARS-CoVs ва дигар коронавирусҳо метавонад ба таҳияи доруҳои терапевтӣ барои сирояти SARS-CoV-2 мусоидат кунад. Протеинҳои ғайрисохтории коронавирусҳо, ки метавонанд ба одамон сироят кунанд, бо сохтори SARS-CoV-2 нисбатан шабеҳанд. Ба ғайр аз протеини S, аксари сафедаҳои сохторӣ, аз қабили сафедаи E ва сафедаи M, дар меъмории сафеда дар байни SARS-CoV-2 ва дигар CoV-ҳои маълуми инсон фарқияти назаррас надоштанд. Протеини S-и CoVs барои пайваст кардани ретсепторҳои сатҳи мизбон ҳангоми вуруди ҳуҷайраи мизбон масъул аст. CoV-ҳои гуногун ретсепторҳои гуногуни сатҳи ҳуҷайраро эътироф мекунанд. Масалан, MERS-CoVҳо ретсептори дипептидил пептидаз 4-ро эътироф мекунанд. Бо вуҷуди ин, SARS-CoV ва SARS-CoV-2 ретсептори ACE2-ро эътироф мекунанд. Ин метавонад сабаби он бошад, ки CoV-ҳои гуногун механизми воридшавии мизбон доранд. Илова бар ин, SARS-CoV-2 RBD нисбат ба SARS-CoV RBD наздикии баландтари ҳатмии hACE2 дорад, ки вуруди муассири ҳуҷайраҳоро дастгирӣ мекунад. Баръакси SARS-CoV, вуруди SARS-CoV-2 тавассути фурин протеинконвертаза пешакӣ фаъол карда мешавад, ки вобастагии онро аз протеазаҳои ҳуҷайраҳои мавриди ҳадаф барои воридшавӣ коҳиш медиҳад. Назорати баланди ҳатмии hACE2-и RBD ва пеш аз фаъолсозии фурин аз хӯша ба SARS-CoV-2 имкон медиҳад, ки воридшавии муассири ҳуҷайраҳоро ҳангоми саркашӣ аз назорати иммунӣ нигоҳ дорад. Ин хусусиятҳо метавонанд ба паҳншавии васеи вирус мусоидат кунанд.

    Бо сабаби маълумоти маҳдуд дар бораи SARS-CoV-2, дар айни замон ягон доруи табобатӣ ё ваксинаҳои тасдиқшуда барои табобати COVID-19 мавҷуд нест. Вақте ки эпидемияи ҷаҳонӣ бадтар мешавад, ба ваксинаҳои муассир ва бехатар, антителоҳо ва доруҳои мушаххаси зидди SARS-CoV-2 эҳтиёҷоти фаврӣ доранд. Интизор меравад, ки антителоҳои безараргардонанда барои сирояти SARS-CoV-2 самаранок бошанд, аммо хароҷоти онҳо, миқёси истеҳсол ва сатҳи фарогирии онҳо то ҳол саволҳо боқӣ мемонанд. Таҳияи ваксина инчунин бо мушкилот, ба монанди саривақтӣ ва бесамарӣ аз сабаби тарҳрезии ваксина ва/ё мутацияи вирус рӯбарӯ мешавад.

    Баръакси ваксина, ки механизм ва масири нисбатан равшани рушд дорад, дар айни замон таҳияи доруҳои зиддивирусии дорои потенсиали баланд ва бехатарии баланд метавонад аз сабаби фаҳмиши нопурраи мо дар бораи ҷаҳони вирус ва вокуниши мизбон мушкилтар бошад. Шояд ин сабаби он бошад, ки то имрӯз ягон доруи зиддивирусии қаноатбахш мавҷуд нест. Потенсиал дар vivo таъсири заҳрноки як доруи зидди вирусӣ, ки самаранок арзёбӣ мешавад in vitro метавонад чапакзании фармакологии худро ба таври ноумедона фаро гирад. Ғояҳо ва роҳҳои нав ва ғайримуқаррарии тарҳрезӣ ва таҳияи доруҳои зидди вирусӣ барои рафъи камбудиҳои таҳқиқоти кунунии маводи мухаддир дар асоси редуксионизм заруранд.Дар ин ҷиҳат метавон тибби анъанавии Чинро дар асоси холизм, бахусус формулаҳои гиёҳи тиббии чиниро баррасӣ кард, ки дар мубориза бар зидди COVID-19 дар Чин самаранок мебошанд (Ang etਊl., 2020 Luo etਊl., 2020 Ren et& #xa0al., 2020 Zhang et al., 2020a Zhong etਊl., 2020), гарчанде ки таҳқиқоти минбаъдаи механикӣ ва озмоишҳои миқёси клиникӣ кафолат дода мешаванд.

    Вақтҳои охир дар бисёр кишварҳои ҷаҳон сармоягузории худро ба тадқиқот ва таҳияи доруҳои зидди вирусӣ, антитело ва ваксина зиёд карданд. Эҳтимол суръат бахшидан ба таҳияи ваксинаҳо роҳи калидии ҳалли ин офати ҷаҳонӣ аст. Тавассути кӯшишҳои муштарак дар саросари ҷаҳон, одамон метавонанд дар ояндаи наздик технологияҳои муассири зидди SARS-CoV-2-ро таҳия кунанд.


