Маълумот

Ҳисоб кардани андозаи ниҳоӣ ҳангоми истифодаи камераи CCD


Ман кӯшиш мекунам, ки тақрибан тахминан таҷрибавӣ ҳисоб кунам ниҳоӣ калоншавии (маг) тасвирҳои рақамӣ, ки тавассути микроскопи конфокалии мо дода мешаванд. Бо истифода аз микрометр ва таҷҳизоти микроскопӣ, ки ман дорам, инҳо маълуманд:

Маҷмӯи объективӣ = 63x

Магни чашм = 10х

Диаметри майдони назар ҳангоми дидани намуна чашмгир = 320мм

Диаметри майдони назар ҳангоми тамошои мустақими намуна дар экран = 100мм

Магни ниҳоии тасвири додашуда дар кадом аст экран?

Ин саволи вазифаи хонагӣ нест. Мушаххасоти истеҳсолкунандагон дар бораи дараҷаи калонкунӣ, ки камера ва конфокалӣ (ва бешубҳа вуҷуд дорад) таъмин мекунанд, маълум нест.


Фарз мекунем, ки FOV, ки аз ҷониби CCD дар экран гирифта мешавад, 100 микрометр васеъ аст ва шумо тасвири васеъи 920 пикселро дар монитори стандартии 96 ppi тамошо мекунед, масштаб тақрибан 2434 маротиба хоҳад буд.

$$frac{920p}{96p/in}/100µm тақрибан 2434$$

Илова бар ин, шумо бояд боварӣ ҳосил кунед, ки ҳалли ҳадди ақали микрометр аз ҳар як пиксел дар микроскопи CCD-и шумо на камтар аз ду маротиба калонтар аст.

Сабаби он, ки андозаи пиксел бояд на камтар аз 2 маротиба камтар аз ҳалли ҳадди ақали тасвир мавҷуд бошад, ба теоремаи интихобкунии Nyquist-Shannon вобаста аст.

Ин гуфта мешавад, ки ҳама микроскопҳо (ва эҳтимолан ҳама дастгоҳҳои андозагирӣ) бояд мувофиқи стандарт калибр карда шаванд. Ин мақола истифодаи стандартро барои калибровкаи микроскопҳои конфокалӣ шарҳ медиҳад.

Усули шабеҳе, ки барои калибр кардани микроскопҳои муқаррарии оптикӣ бо истифода аз стандарти микрометри марҳила истифода мешавад, метавонад истифода шавад, агар шумо чунин стандарт надошта бошед. Аввал микроскопи муқаррариро калибр кунед, сипас бо истифода аз ҳарду микроскоп намунаи якхеларо тасвир кунед, то андозаи майдони назарро ба даст оред.


Чӣ тавр ҳисоб кардани васеъкунии умумӣ.

Бузургкунӣ ин раванди васеъ кардани андозаи зоҳирии чизест, на андозаи ҷисмонӣ.

Вақте ки калонкунӣ аз як камтар аст, он ба коҳиши андоза ишора мекунад, ки баъзан онро минификатсия меноманд.

Яке аз асбобҳое, ки барои калон кардан истифода мешаванд, микроскоп мебошад.

Микроскопи оддӣ як линзаи ягонаро истифода мебарад, аз ин рӯ, калонкунии микроскопи оддӣ ба ҳеҷ гуна ҳисоб ниёз надорад, зеро линзаи ягона одатан нишонгузорӣ карда мешавад.

Микроскопҳои мураккаб барои калон кардани намуна ду ё зиёда линзаҳо истифода мебаранд. Дар ин ҷо ҳисоб кардани андозаи афзоиш зарур аст.

Формула барои ҳисоб кардани афзоиш.

Линзаи объективӣ нурро аз намуна ҷамъ мекунад, ки барои тавлиди тасвири воқеие, ки дар линзаи чашм дида мешавад, равона карда шудааст.

Окуляр ё линзаи чашм, барои калон кардани ин тасвир дар наздикии нуқтаи марказии объект ҷойгир карда мешавад.

Агар калонкунии окуляри микроскоп 10х бошад ва линзаи объективии истифодашаванда 4х калон дошта бошад, калоншавии микроскопро хисоб кунед.

Аз ин рӯ, афзоиши умумӣ 40x аст.

Баландшавии умумии 40 маънои онро дорад, ки объект аз объекти воқеӣ чиҳил маротиба калонтар аст.


Чӣ тавр ҳисоб кардани афзоиш

wikiHow як "вики" аст, ки ба Википедия шабоҳат дорад ва ин маънои онро дорад, ки бисёре аз мақолаҳои мо аз ҷониби муаллифони сершумор якҷоя навишта шудаанд. Барои эҷоди ин мақола, 12 нафар, баъзеҳо беном, бо мурури замон барои таҳрир ва такмил додани он кор карданд.

Дар ин мақола 11 истинод оварда шудааст, ки онҳоро дар поёни саҳифа пайдо кардан мумкин аст.

Ин мақола 220,234 -бор хонда шуд.

Дар илми оптика, ба калон кардан объекти монанди линза таносуби баландии тасвирест, ки шумо мебинед ба баландии объекти воқеии калон карда мешавад. Масалан, линзае, ки объекти хурдро хеле калон менамояд баланд калонкунӣ, дар ҳоле ки линзае, ки объектро хурд менамояд, дорои як паст калон кардан. Баландшавии объект одатан бо муодила дода мешавад М = (чмано) = -(дмано), ки дар он M = калоншавӣ, hман = баландии тасвир, hо = баландии объект ва гман ва го = масофаи тасвир ва объект.