    Натиҷаҳо

    Фаровонии протеом ва устувории гармӣ ҳангоми сирояти SARS-CoV-2

    Азбаски патогенҳои вирусӣ бояд механизми протеини эндогении мизбонро барои репликатсияи онҳо ғорат кунанд, мо фикр кардем, ки TPP як воситаи пурқуввате барои ошкор кардани тағироти функсионалӣ ҳангоми сироят бо SARS-CoV-2 хоҳад буд (Савицки). ва дигарон, 2014). Барои тавлиди профилҳои устувории гармии протеом дар ҷараёни маъмулии TPP, аликвотҳои ҳуҷайра ба даҳ ҳарорати гуногун дучор мешаванд, то дар ҷои кушодани протеин. Пас аз он ҳуҷайраҳо лизис карда мешаванд, сафедаҳои ҳалнашаванда хориҷ карда мешаванд ва фраксияи сафедаи ҳалшаванда дар ҳар як ҳарорат ҷамъоварӣ карда мешавад ва бо протеомикаи миқдорӣ дар асоси масс-спектрометрӣ таҳлил карда мешавад (Бечер). ва дигарон, 2016, 2018). Барои таъмини мутобиқат бо муҳити кории BSL3, мо аввал протоколи стандартии TPP-и худро (Franken) мутобиқ кардем. ва дигарон, 2015) бо иваз кардани қадамҳои центрифугакунӣ, ки дар акси ҳол метавонад ба тавлиди аэрозолҳои дорои патогенҳои ҳавоӣ оварда расонад - бо як қадами филтратсия, ки тавассути вакуум барои хориҷ кардани сафедаҳо, ки мумкин аст дар дохили кабинети ҷараёни ламинарии HEPA филтршуда анҷом дода мешавад (расми 1A нигаред ба мавод ва усулҳо). барои тафсилот). Мо тасдиқ кардем, ки ин қадам ба мисли тартиби қаблии центрифугакунӣ самаранок буд (Замимаи расми S1A ва B).

    Расми 1. Арзёбии глобалии фаровонии мизбон ва тағирёбии гармидиҳӣ ҳангоми сирояти SARS-CoV-2

    1. Моноқабатҳои Caco-2, ки аз 1,5е 6 ҳуҷайра дар як намуна иборатанд, бо SARS-CoV-2 дар MOI 0,5 сироят ёфтаанд (ниг. Маводҳо ва усулҳо). Дар як нуқтаи вақт се нусхаи аз ҷиҳати биологӣ мустақил ҷамъоварӣ карда шуд. Намунаҳо ба вакуумӣ дар асоси 2D-TPP тоб оварда шуданд. Пас аз хориҷ кардани сафедаҳои ҳалнашаванда, фраксияҳои ҳалшавандаи боқимонда бо барчаспҳои массаи изобарӣ (TMTpro) нишонгузорӣ карда шуданд, то ки миқдори сафедаҳоро таъмин кунад. Намунаҳо дар тарҳбандии 2D-TPP бо мақсади муқоисаи устувории гармии сафеда ва фаровонӣ дар тӯли вақти сироят муттаҳид карда шуданд (Бечер ва дигарон, 2018). сироятнашуда (т−1) нуқтаи вақт ҳамчун истинод барои ҳисоб кардани тағироти қабат (FC) истифода шудааст. Тағйироти назарраси сафеда (фаровонӣ ва устувории гармӣ) ҳамчун қитъаҳои доира барои сафедаҳои инфиродӣ, тавре ки қаблан тавсиф шудааст (Бечер) ва дигарон, 2018). Доираҳои дарунӣ ба фаровонии сафедаҳо ва доираҳои берунӣ ба тағирёбии устувории гармӣ мувофиқат мекунанд (Н. = 3).
    2. Ҳуҷайраҳои Caco-2 бо SARS-CoV-2 мувофиқи (A) сироят ёфтаанд. Ҳуҷайраҳо шуста, собит карда шуданд ва бо DAPI (кабуд) ранг карда шуданд, то ядроҳои ҳуҷайраро визуалӣ кунанд ва бо антиденои зидди N-протеини (сурх) инкубатсия карда шаванд, то ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2. Сатри миқёс 10 микронро нишон медиҳад.
    3. Сатҳи сироят бо истифода аз нармафзори автоматии тасвирӣ (ниг. Маводҳо ва усулҳо) ҳисоб карда шуд, ки аз шаш майдони назар дар як нуқтаи вақт барои як нусхаи биологӣ ҳисоб карда шудааст. Нуқтаи маълумот маънои намунаро нишон медиҳад ва хато хатои стандартии миёнаро (SEM) нишон медиҳад (Н. = 3).
    4. SARS-CoV-2 протеинҳои муайяншударо ҳамчун функсияи вақт тарҳрезӣ кардаанд, ки дар он ҳар як нуқтаи дода такрори дигарро ифода мекунад (Н. = 3).

    Сипас, мо ҷараёни кории мутобиқшудаи TPP-ро барои омӯхтани он, ки чӣ гуна сирояти SARS-CoV-2 устувории гармии протеома ва фаровониро тағир медиҳад, истифода бурдем. Ҳуҷайраҳои Caco-2, ки ба сирояти SARS-CoV-2 иҷозат медиҳанд (Stanifer ва дигарон, 2020 Бойкова ва дигарон, 2020), дар се маротиба бо SARS-CoV-2 бо миқдори зиёди сироят (MOI) 0,5 дар тӯли 1 соат сироят ёфтаанд, пас аз он зарраҳои вирусии пайвастнашуда хориҷ карда шуданд ва намунаҳо дар 1, 2, 4, 7, 12, 24 ва 48 соат пас аз сироят (расми 1А). Чор соат пас аз илова кардани вирус

    5,2% ҳуҷайраҳо сироят ёфтаанд, ки сатҳи сирояти ҳуҷайраҳо пас аз 24 соат тақрибан 18% ба авҷи худ мерасад (расми 1B ва C). Дар ҳар як нуқтаи вақт, намунаҳо бо истифода аз хориҷ кардани агрегатҳои вакуумӣ, тавре ки дар боло тавсиф шуда буданд, ҷамъоварӣ ва коркард карда шуданд ва тавассути протеомикаи миқдорӣ дар асоси масс-спектрометрӣ таҳлил карда шуданд (расми 1А).

    Мо 7,414 протеинро бо ҳадди аққал ду пептидҳои беназир кашф кардем. Ин се протеини вирусиро дар бар мегирад: гликопротеини хӯша (S), нуклеопротеин (N) ва Orf9b. Тағйироти фаровони ин се сафеда бо мурури замон асосан мушоҳидаҳои микроскопиро барои такрори вирусҳо такрор карданд (расми 1D). Кинетикаи паҳншавии SARS-CoV-2 ва фарогирии протеини вирусӣ бо онҳое, ки қаблан дар ҳуҷайраҳои Caco-2 гузориш дода шуда буданд, муқоисашаванда буданд (Бойкова ва дигарон, 2020). Пас аз он мо тағироти фаровонро нисбат ба назорати сироятнашуда барои 5,564 сафедаҳо (дар ду ҳарорати пасттарин дар ҳадди аққал ду такрор муайян карда шуданд) ва тағирёбии устувории гармиро барои 4,076 сафедаҳо (дар ду ҳарорати пасттарин дар ҳадди аққал ду такрор ва дар маҷмӯъ муайян карда шуданд) ҳисоб кардем. дар на камтар аз даҳ ҳарорат муайян карда шудааст Маҷмӯи EV1 барои тафсилот ба мавод ва усулҳо нигаред). Аз ин 350 сафеда дар фаровонӣ тағйироти назаррас нишон доданд (|з-хол | > 1.96 ва q-арзиш < 0.05 Барои тафсилот ба мавод ва усулҳо нигаред) ва 278 сафеда тағиротро дар устувории гармӣ ҳадди аққал дар як нуқтаи вақт нишон доданд (Маҷмӯи маълумотҳои EV1, Замимаи расми S2). Мувофиқи мушоҳидаҳои қаблӣ, аксарияти тағйироти фаровонии сафедаҳо дар натиҷаи танзими паст (62,9% миқдори умумии фаровонӣ дар маҷмӯъ 220 сафеда тағйир меёбад) (Бухадду) ва дигарон, 2020), дар ҳоле ки тағйироти устуворӣ аз ҷониби ноустувории сафедаҳо бартарӣ дошт (61,9% тағироти умумии устувории гармӣ: дар маҷмӯъ 172 сафеда) (Расми 2А ва Замимаи Расми S2). Масалан, мо афзоиши барвақти фаровонии транскрипсияи мизбон ва протеинҳои марбут ба тарҷумаро мушоҳида кардем (аз ҷумла равандҳои бо вирус алоқаманд), махсусан дар як соати аввали сироят, дар ҳоле ки тағйироти гармидиҳӣ барои ин равандҳо асосан дар тӯли давраи сироят нигоҳ дошта мешуд ( Расми 2B ва Маҷмӯи маълумотҳои EV2). Протеинҳое, ки бо тарҷумаи митохондриалӣ алоқаманданд, танҳо дар давоми 2 соати аввали сироят тағйир ёфтанд ва сафедаҳои марбут ба азнавсозии ситоскелетӣ ва қабати сафедаҳо танҳо дар устувории гармӣ асосан дар марҳилаҳои охири сироят тағйир ёфтанд (Расми 2B ва Dataset EV2). Хитҳои марбут ба печонидани сафедаҳо асосан натиҷаи ноустувории гармӣ буданд ва сафедаҳои пайвастшавии ҳуҷайраҳо асосан аз ҷиҳати термикӣ устувор карда шуданд (Замимаи расмҳои S3 ва S4 ва Dataset EV2). Хулоса, мо харитаи ғанӣ ва динамикии фаровонии сафедаи мизбон ва тағирёбии устувории гармиро ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 ошкор мекунем, ки метавонад ҳадафҳои нави аз ҷиҳати терапевтӣ мувофиқро нишон диҳад.

    Тасвири 2. Фаровонии глобалии сафеда ва устувории гармӣ ҳангоми сирояти SARS-CoV-2

    1. Шумораи умумии сафедаҳои ба таври назаррас боло ё поён танзимшаванда (|з-хол | > 1.96, q-арзиш < 0,05) дар як нуқтаи вақти ҳуҷайраҳои SARS-CoV-2 сироятёфтаи Caco-2 тавре ки дар расми 1А тавсиф шудааст. Сафедаҳое, ки дар фаровонӣ (аз чап) ва устувории гармӣ (рост) ба таври назаррас тағир ёфтаанд, мувофиқи танзими поёнӣ / ноустуворӣ (сурх) ё танзими болоӣ / устуворӣ (фирӯзӣ) зергурӯҳҳо мешаванд.
    2. Раванди биологии онтология (GO) ва ғанисозии роҳҳои интихобшуда. Барои истилоҳи мукаммали раванди биологӣ ва ғанисозии роҳҳо ба Dataset EV2 нигаред.