Муодила барои ҳисоб кардани майдони хаттии назар

Дар баробари ҳисоб кардани кунҷи назар, мо инчунин метавонем ҳамон тригонометрияро барои ҳисоб кардани майдони назар ҳамчун ченаки хатӣ истифода барем, ба шарте ки шумо масофаро то объекти худ медонед, ё агар шумо андозаи объекти худ ва дарозии фокус, ки шумо истифода мебаред, он метавонад ба шумо бигӯяд, ки то чӣ андоза аз он дур будан лозим аст, то чаҳорчӯбро пур кунед. Воҳидҳои ченак дар муодила доимӣ хоҳанд буд, бинобар ин, агар шумо метрро ҳамчун масофаи худ ба мавзӯъ истифода баред, майдони хаттии назар низ бо метр хоҳад буд.

Майдони назари хатӣ = 2 (Тан (кунҷи назар/2) X Масофа то мавзӯъ)


Ҳисоб кардани андозаи ниҳоӣ ҳангоми истифодаи камераи CCD - Биология

Мобайнҳо (Ададҳо) .00

Оё рамзи таблиғот доред? Онро ҳангоми санҷиш ворид кунед!

Замимаҳои маъмултарин барои телескопи нави шумо!

Барои пайдо кардани комил дар ин ҷо оғоз кунед
телескоп барои шумо!

НАВ: Дурбинҳои табиати DX ED

Дурбини барандаи ҷоизаи Celestron Nature DX бо илова кардани линзаҳои объективии ED такмили ҷиддӣ мегирад.

НАВ: Унсурҳои ThermoTank 3

Дар пайраҳа, дар ҷои кор, дар синфхона ё танҳо нишаста дар хона истироҳат кунед - Celestron Elements ThermoTank 3 дастони шуморо ором нигоҳ медорад.

НАВ: Унсурҳои ThermoTorch 5

Ин дастгоҳи мустаҳкам ва 3-дар-1 дорои дурахши воқеии тактикии 3-режим, гармкунаки дастӣ ва як бонки барқии сайёр барои пур кардани электроникаи шахсии шумо дар роҳ мебошад.


Ҳисоб кардани андозаи ниҳоӣ ҳангоми истифодаи камераи CCD - Биология

а Бахши микроскопияи электронӣ, шӯъбаи биологияи ҳуҷайраҳои молекулавӣ, Маркази тиббии Донишгоҳи Лейден (LUMC), PO Box 9600, 2300 RC Leiden, Нидерландия ва б Гурӯҳи тасвири миқдорӣ, шӯъбаи илм ва технологияи тасвирӣ, факултети илмҳои амалӣ, Донишгоҳи технологии Делфт, Делфт, Нидерландия
* Почтаи электронии мукотиба: [email protected]

Дастгоҳҳои бо барқ ​​пайвастшуда (CCD) имрӯзҳо одатан дар микроскопияи электронии интиқол (TEM) барои барномаҳо дар илмҳои ҳаёт истифода мешаванд. Дастрасии мустақим ба тасвирҳои рақамӣ дар истифодаи микроскопияи электронӣ инқилоберо ба вуҷуд овард, ки боиси таҳаввулот ба монанди ҷамъоварии автоматии маълумоти томографӣ, силсилаи фокусӣ, ҷуфтҳои конусии тасодуфӣ ва маҷмӯаҳои ултра бузурги як заррачаҳо гардид. Бо вуҷуди ин, барои кор бо қарори ултрабаланд аксар вақт ба лавҳаҳои аксбардорӣ афзалият дода мешавад. Дар ҳолати идеалӣ, сифати тасвири сабтшудаи намунаи биологии шишабандишуда танҳо аз рӯи омори ҳисобкунии вояи маҳдуди электроне, ки намуна пеш аз бартарӣ додани тағиротҳои барангезандаи чӯб тоб оварда метавонад, муайян карда мешавад. Мутаассифона, тасвир бо функсияи ғайримуқаррарии нуқтаи паҳншавии детектор, дар натиҷаи сцинтиллятор, ки бо нахи оптикӣ ба CCD пайваст карда шудааст ва илова кардани якчанд ҷузъҳои садои хоси садо паст мешавад. Истеҳсолкунандагони гуногуни детекторҳо ҳангоми таблиғи сифати детектори худ намудҳои гуногуни рақамҳои шоистаро пешниҳод мекунанд. Барои аксари лабораторияҳо тафтиш кардан душвор аст, ки оё ҳамаи мушаххасоти пешбинишуда мувофиқат мекунанд. Дар ин гузориш, маҷмӯи алгоритмҳо барои тавсифи детекторҳои дар меҳвари оҳиста-скании майдони калон дар асоси CCD асосёфтаи TEM пешниҳод карда шудаанд. Ин асбобҳо ба қуттии асбобҳои коркарди тасвир барои омма дастрас илова карда шудаанд MATLAB . Се камераи CCD-и дохилӣ бодиққат тавсиф карда шуданд, аз ҷумла омори пикселҳои гарм ва бад, функсияи интиқоли модуляция, омили табдил, фоидаи муассир ва самаранокии квантии детективӣ. Ин омор ба барномаҳои стратегияи ҷамъоварии маълумот кӯмак хоҳад кард ва маълумоти пешакӣ барои тасвири миқдорӣ пешниҳод мекунад. Самаранокии нисбии детекторҳои тавсифшуда муҳокима карда мешавад ва бо детекторҳои шабеҳ, ки дар соҳаи кристаллографияи рентгенӣ истифода мешаванд, муқоиса карда мешавад.