    Тағйироти устувории гармидиҳандаи SARS-CoV-2 ба PPI-ҳои вирусӣ ва танзими фосфозит муттаҳид мешаванд

    Баъдан, мо пурсидем, ки оё сафедаҳое, ки ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 миқдори фаровонӣ ё устувории гармиро тағйир медиҳанд, инчунин дар PPI-ҳои вирусӣ иштирок мекунанд ва/ё фосфозитҳое доранд, ки бо сирояти SARS-CoV-2 ба таври дифференсиалӣ танзим карда мешаванд (Бухадду) ва дигарон, 2020 пеш аз чоп: Самаварчӣ-Теҳронӣ ва дигарон, 2020 Гордон ва дигарон, 2020б). Барои ин, мо ин рӯйхати сафедаҳоро бо маҷмӯаҳои пештараи протеомӣ муқоиса кардем, ки PPI-ҳои SARS-CoV-2 ва танзими фосфозитро ҳангоми сироят тавсиф мекунанд (Бухадду) ва дигарон, 2020 Гордон ва дигарон, 2020б). Мо такрори 30 сафеда ёфтем, ки фаровонӣ ё устувории гармиро тағир дода буданд ва қаблан нишон дода шуда буданд, ки бо домҳои вирусӣ дар таҷрибаҳои наздикии массаи спектрометрии тозакунии масса (AP-MS) мутақобила мекунанд (Гордон). ва дигарон, 2020b Замимаи Расми S5A) ва 204 сафеда дар таҷрибаҳои BioID (пеш аз чоп: Самаварчи-Теҳронӣ ва дигарон, 2020) (Замимаи расми S5B). Илова бар ин, 107 сафеда бо миқдори тағйирёфта ё устувории гармӣ инчунин ҳолати тағирёфтаи фосфоризатсияро ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 нишон доданд (Замимаи расми S5C Бухадду) ва дигарон, 2020). Ҳамин тариқ, сафедаҳое, ки дар фаровонӣ, устувории гармӣ ва/ё таъсири мутақобила ё ҳолати фосфоризатсияи онҳо тағироти сершумор нишон медиҳанд, барои нақши функсионалии онҳо ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 дастгирии минбаъдаи молекулавӣ мерасонанд. Муҳим он аст, ки аксарияти сафедаҳое, ки дар устувории гармӣ иваз мешаванд, барои таҷрибаи TPP беназир буданд. Тавре ки дар зер баррасӣ шуд, баъзе аз ин хитҳо ҳадафҳои мустақими доруҳои монеъкунандаи SARS-CoV-2 мебошанд ва аз он шаҳодат медиҳанд, ки TPP маълумоти ортогоналӣ дар бораи биологияи сирояти SARS-CoV-2 медиҳад.

    Барои фаҳмидани он ки чӣ гуна тағироти устувории гармӣ бо тағирот дар равандҳои ҳуҷайравии мизбон алоқаманд аст, мо сафедаҳои дорои устувории гармии тағйирёфтаро барои тухми шабака истифода кардем, ки баъдан бо истифода аз протеинҳои мизбон, ки қаблан бо сафедаҳои SARS-CoV-2 мутақобила карда шуда буданд ё вайрон кардани танзими фосфозитро дар давоми он нишон дода буданд, паҳн карда шуд. Сирояти SARS-CoV-2 (Бухадду ва дигарон, 2020 Гордон ва дигарон, 2020б Расми 3А). Пас аз паҳнкунии шабака, кластерсозӣ барои тақсим кардани шабака ба модулҳои дорои сафедаҳо бо функсияҳои биологии алоқаманд анҷом дода шуд. Таҳлили роҳи биологӣ конвергенсияи намоёни танзими протеомии мизбон (устувории гармӣ ё фосфозит) ва мутақобилаи физикӣ (PPI-и вирусӣ-мизбон) дар дохили равандҳои асосии ҳуҷайра, аз ҷумла сафедаҳое, ки дар танзими сикли ҳуҷайраҳо, ташкили микротубулҳо ва танзими пайвасткунии mRNA иштирок мекунанд (расми 3A ва B). Қобили зикр аст, ки сафедаҳое, ки дар пайванди РНК иштирок мекунанд (Модули M-3) (масалан, SNRNP70, SNRPGP15, SRSF10, SNRPG, SRSF1, SRSF7, SRRM1 ва LUC7L3) дар давоми 2 соат пас аз сироят пайваста аз ҷиҳати гармӣ ноустувор карда шуданд (Расми 33). Ихтилоли мошини пайвасткунии РНК бо гузоришҳои охирин, ки тағиротро дар фаровонӣ нишон медиҳанд, мувофиқат мекунад (Бойкова ва дигарон, 2020) ва ҳолати фосфоризатсия (Bouhaddou ва дигарон, 2020 ) сафедаҳои марбут ба пайванди РНК ҳангоми сирояти SARS-CoV-2. Муҳим он аст, ки талаботи функсионалии функсияи спликосома дар сирояти SARS-CoV-2 қаблан бо истифода аз ингибитори спликосома, пладиенолиди В, ки репликатсияи SARS-CoV-2-ро пахш кардааст (Бойкова) нишон дода шуда буд. ва дигарон, 2020). Ҷолиб он аст, ки протеини SARS-CoV-2 nsp16 ҳодисаҳои пайванди mRNA-ро тавассути пайвастани доменҳои шинохти mRNA U1/U2 snRNAs халалдор мекунад ва ҳамин тавр тарҷумаи маҳсулоти генҳои антивирусиро пешгирӣ мекунад (Boudreault) ва дигарон, 2019 Маранон ва дигарон, 2020 Банерҷи ва дигарон, 2020 ).

    Тасвири 3. Таҳлили шабакавии маҷмӯи додаҳои SARS-CoV-2

    1. Шабакаи сафедаҳое, ки ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 одатан тағир меёбанд ё ҳадаф қарор мегиранд. Сафедаҳое, ки тағироти назарраси устувории гармиро нишон медиҳанд, ҳамчун тухмҳо барои сохтани шабака истифода шуданд. Инфексияи SARS-CoV-2 фосфозитҳои танзимшаванда ва киназаҳои пешгӯии болообии онҳо, инчунин таъсири мутақобилаи сафеда-протеин байни домҳои вирусӣ ва сафедаҳои сайди мизбон барои паҳн кардани шабака истифода шуданд. Пас аз паҳнкунии шабака, кластерсозӣ барои тақсим кардани шабака ба модулҳо анҷом дода шуд (ниг. Маводҳо ва усулҳо). ғанисозии истилоҳи GO барои ҳар як модул дар поёни рост нишон дода шудааст. Маълумот дар бораи устувории гармии сафедаҳо аз ин тадқиқот гирифта шудааст, дар ҳоле ки танзими фосфоризатсия / киназа (Бухадду) ва дигарон, 2020) ва таъсири мутақобилаи вирусӣ-протеин-протеин (Гордон ва дигарон, 2020b ) маълумот аз кори қаблӣ гирифта шуда, барои таблиғи хитҳои ТЭЦ, ки ин шабакаро тавлид мекунанд, истифода мешуданд. Ҳама нишондиҳандаҳои устувории гармии TPP дар як модул нишон дода мешаванд.
    2. Пас аз он ду санҷиши оморӣ дар шабакаи тавлидшуда аз (A) гузаронида шуд. Аввалан, барои арзёбии он, ки оё модулҳо дар хитҳои TPP ғанӣ шудаанд (санҷиши Фишер) ва дуюм, муайян кардани он, ки оё онҳо миқдори зиёди сигнали оғозёбиро гирифтанд (санҷиши KS). Хатти сурхи рахна остонаи аҳамиятро ифода мекунад (П-adj < 0,05).
    3. Харитаи гармӣ, ки нуқтаи вақтро нишон медиҳад, ки дар он зарбаҳои ТЭЦ дар дохили ҳар як модули дар (A) муайяншуда пайдо мешаванд. Плиткаи сабз тағироти назаррасро дар устувории гармӣ нишон медиҳад.

    Ғайр аз он, мо тағироти возеҳро дар устувории гармии ҷузъҳои сохтории десмосомаҳо мушоҳида кардем, ки дар пайвастшавии ҳуҷайра бо ҳуҷайраҳо иштирок мекунанд десмоплакин (DSP) дар байни 7 ва 24 соати сироят дар ҳоле ки десмоглейн-2 (DSG2) ва плакофилин-2 (PKP2) гармӣ ноустувор карда шуд. ) мӯътадилшавии гармиро ба нуқтаи дертари вақт нишон дод (расми 3A ва Dataset EV1). Ин метавонад ба паҳншавии SARS-CoV-2 таъсир расонад, зеро дигар вирусҳо нишон дода шудаанд, ки сафедаҳои пайванди ҳуҷайра ва ҳуҷайраҳоро барои осон кардани паҳншавии онҳо ба ҳуҷайраҳои ҳамсоя ҳадаф қарор медиҳанд (Матео ва дигарон, 2015 ).

    Мо ноустувории қавии инозин-5'-монофосфат дегидрогеназа 2 (IMPDH2) -ро аз 4 соат пас аз сироят муайян кардем (расми 4А). IMPDH2 табдили инозин 5'-фосфат (IMP) ба ксантозин 5'-фосфат (XMP) -ро катализ мекунад, ки қадами маҳдудкунандаи суръат мебошад. де нав биосинтези гуанин. Пешгирии IMPDH2 бо рибавирини антивирусӣ қаблан нишон дода шуда буд, ки репликатсияи SARS-CoV-2-ро бозмедорад (Бойкова) ва дигарон, 2020), ҳамчун аблсияи генетикии он (Гордон ва дигарон, 2020а). Ин натиҷаҳо далелҳои иловагӣ медиҳанд, ки IMPDH2 ҳангоми сироят, эҳтимолан тавассути ҳамкории мустақим бо nsp14 функсионалӣ тағир дода мешавад ва фаҳмиши иловагии молекулавӣ дар бораи он, ки чаро ҷилавгирӣ аз фармакологии IMPDH2 такрори SARS-CoV-2-ро самаранок пахш мекунад.