1. Муқаддима

Таҷҳизоти бо барқ ​​пайвастшуда (CCDs) тақрибан дар ҳама соҳаҳои илмии тасвири илмҳои ҳаёт истифода мешаванд, масалан барои микроскопияи интиқол ва флуоресцентӣ, спектроскопияи оптикӣ ва ултрабунафш, аксбардории рақамӣ, дифраксия ва тасвири рентгенӣ ва микроскопияи электронӣ. Системаҳои васеъ дар асоси CCD детекторҳои маъмултарин дар хатҳои нури муосири синхротронӣ мебошанд (Пончут, 2006) ва бо камераҳои пур аз газ ва массивҳои нави ҳисобкунии пикселҳои фотон пурра карда мешаванд. Дастрасии фаврии тасвир дар шакли электронӣ, ҳассосияти баланд, садои паст ва фарогирии фарогири аз субмикрометрӣ то ҳалли фазоии миллиметрӣ ва инчунин эътимоднокии баланди камераҳои CCD-и тиҷоратӣ онҳоро барои доираи васеи барномаҳо беҳтарин мегардонад. Бо вуҷуди ин, дар микроскопияи электронии интиқол (TEM) дар мутобиқшавӣ ба технологияҳои CCD таъхири назаррас ба назар мерасад.

Дар соли 1982 Робертс ва ҳамкорон дар бораи истифодаи массиви 100 × 100 унсурҳои ҳассос барои ошкор кардани электронҳои 20-100 кеВ хабар доданд (Робертс ва дигарон. , 1982). Система хатти аълои байни сигнали даромад ва баромад ва фоидаи баланди дохилиро нишон дод, аммо дар муқоиса бо филми аксбардорӣ қарори фазоӣ маҳдуд дошт ва аз осеби радиатсионӣ зарар дидааст. Онҳо пешниҳод карданд, ки тасвири электрониро ба ҳамтои фотони худ табдил диҳанд ва пас аз он аз ҷониби CCD муайян карда шаванд. Спенс ва Зуо (1988) дар бораи истифодаи чунин схемаи муайянкунии ғайримустақим гузориш доданд, ки бо ҷалби сцинтиллятори электронӣ, пайвасткунандаи оптикӣ ва сенсори 576 × 382 пиксел. Пас аз он боз бисёр системаҳои таҷрибавӣ ва тиҷоратӣ гузориш дода шуданд (ниг. ба истинодҳо дар Фан & Эллисман, 2000). Дастрасии мустақим ба додаҳои рақамӣ ба пешрафтҳо имкон дод, аз қабили автотанзими микроскоп (Криванек ва Муни, 1993), томографияи электронии автоматӣ (Костер). ва дигарон. , 1992), кристаллографияи электронии сафеда (Brink & Chiu, 1994) ва ҷамъоварии автоматии микрографии як заррачаҳои крио-электронӣ (Каррагер) ва дигарон. , 2000 ).

Сарфи назар аз бартариҳои зиёди CCDs, баъзе минтақаҳое боқӣ мондаанд, ки дар онҳо татбиқи CCD-ҳо бо хусусиятҳои муайяне маҳдуд шудаанд, ки ба детекторҳои бар CCD хос хосанд (Даунинг ва Ҳендриксон, 1999). Масалан, филми кории якзаррачаҳои баландсифат ҳоло ҳам ба таври назаррас беҳтар аст (Sander ва дигарон. , 2005) нисбат ба детекторҳои нахи оптикии бо ҳам пайвастшудаи CCD бидуни бастабандии камераи CCD ва ҳангоми васеъкунии 70 000 ×, филм аз қарори 21 Å беҳтар аст. Гуфта мешавад, ки барои чоркабата кардани камераи CCD ва дар калонкунии хеле баланд (>300 000×), филм аз қарори 7 Å бартарӣ дорад. Ин метавонад ба гузариши суст аз сабти филм ба тасвири рақамӣ дар соҳаи TEM мусоидат кунад. То ба наздикӣ, камераҳои васеътари CCD танҳо ҳамчун иловаҳои тарафи сеюм ба TEM-ҳои нав пешниҳод карда мешуданд. Суръати нисбатан сусти қабулкунӣ қисман иҷрои қаноатбахши сабтҳои филмро аз нуқтаи назари ҳал ва шумораи пикселҳо пас аз рақамисозӣ инъикос мекунад, ҳарчанд ҳарду холигоҳҳо баста мешаванд. Ҳоло камераҳои рақамии тиҷорӣ мавҷуданд, ки майдони тасвир аз филми калонтар доранд (http://www.tvips.com/Prod_TF816.php). Системаҳои детекторӣ дар асоси технологияи навтаъсиси гибридии пикселии CMOS, ки дар реҷаи ҳисобкунии якфотони бесадо кор мекунанд, аллакай барои барномаҳои тасвирии рентгенӣ ва дифраксионӣ ба таври тиҷоратӣ дастрасанд (http://www.dectris.com/). Детекторҳои гибридии пикселӣ барои барномаҳои TEM таҳия карда мешаванд (McMullan ва дигарон. , 2007 Форуқӣ ва дигарон. , 2003) ва барои хусусиятҳои беҳтар дар муқоиса бо CCD-ҳои пайвастшудаи фосфор/нахи оптикӣ доираи васеъ пешкаш мекунанд (Фарукӣ ва Ҳендерсон, 2007).

Такмилдиҳии афзояндаи технологияи CCD, шумораи пикселҳо, сифати фосфорҳо/сцинтилляторҳо, пайвасти нахи оптикӣ ва электроника, инчунин технологияи нави детектори массиви пикселӣ барои корбар интихоби детектори дурустро барои озмоиш осонтар намекунад. ин манзараи гетерогенй. Дар ҳоле ки иншооти азими корбарӣ, ки хуб маблағгузорӣ мешаванд, метавонанд бо технологияҳои навтарини детекторҳо огоҳ бошанд, аксари лабораторияҳои академӣ бояд як детектори мушаххасро интихоб кунанд ва онро ҳадди аққал даҳ сол истифода баранд. Ҳатто дар байни категорияи додаи детекторҳо ба монанди камераҳои CCD, доираи васеи мушаххасоти тиҷоратӣ номувофиқ, баъзан нофаҳмо ва аксаран нопурра ба раванди интихоб халал мерасонад. Дар ин мақола, мо маҷмӯи алгоритмҳоро барои тавсифи детекторҳои CCD, ки дар татбиқ шудаанд, пешниҳод мекунем DIPlib , қуттии нармафзори дастраси оммавӣ (http://www.diplib.org) барои MATLAB (The MathWorks Inc.). Ин бояд ба таъсиси детекторҳои нав мусоидат кунад ва дар таҳияи стратегияҳои беҳтари ҷамъоварии маълумот бо истифода аз детекторҳои мавҷуда кӯмак кунад. Як қатор хусусиятҳои детектор, аз қабили садои хониш, омили табдилдиҳӣ, фоидаи муассир, функсияи паҳншавии нуқта, функсияи интиқоли модуляция ва самаранокии квантии детективӣ, такрор карда мешаванд. Се детекторҳои CCD-и тасвирии 4k × 4k TEM худамон тавсиф карда шудаанд. Танҳо корбар метавонад доварӣ кунад, ки оё детектор ба ниёзҳои таҷриба мувофиқат мекунад ва натиҷа аз бисёр унсурҳои дигар, аз ҷумла манбаи электронӣ, оптика ва пеш аз ҳама, намуна вобаста аст. Аз ин рӯ, фарқиятҳои барои се детектор пайдошуда баҳо дода намешаванд ва ба истеҳсолкунандагони онҳо истинод дода намешавад.

2. Тавсифи детектор

Барои тавсифи детектори CCD ва баъдан муайян ва ислоҳ кардани артефактҳо бояд саҳми ҳамаи ҷузъҳои садо, фоидаи муассир, омили табдилдиҳӣ, хаттии посух, функсияи интиқоли модуляция (MTF) ва самаранокии квантии детективӣ (DQE) муайян карда шавад. Садои муваққатӣ ба таври тасодуфӣ аз чаҳорчӯба ба чаҳорчӯба тағйир меёбад. Он саҳмҳои стохастикӣ, аз қабили садои ҷараёни торик, садои хониш, садои фотон, милтиқи чӯб, садои таркиш ва садои пардаро дар бар мегирад. Инчунин манбаи садои собит вуҷуд дорад, махсусан дар камераҳои рақамии пайвастшудаи нахи оптикӣ. Ин садои фазоӣ аз чаҳорчӯба ба чаҳорчӯба фарқ намекунад ва аз тағирёбии фазоӣ дар ғафсии сцинтиллятор, пайвасти нахи оптикӣ ("сими мурғ" ё нахҳои шикаста), хок, намунаи ғарази CCD (махсусан, агар портҳои хондани сершумор ё CCD-ҳои таркибӣ истифода мешаванд) ва дигар артефактҳое, ки тағирот дар ҳассосияти пиксел ба пиксел ва/ё таҳрифро дар роҳи оптикӣ ба CCD ё худи чипи CCD ба вуҷуд меоранд. Ислоҳи майдони ҳамвор барои пахш кардани садои собит истифода мешавад.

Тасвири ислоҳшуда Ман корр ( х , y ) ба даст овардан мумкин аст тавассути (Айкенс ва дигарон. , 1989 )

дар куҷо Ман хом ( х , y ) тасвири аслии ислоҳнашуда аст, тасвири миёнаи замина аст (ба поён нигаред) ва Ман фоида ( х , y ) тасвири дорои арзишҳои фоидаи муқарраршуда барои ҳар як пиксел мебошад. Дар кристаллографияи рентгенӣ, системаи конус ё линзаи нахи оптикӣ табдилро аз тасвирҳои хом ба тасвирҳои ислоҳшуда душвортар мекунад, зеро таҳрифи системаи демагнификация бояд ба ҳисоб гирифта шавад. Ғайр аз он, ба даст овардани нури устувори якхелаи рентгенӣ, ки барои ҷамъоварии маълумот лозим аст, ғайриимкон аст. Ман фоида ( х , y ) ба даст оварда мешавад. Аз ин рӯ, аксари истеҳсолкунандагони детекторҳои рентгенӣ камераи худро бо ҷадвалҳо барои таҳриф ва ислоҳи майдони ҳамвор таъмин мекунанд ва корбар танҳо бояд тасвирҳои заминаро барои вақти дилхоҳи экспозиция ҷамъоварӣ кунад. Калибровкаи фоида ва таҳрифи истеҳсолкунандагон одатан барои чанд сол мувофиқ боқӣ мемонад. Ин инчунин ба детекторҳои рентгенӣ дахл дорад, ки дар онҳо на конусҳо, балки плитаҳои нахи оптикӣ (1:1 калонкунӣ) истифода мешаванд.