    Тасвири 4. Тағйирёбии устувории гармӣ дар сафедаҳои мизбони ҳадафноки SARS-CoV-2

    1. IMPDH2 аз 4 соат пас аз сирояти SARS-CoV-2 пайваста ноустувор шуд. IMPDH2 қаблан нишон дода шуда буд, ки таъсири мутақобилаи сафеда-протеинро бо nsp14 (хати сабз) ташкил медиҳад (Гордон ва дигарон, 2020b) ва омили муҳим дар дастгирии такрори SARS-CoV-2 (Гордон) ва дигарон, 2020а). SARS-CoV-1 nsp14 дар таъмири номувофиқатии ҷуфти асосӣ ва синтези сарпӯши 5'-и гуанин бойи РНК вирусӣ (Чен) нақши дугона дорад. ва дигарон, 2009 Смит & Денисон, 2013 Смит ва дигарон, 2015). Устувории гармии даврашакл ва қитъаҳои фаровон аз ҳуҷайраҳои Caco-2, ки бо SARS-CoV-2 сироят шудаанд, тавре ки дар расми 1А тасвир шудааст (инчунин ба расми 1А нигаред. Ситорача танзими муҳимро ифода мекунад (ниг. Маводҳо ва усулҳо).
    2. Ноустувории гармии UGDH ва PAAF1 ба таври муваққатӣ мувофиқат мекунанд ва ҳарду қаблан нишон дода шуда буданд, ки бо сафедаҳои SARS-CoV-2 nsp6 (UGDH) ва M (UGDH ва PAAF1) ҳамкорӣ мекунанд (пеш аз чоп: Самаварчи-Теҳронӣ ва дигарон, 2020). PAAF1 протеазомаро бо роҳи назорат кардани васлкунӣ / демонтажи он ба таври манфӣ танзим мекунад (Парк ва дигарон, 2005) ва қаблан бо транскрипсияи ВИЧ-1 (Лассот) алоқаманд буд ва дигарон, 2007 Накамура ва дигарон, 2012). Тағйироти назарраси сафеда (фаровонӣ ва устувории гармӣ) ҳамчун қитъаҳои доира барои сафедаҳои инфиродӣ, тавре ки қаблан тавсиф шудааст (Бечер) ва дигарон, 2018). Доираҳои дарунӣ ба фаровонии сафедаҳо ва доираҳои берунӣ ба тағирёбии устувории гармӣ мувофиқат мекунанд (Н. = 3). Ситорача танзими муҳимро ифода мекунад (ниг. Маводҳо ва усулҳо).
    3. Фаровонии фосфопептидҳои SAFB ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 тағир меёбад. Маълумот дар бораи фосфопептидҳои ҳуҷайра аз (Bouhaddou ва дигарон, 2020). Маълумоте, ки қаблан аз ҳуҷайраҳои Верои мубталои SARS-CoV-2 гирифта шуда буд (Бухадду) ва дигарон, 2020). Фосфосити S604, ки муваққатан бо ноустувории гармии SAFB мувофиқат мекунад (пеш аз чоп: Потел ва дигарон, 2020). Дар боло тарҳи хаттӣ профилҳои термоспазирӣ ва фаровонии SAFB дар ҳуҷайраҳои сироятшудаи SARS-CoV-2, тавре ки дар расми 1А тасвир шудааст (Н. = 3). Ситорача танзими муҳимро ифода мекунад (ниг. Маводҳо ва усулҳо).
    4. Профили устувории гармӣ барои ҳама пептидҳои тағирнаёфтаи SAFB (сабз) ва фосфоризатсияшудаи S604 (pS604) (арғувон) дар ҳуҷайраҳои HeLa. Маълумот аз Потел ва дигарон (пеш аз чоп: Потел ва дигарон, 2020 ).

    Мо дарёфтем, ки протеини биосинтези гликозаминогликании UDP-глюкоза 6-дегидрогеназа, UGDH ва ингибитори протеазомалии 26S, PAAF1 ҳарду ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 ноустувор карда шуданд (расми 4B). Муҳим он аст, ки ҳам UGDH ва ҳам PAAF1 барои сирояти SARS-CoV-2 талаб карда мешаванд (пеш аз чоп: Ванг ва дигарон, 2020) ва nsp6 қаблан дар таҷрибаҳои BioID бо UGDH ва гликопротеини вирусии мембранаи M бо UGDH ва PAAF1 мутақобилаи ҷисмонӣ пайдо карда шуда буд (пеш аз чоп: Самаварчи-Теҳронӣ ва дигарон, 2020) (расми 4B). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки ноустувории гармии UGDH ва PAAF1 ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 тағироти функсионалии мувофиқро дар ҳолати биофизикии онҳо, ки ба паҳншавии SARS-CoV-2 таъсир мерасонанд, ба вуҷуд меорад.

    Мо қаблан хабар дода будем, ки фосфоризатсияи сафеда дар баъзе ҳолатҳо ба тағирёбии устувории гармии сафеда мувофиқат мекунад (пеш аз чоп: Потел ва дигарон, 2020). Мо пай бурдем, ки баъзе ҳодисаҳои фосфоризатсияро мо қаблан мушоҳида карда будем (Бухадду ва дигарон, 2020) ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 муваққатан бо тағирёбии устувории гармии сафеда мувофиқат кард, алахусус дар лаҳзаҳои қаблӣ. Масалан, фосфоризатсияи S604 дар фактори транскрипсияи скафлоди B1 (SAFB) ба таври муваққатӣ бо ноустувории он, ки дар 1 hpi оғоз ёфта, дар 2 hpi аҳамият дошт (Бухадду) мувофиқат кард. ва дигарон, 2020 Расми 4C). Мо қаблан нишон дода будем, ки фосфоризатсияи S604 бо ноустувории гармии SAFB алоқаманд аст (пеш аз чоп: Потел ва дигарон, 2020 Расми 4D), аз он шаҳодат медиҳад, ки сирояти SARS-CoV-2 ба ноустувории гармии SAFB тавассути фосфоризатсия дар S604 мусоидат мекунад. Бо нақши S604 дар танзими функсияи SAFB, фаровонии сафедаи генҳои ҳадафи SAFB FBL, RPS15 ва TAF15 ҳамзамон бо сатҳҳои S604 зиёд шуд (Замимаи расми S6A). Қобили зикр аст, ки маҳсулоти генофонди SAFB LARP1 қаблан бо протеини SARS-CoV-2 N ва гени мақсаднок нейрогуидин (NGDN) бо протеини SARS-CoV-1 nsp9 (Гордон) муошират карда буд. ва дигарон, 2020а, 2020б). Бо тасдиқи аҳамияти функсионалии SARS-CoV-2, NGDN ба наздикӣ нишон дода шуд, ки барои паҳншавии SARS-CoV-2 лозим аст (пеш аз чоп: Ванг ва дигарон, 2020). Ин бозёфтҳо ба мутақобилаи эҳтимолии муваққатии байни SARS-CoV-2 ва SAFB ишора мекунанд, ки тавассути он фосфоризатсияи S604 дар SAFB, ки экспрессияи сафедаҳои мустақими SARS-CoV-2 ҳангоми сироятро ба вуҷуд меорад.