Детекторҳои электронии микроскопӣ одатан плитаҳои нахи оптикиро дар якҷоягӣ бо микросхемаҳои калони сенсор истифода мебаранд. Ду сенсорҳои маъмули CCD-и майдони васеъ инҳоянд Fairchild CCD 485 ва 486 (Eagle 4k, Gatan 4k, Tvips 4k). Ин сенсорҳо инчунин барои як қатор детекторҳои рентгенӣ истифода мешаванд (Bruker APEXI ва II, platinum 135/200/200C, Rayonix 135 ва 165). Ҳангоми пайваст кардани ин сенсорҳо ба пластинкаи нахи оптикӣ ислоҳи таҳриф талаб карда намешавад. Микроскописти электронӣ метавонад заминаро иҷро кунад ва калибровкаро ба таври оддӣ ба даст орад, зеро бо микроскопҳои электронии муосир шароити равшании якхелаи электронии якхелаи электронӣ ба осонӣ ба даст оварда мешавад. Бастаҳои ҷамъоварии маълумотҳои академӣ ва тиҷоратии электронии микроскопӣ, аз қабили Тиа (http://www.fei.com/products/types/fei-software.aspx), SerialEM (Мастронарде, 2005), UCSF нармафзор (Zheng ва дигарон. , 2007 ), Легинон (Суловай ва дигарон. , 2005) ва Микрографи рақамӣ (http://www.gatan.com/products/software/), барои ин қадами калибрченкунии камера функсияро таъмин кунед. Суръати такрорӣ, ки дар он замина ва калибрченкунӣ талаб карда мешавад, дар муқоиса бо детекторҳои рентгенӣ хеле баландтар аст ва вобаста ба истеҳсолкунандаи камера метавонад аз як маротиба дар як моҳ то чанд маротиба дар як рӯз фарқ кунад.

Ислоҳи тасвирҳои хом ҳангоми ба даст овардани тасвирҳои хом ва тасвирҳои истинодкунандаи сафед шароити якхелаи равшаниро талаб намекунад. Зичии оптикии намунаи TEM-и нимтунуки пароканда-контрастро метавон модел кард тавассути қонуни Ламберт-Беэр,

дар куҷо Ман 0 шиддати даромад аст, Ман намуна шиддатнокии баромад, α коэффисиенти азхудкунӣ ва л дарозии роҳ аст. Дар ин муодила, Ман 0 набояд чӯби якхела бошад. Нури наздики якхеларо метавон майдони обхезӣ номид (Мой ва дигарон. , 1996). Андозаи возеҳ Ман намуна ва Ман 0 дар микроскопияи электронй, масалан, дар Легинон баста барои тавсифи автоматии ғафсии намунаҳои яхҳои шишагин (Каррагер ва дигарон. , 2000). Асосан, ченакҳои алоҳидаи тасвири фоида-нормативӣ Ман фоида дар (1) ва тасвири саҳроии обхезӣ Ман 0 дар (2) метавон ба як андоза муттаҳид кард. Аммо, чунин тавсиф танҳо то он даме, ки эътибор дорад Ман 0 тагьир намеёбад. Тасвири сахрои обхезй Ман 0 барои танзимоти гуногуни электронии шуоъ тағир меёбад, дар ҳоле ки тасвири ба эътидол овардашуда Ман фоида аз оптикаи электронї новобаста аст ва танњо бо омилњо ба монанди њарорат таѓйир меёбад.

Барои дуруст ҳисоб кардани хосиятҳои CCD-и бо нах пайвастшуда, дар тасвирҳои истинодӣ қатъ кардани нишондиҳандаҳои оморӣ (`zingers' ба номи Зингер, 1961) муҳим аст. Инҳоро тавассути чен кардани шумораи зиёди тасвирҳо дар шароити якхела муайян кардан мумкин аст. Нурҳои кайҳонӣ ва мюонҳо, махсусан, метавонанд дар сцинтиллятор таркиши фотонҳоро ба вуҷуд оранд, ки ба доғҳои сафед ё рахҳои тасвир оварда расонанд. Элементҳои радиоактивӣ (аслан торий), ки дар конусҳои нахи оптикӣ мавҷуданд, инчунин метавонанд ба зинггерҳо оварда расонанд (Буржуазӣ). ва дигарон. , 1994). Манбаъҳои дигари эҳтимолии зингерҳо рентгенҳо ва садои таркиш мебошанд ("садои попкорн"), ки охирин ба эффектҳои гуногуни электронӣ ишора мекунад, ки метавонанд ҳам қиматҳои баланд ва ҳам пасти пикселро ба даст оранд.

Тасвири миёнаи замина барои вақтҳои гуногуни ҳамгироӣ гуногун хоҳад буд. Он дорои ҷуброни мустақили вақт, ғарази миёна Ман ғаразнок ( х , y ), плюс саҳми вобаста ба вақт аз тавлиди стихиявии термотикии ҷуфтҳои сӯрохиҳои электронӣ дар дохили CCD, ки ҷараёни торик номида мешавад. Барои вақтҳои маъмулии экспозиция дар майдони равшани TEM намунаҳои биологӣ (0,1 с то чанд сония), муносибати хатӣ тахмин кардан мумкин аст,

дар куҷо ( х , y ) мавқеи пикселро нишон медиҳад, т exp вақти экспозицияи камераи CCD (ё ҳамгироӣ барои тасвирҳои торик) ва Ман DC ( х , y ) миёнаи ҷараёни тира бо ҳисоб дар як сония. Садои хониш Ман рн ( х , y ) ин буриши стандартии силсилаи зиёди тасвирҳои замина мебошад Ман бг дар вақти экспозиция дар 0 с ё наздик чен карда шудааст,

Равшании майдони ҳамвор (якхела)-и камера ба вокуниши якхелаи CCD оварда намерасонад, зеро ҳар як қадами табдилдиҳӣ аз электронҳои энергияи баланд ба электронҳои фотоиндуксионӣ, ки аз CCD хонда мешавад, тақвият ё сустшавии маҳаллиро ҷорӣ мекунад. сигнал. Сцинтиллятор дар ғафсӣ тафовут хоҳад дошт, ки баъзе қисмҳоро артефактҳо ба монанди чанг маҳкам карда метавонанд, пайвастшавии сцинтиллятор ба пластинкаи нахи оптикӣ камбудиҳо хоҳад дошт, худи плитаи нахи оптикӣ як намунаи хеле қавии нахҳои инфиродӣ ва нахро мегузорад. бастаҳо, пайвастшавии плитаи нахи оптикӣ ба CCD боиси талафи сигнали вобаста ба макон мегардад ва худи CCD аксуламали якхела дорад. Эффектҳои якҷоя тавассути майдони ҳамвор ислоҳ карда мешаванд, ки ба андозагирии тасвирҳои истинодҳои сафед (якхела равшаншуда) такя мекунанд. Ман сафед дар як ё якчанд маротиба дучоршавӣ,

ки дар он тасвири миёнаи замина, ки бо (3) ҳисоб карда шудааст ва тасвири миёнаи истинод ба сафед аст, ки ба ҳамин тарз ҳисоб карда шудааст. Нишона 〈〉 х , y барои ифодаи миёнаи фазоии тамоми тасвир истифода мешавад.

Функсияи интиқоли модуляция (MTF) ченаки интиқоли амплитудаи сигнал барои басомадҳои гуногуни фазоӣ мебошад. Он аз рӯи модули табдили Фурьеи функсияи паҳншавии нуқта (PSF) -и детектор ҳисоб карда мешавад. Ду усули маъмул барои муайян кардани таҷрибавии MTF вуҷуд доранд, ки ҳамчун усули садо ва канор номида мешаванд. Усули садо як усули стохастикӣ мебошад, ки дар он камера ба равшании якхела дучор мешавад. Сигнали воридотӣ метавонад ҳамчун садои сафед баррасӣ карда шавад, ки дар тамоми басомадҳои фазоӣ спектри доимии қудрат дорад. Тахмин дар он аст, ки ин спектри доимӣ аз ҷониби MTF камера ҳамчун ҳама гуна сигналҳои дигар суст карда мешавад. Интизор меравад, ки дар детектори PSF сцинтиляттори нахи оптикӣ бартарӣ дошта бошад ва аз ин рӯ, изотропӣ бошад. Қимати мутлақи табдили Фурьеи тасвири якхела равшаншуда, ки ба ҳисоби миёна кунҷӣ ҳисоб карда шудааст, MTF аз ҳад зиёд оптимистиро медиҳад (Фан ва Эллисман, 2000). Миёнаи кунҷии табдили Фурьеро тавассути сохтани ҳалқаҳо дар тасвир бо профили Гаусс анҷом додан мумкин аст. Г ( р , σ). Маблағи гаусси вазншудаи модули табдили Фурьеи тасвири садои сафед | Ф ( у , в )|,

пас аз муътадилшавй МТФ медихад. Усули канорӣ як усули детерминистист ва як канори корди металлии якхела равшаншударо истифода мебарад, ки электронҳои ҳодисаро аз як тараф маҳкам мекунад (Dainty & Shaw, 1974). Профили канори корд метавонад бо функсияи қадам муаррифӣ карда шавад. Тасвири дами корд бо равшании якхела гирифта мешавад ва ба ислоҳи майдони ҳамвор дучор мешавад. Шиддатнокии миёна дар паҳлӯҳои торик ва равшан ҳисоб карда мешавад ва барои ба эътидол овардани тасвир истифода мешавад. Профили миёнаи канори канори каҷ аз тасвир гирифта мешавад. Тафриқаи функсияи якченакаи канори паҳншавӣ (ESF) функсияи паҳншавии нуқта (PSF) ва пас аз табдили Фурье ва гирифтани модул, буриши якченакаи функсияи интиқоли модулятсияи дученакаи детекторро медиҳад. Фарз кардани MTF-и изотропӣ, андозагирии канор дар як самт кифоя аст.

Танҳо паст кардани MTF сифати тасвирро вайрон намекунад. Агар сигнал то басомади Nyquist интиқол дода шавад ва MTF маълум бошад, кас метавонад, дар назария, тасвирро тавассути деконволюсия барқарор кунад. Дар амал ба деконволюцио-нй садо халал мерасонад. Самаранокии квантии детективӣ (DQE) садои иловакардаи детекторро тавсиф мекунад.