    Якчанд шеперони мизбон ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 дар устувории гармӣ тағироти амиқ доштанд.Масалан, ҷузъҳои асосии комплекси шаперони инсон (TRiC/CCT) дар ибтидои сироят ба таври нарм гармӣ мӯътадил карда шуданд, дар ҳоле ки онҳо дар марҳилаҳои минбаъдаи сироят сахт ноустувор карда шуданд (Замимаи расми S6B). Ин комплекс барои репликатсияи вируси зуком лозим аст, ки дар он нишон дода шудааст, ки комплекси сафеда бо зербахши вирусии РНК полимераза PB2 (Фислова) ташкил медиҳад. ва дигарон, 2010). Илова бар ин, якчанд каперонҳои зарбаи гармии мизбон аз ҷиҳати гармӣ ноустувор карда шуданд (масалан, HSP90AB1, HSP90AA1, HSPB1, HSPA8), ки баъзеи онҳо инчунин фосфозитҳои ба таври дифференсиалӣ танзимшавандаро ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 (Бухадду) дар бар мегиранд. ва дигарон, 2020). Масалан, ноустувории гармии HSPB1 бо зиёд шудани фосфоризатсияи S15, S78 ва/ё S82 алоқаманд буд (Замимаи расми S6C). Махсусан, S78 ва/ё S82 ҳамчун гузариши конформатсионӣ амал мекунанд, ки дар танзими ташаккули димери HSPB1 нақши муҳим мебозанд ва ба фаъолияти шаперон мусоидат мекунанд (Чой ва дигарон, 2019). Дар якҷоягӣ, ин бозёфтҳо нишон медиҳанд, ки TPP фаҳмиши минбаъдаи молекулавӣ дар бораи роҳҳое, ки қаблан дар сирояти SARS-CoV-2 алоқаманд буданд ва инчунин роҳҳои навро дар сирояти SARS-CoV-2 таъмин мекунад.

    Таъсири зиддивирусии шаперони зарбаи гармӣ ва ингибиторҳои ситохромии P450

    Мо таҳқиқ кардем, ки оё устувории гармӣ ё тағироти фаровон метавонад сафедаҳои аз ҷиҳати функсионалӣ мувофиқро ошкор кунад, ки онҳоро ҳамчун ҳадафҳои эҳтимолии дору барои бастани такрори SARS-CoV-2 истифода бурдан мумкин аст. Танҳо дар асоси қобилияти мо барои дарёфти пайвастагиҳое, ки фаъолияти сафедаҳои мизбонро, ки дар маълумоти мо ба таври назаррас тағир дода шудаанд, ба таври интихобӣ тағир медиҳанд, мо ба таври дастӣ ҳафт протеини ҳадафи дорувории мизбонро кӯтоҳ кардем, ки онҳо миқдори зиёди тағирёфтаро (CYP1A1: бо рафонтигенин монеъ мешавад) ё гармии устувор (CAPN1) нишон медиҳанд. : PD-150606, IMPDH1/2: рибавирин ва кислотаи микофенолӣ, HSP90: танеспимицин, PTRG1: кислотаи ацетилсалицил ва диклофенак, CTSV: E64d ва CA-074-Me) ҳангоми сирояти SARS-CoV-2. Барои ҳисоб кардани таъсири пайвастагиҳо ба ҳам воридшавии вирус ва ҳам репликатсия, ҳуҷайраҳо бо пайвастагиҳо пешакӣ коркард карда шуданд ва онҳо дар давоми таҷриба мавҷуд буданд. Қобилияти пайвастагиҳои санҷидашуда барои ҷилавгирӣ аз паҳншавии SARS-CoV-2 тавассути муайян кардани миқдори РНК-и вирусии дуқабата пас аз 20-24 соат пас аз сироят баҳо дода шуд ва таъсири онҳо ба қобилияти ҳуҷайра дар баробари ҳуҷайраҳои сироятнашуда санҷида шуд. Ду пайвастагиҳои санҷидашуда паҳншавии SARS-CoV-2-ро пахш карданд (расми 5) (дар зер муҳокима карда мешавад). Пайвастагиҳои дигар ба паҳншавии SARS-CoV-2 дар диапазони консентратсияи санҷидашуда таъсире нишон надоданд (Замимаи расми S7A–H), ин истисно намекунад, ки онҳо метавонанд дар якҷоягӣ бо дигар доруҳо ё дар системаҳои гуногуни ҳуҷайра фаъол бошанд. парвандаи рибавирин (Бойкова ва дигарон, 2020) ва ингибитори CAPN1 (Ma ва дигарон, 2020 ).