DQE ҳамчун таносуби квадратии SNR байни сигнали баромад ва вуруд муайян карда мешавад

Садои раванди парокандашавии стохастикӣ ба ҳамон тарзе интиқол дода намешавад, ки сигнал (Раббонӣ) ва дигарон. , 1987). Электрон дар сцинтиллятор пароканда шуда, қад-қади траекторияаш фотонҳоро ба вуҷуд меорад. Ин фотонхо боз пароканда мешаванд. Аз ин рӯ, раванд дар сцинтиллятор маҷмӯи мураккаби парокандашавӣ ва пурқувваткунӣ мебошад: садо дар сигнали ошкоршуда (баромад) на танҳо садои сигнали вурудии аз ҷониби MTF сустшуда (Мейер) нест. ва дигарон. , 2000). Сигнал ва садо ҳамчун функсияи басомади фазоӣ ба таври гуногун интиқол дода мешаванд, аз ин рӯ DQE мегардад

ки дар он NPS ба спектри қувваи садо ишора мекунад. Барои чен кардани DQE вобастагии басомади сигнал барои тасвири сафед аз ҷониби тақрибан тахмин карда мешавад

миёнаи сигнал дар куҷост С. берун . Азбаски сигнали воридотӣ раванди Пуассон бо арзиши доимии интизорӣ дар тамоми тасвир аст, дисперсияҳои интизорӣ ва миёнаи интизории сигнал яксонанд ва аз басомад новобастаанд, яъне NPS дар ( у , в ) = С. дар ( у , в ) = . Миёнаи сигнали воридотӣ ба вояи баробар аст, = Н. . Коэффисиенти табдилдиҳӣ ҳамчун нишон дода шудааст C = . DQE акнун метавонад аз нав навишта шавад

ки дар он FT[] табдили Фурьеро ифода мекунад, σ тир ( х , y ) ин инҳирофи стандартӣ барои як пиксел аз сабаби садои Пуассон ва Ман рн садои хондан аст. Садо аз ҷараёни торик одатан аз садои хондан бартарӣ дорад ва дар ин таҳлил сарфи назар карда мешавад. Саҳми нисбии садои хондан ба NPS берун барои вояи камтар ва басомадҳои баландтар калонтар аст. (10) хамчунин ифода кардан мумкин аст

ки дар он NNPS спектри муқарраршудаи қувваи садо аст,

3. Усулҳои андозагирӣ

Се камераи дохилии мо дар меҳвари дар поён ҷойгиршуда тавсиф карда шуданд. Ин детекторҳо, ном доранд X , Я ва З , дар микроскопҳои Tecnai (Ширкати FEI, Нидерландия) насб карда шуданд, ки бо шиддати 120 кВ кор мекарданд. Ду микроскопҳо гексбориди лантанӣ доранд (LaB 6 ) нӯги ҳамчун катод ва сеюм дорои таппончаи партовҳои саҳроӣ (FEG). Ҳар яке аз се сенсорҳои CCD дорои сатҳи фаъоли 61,2 × 61,2 мм, 4096 × 4096 пиксел, баландии пиксел 15 мкм ва омили пуркунии 100% (http://www.fairchildimaging.com/). Камераҳо дар сцинтиллятори фосфор ва плитаи нахи оптикӣ, ки ба сенсори CCD пайваст карда шудаанд, фарқ мекунанд. Тасвирҳои ҷудонашуда дар 1 МГс тавассути чаҳор бандари мутолиаи параллелӣ хонда шуданд, ки бо истифода аз конвертерҳои 16 бит AD бо суръати максималӣ дар як дақиқа 7,5 тасвири ҷудонашаванда ба даст оварда мешаванд. Тасвирҳои мураббаъ бо панҷ (детектор X ва Я ) ва даҳ (детектор З ) пикселҳои истинод дар ҳар як самт ин чаҳорчӯба бояд аз тасвири ниҳоӣ хориҷ карда шавад. Ҳама камераҳо бо Peltier то ҳарорати муқарраршудаи 248 К хунук карда шуданд, то ҷараёни торикро кам кунанд. Коркарди тасвир бо истифода бурда шуд MATLAB (Математика) ва DIPimage қуттии асбобҳо (TU Delft, Нидерландия http://www.diplib.org). Бо истифода аз маълумот ҷамъ карда шуданд MATLAB скриптҳое, ки аз ҷониби ТОМ қуттии асбобҳо (Никелл ва дигарон. , 2005) ва бо истифода аз TEMScripting ActiveX сервер v.3.1.2 (Tecnai http://www.fei.com/products/types/fei-software.aspx). Ҳама функсияҳоро барои тавсифи камера дар интернет дар http://www.diplib.org/home22266 пайдо кардан мумкин аст.

3.1. Бартараф кардани бартариятҳо

Тасвирҳои истинодҳои торик бо клапанҳои сутун баста ба даст оварда шуданд, яъне нур набуд. Силсилаи ҳадди аққал даҳ тасвир дар шароити якхела (бо вақти якхела) ба даст оварда шуданд. Пикселҳое, ки тағирёбии шиддат аз инҳирофи стандартии шиддатнокии пиксел дар дохили силсила бештар аз даҳ маротиба зиёдтаранд, ҳамчун нишондиҳандаҳои берунӣ қайд карда шуданд. Баъзан, тартиби такрорӣ дар давоми як қатор даҳҳо ду нишондиҳандаи берунро муайян мекунад. Нишондиҳандаҳои берун аз тасвирҳои истинодҳои сафед ба ҳамин тариқ хориҷ карда шуданд.

3.2. Ғараз, ҷараёни торик ва садои хониш

Пас аз бартараф кардани сатҳи берунӣ, ғараз ва ҷараёни торикӣ барои ҳар як пиксел тавассути таҳлили умумии 100 тасвири истинодҳои торик, ки дар даҳ вақти гуногуни экспозиция чен карда шудаанд, муайян карда шуд. Миқдори вақти экспозиция 0,05-10 с буд. Ҷараёни торикӣ барои ҳар як пиксел аз нишебии мувофиқати хаттии камтарин мураббаъҳои тасвирҳои торик муайян карда шуд. рӯ ба рӯи хуруҷи вакт. Ҷуброни ин мувофиқат ғаразнокро дод.