    Тасвири 5. Фаровонии 2D-TPP ва тағирёбии устуворӣ ҳадафҳои аз ҷиҳати функсионалӣ мувофиқро ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 ошкор мекунад

    1. Протеинҳои зарбаи гармӣ, HSP90AA1 ва HSP90AB1, ҳангоми сирояти SARS-CoV-2 ҳуҷайраҳои Caco-2 (қитъаҳои даврашакл, тарафи чап)Н. = 3) нигаред ба расми 1А барои ривояти қитъаи даврашакл). Тағйироти назарраси сафеда (фаровонӣ ва устувории гармӣ) ҳамчун қитъаҳои доира барои сафедаҳои инфиродӣ, тавре ки қаблан тавсиф шудааст (Бечер) ва дигарон, 2018). Доираҳои дарунӣ ба фаровонии сафедаҳо ва доираҳои берунӣ ба тағирёбии устувории гармӣ мувофиқат мекунанд (Н. = 3). Ситорача танзими муҳимро ифода мекунад (ниг. Маводҳо ва усулҳо).
    2. Ингибитори мувофиқи HSP90, Танеспимицин паҳншавии SARS-CoV-2-ро ба таври муассир пахш кард (Н. = 2). Ҳуҷайраҳои Calu-3 бо пайвастагӣ пешакӣ инкубатсия карда шуданд, пас аз он илова кардани SARS-CoV-2 ва коинкубатсияи минбаъда дар ҳузури пайвастагӣ барои 20-24 соат. Сарбории вирусӣ дар баробари муайян кардани антитело РНК-и дуқабата (норанҷӣ) муайян карда шуд. Заҳролудшавии пайвастагиҳо дар ҳуҷайраҳои Calu-3 баҳо дода шуд (арғувон) танҳо бо пайвастагӣ барои 20-24 соат коркард карда шуд.
    3. Гидроксилазаи арилгидрокарбон (CYP1A1) дар байни 4 то 12 соат пас аз сироят зиёд шуд ва баъд аз 24 то 48 соат пас аз сироят кам шуд (хатти даврашакл, чап, (Н. = 3) нигаред ба расми 1А барои ривояти қитъаи даврашакл). Қитъаҳои даврашакл, ки дар панели А тавсиф шудаанд, нишон дода шудаанд. Ситорача танзими муҳимро ифода мекунад (ниг. Маводҳо ва усулҳо).
    4. Ингибитори CYP1A1 паҳншавии SARS-CoV-2-ро бозмедорад (Н. = 2). Каҷҳои вояи вокуниш ба тавре ки дар расми 4А тавсиф карда шудаанд, иҷро карда шуданд. Барои доруҳои иловагии санҷидашуда ба Замимаи Расми S7 нигаред. Маълумот тавре нишон дода шудааст, ки дар (B) тасвир шудааст.

    Ноустувории умумии гармии васеъ ва пайвастаи чаперонҳо, ки дар қабати сафедаҳои кушода иштирок мекунанд, тағироти глобалии ҷалби онҳо бо сафедаҳои муштарии кушодашударо пешниҳод кард (расми 2B). Ин метавонад ба афзоиши якбораи ишғоли чаперон бо миқдори зиёди субстратҳои сафедаи вирусии кушодашуда вобаста бошад, ки метавонад ба тағирёбии муайяншавандаи устувории гармии чаперон табдил ёбад. Мо мувофиқати функсионалии ноустувории гармии HSP90AA1 ва HSP90AB1 (расми 5А) бо истифода аз ингибитори интихобкунандаи танеспимицин, ки репликатсияи вирусро дар консентратсияи пасти микромолярӣ (EIC) самаранок пахш мекард, тафтиш кардем.50

    2 μM), ки барои ҳуҷайраҳои инсон заҳролуд набуданд (расми 5B). Илова бар ин, мо афзоиши назарраси фаровонии CYP1A1-ро дар байни 4 ва 12 соат пас аз сироят муайян кардем, ки пас аз он дар байни 24 ва 48 соат пас аз сироят коҳиши шадид ба амал омад (расми 5C). Ҷолиб он аст, ки табобат бо ингибитори интихобии CYP1A1, рапонтигенин, паҳншавии SARS-CoV-2-ро дар доираи микромолярӣ (EIC) пахш кард.50

    Якҷоя гирифта, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки тағирот дар фаровонии сафедаҳо ё устувории гармӣ метавонад ҳадафҳои молекулавӣ барои ҷилавгирӣ аз репликатсияи вирусҳоро пешниҳод кунад. Ин фоиданокии TPP-ро барои ошкор кардани роҳҳои мизбони марбут ба сироят нишон медиҳад, ки метавонад муайян кардани табобати эҳтимолии зиддивирусиро суръат бахшад.


    Иқтибосҳо

    Корнелия С. Бергман, ва дигарон. (2006) Сирояти коронавируси системаи марказии асаб: бархӯрди мизбон-вирус. Баррасиҳои табиат Микробиология. 4, 121-132.
    Пол С. Мастерс. (2006) Биологияи молекулавии коронавирусҳо. Таҳқиқоти вирусӣ. 66, 193–292.
    Stanley G. Sawicki, (2007) Назари муосири транскрипсияи коронавирус. Ҷ Вирол. 81(1): 20–29.
    Изабел Сола, ва дигарон. (2011) Таъсири мутақобилаи RNA-RNA ва RNA-protein дар репликатсия ва транскрипсияи коронавирус. РНК Биол. 8(2): 237–248.