Даҳ тасвири истинодҳои торик бо хурдтарин вақти экспозитсия барои ҳисоб кардани садои хониш тавассути ҳисоб кардани инҳирофи стандартӣ барои як пиксел дар дохили силсила истифода шуданд.

3.3. Андозагирии самарабахши детектор

Барои муайян кардани фоидаи самараноки ҳар як детектор ду равиши гуногун истифода шуд, ки яке аз тасвирҳои истинодҳои сафед ва дигаре дар асоси тасвирҳои градиентӣ асос ёфтааст.

Истиноди сафед ( Ман сафед ) тасвирҳо бо вақтҳои гуногун бо истифода аз равшании доимии якхелаи детектор ба даст оварда шуданд. Шуоъ васеътар аз диаметри экрани флуоресцентӣ (165 мм) паҳн карда шуд ва он каме (15 мм) аз меҳвари оптикӣ ба самтҳои тасодуфӣ байни ба даст овардани тасвирҳои пайдарпай кӯчонида шуд, то ба ҳисоби миёна ҳар гуна номуайянии эҳтимолӣ бошад. дар равшанӣ. Заминаи миёна аз ин тасвирҳо тарҳ карда шуд. Чизҳои дар боло тавсифшуда хориҷ карда шуданд. Силсилаи ҳадди аққал даҳ экспозитсияи такрорӣ барои ҳафт вақти гуногуни экспозитсия (диапазони 0,05-2,5 с) анҷом дода шуданд. Ба гайр аз гузариши шуоъ ва вакти экспозиция, хангоми ба даст овардани тамоми тасвирхо шароити равшанй доимй нигох дошта мешуд. Миёнаи фазоии шиддатнокии ҳама пикселҳо дар ҳар як квадрант барои ҳар як вақти экспозиция муайян карда шуд. Пикселҳои шиддатнокии миёна, ки аз ин медиана бештар аз 1% фарқ мекарданд, аз ҳисобҳои минбаъда хориҷ карда шуданд. Тафовути шиддатнокии пиксел дар дохили силсила барои ҳар як пиксели интихобшуда муайян карда шуд. Миёнаи тафовут 〈var( Ман )〉 х , y ва миёнаи шиддатнокӣ 〈 Манх , y аз болои пикселҳои интихобшуда дар ҳар як квадрант ҳисоб карда шуданд. Нақшаи фарқияти миёна рӯ ба рӯи шиддати миёна бо нуқтаҳое, ки ҷуфтҳоро ифода мекунанд [〈 Манх , y , 〈var( Ман )〉 х , y ] барои ҳар як вақти экспозиция. Нишебии мувофиқати хатти камтарин квадратҳои ин қитъа фоидаи самараноки камераро дод.

Фоидаи самаранок инчунин бо истифода аз тасвирҳои градиентӣ муайян карда шуд (Vliet ва дигарон. , 1998). Силсилаи камаш даҳ ченкунии такрорӣ аз чӯби хеле якхела анҷом дода шуд. Барои лаборатория 6 микроскопҳо, градиенти шиддат тавассути тасвири канори чӯби норавшан бо васеъкунии хеле баланд ба даст оварда шуд. Азбаски норавшан кардани канори чӯб барои манбаи FEG душвор аст, астигматизми линзаи конденсатор истифода шудааст. Тавре ки дар усули қаблан тавсифшуда, нишондиҳандаҳои берунӣ хориҷ карда шуданд, заминаи миёна хориҷ карда шуд ва ниқоби дар боло муайяншуда татбиқ карда шуд. Шиддати тасвирҳои градиентӣ ба 100 адад тақсим карда шуд. Тафовут ва миёнаи шиддат барои ҳар як бинӣ ҳисоб карда шуд. Фоидаи самараноки камера боз тавре ки дар боло тавсиф карда шуд, муайян карда шуд.

3.4. Ислоҳи ғараз, ба даст овардани муқаррарӣ ва вокуниши пиксел

Тасвирҳои истинодҳои сафед, ки дар боло тавсиф шудаанд, инчунин барои санҷиши хаттии посухи пиксел истифода мешуданд. Монанди ҳисобкунии (3), мувофиқати хаттии камтарин-мураббаъҳои шиддат рӯ ба рӯи вақти экспозиция барои ҳар як пиксел ҳисоб карда шуд, то тасвири миёнаи сафед = ба даст ояд Ман бг ( х , y ) + т exp Ман нишебии ( х , y ). Хатти вокуниши пиксел ҳамчун функсияи вақти экспозиция тавассути ҳисоббарорӣ тафтиш карда шуд Р 2, квадрати коэффисиенти таносуби интихоб байни арзишҳои ченшуда ва пешбинишуда. Тасвири ба даст овардани нормализатсия Ман фоида ( х , y ) бо истифода аз ва (5) ҳисоб карда шуд.

Пеш аз ислоҳи тасвири хом бо истифода аз (1), пикселҳои сарҳадӣ бояд аз таҳлил хориҷ карда шаванд. Ин сарҳад барои детекторҳо панҷ пиксел васеъ буд X ва Я ва даҳ пиксел васеъ барои детектор З .

3.5. Функсияи интиқоли модуляция (MTF)

Барои ҳисоб кардани MTF даҳ тасвири яксон равшаншудаи ислоҳшудаи майдони ҳамвор, ки бо вақти 1 сония гирифта шудаанд, истифода шуданд. тавассути усули садо. Барои пешгирӣ кардани мушкилоте, ки аз ҳисоби миёна ҳисоб кардани нуқтаи хеле ками маълумот дар басомадҳои фазоӣ ба вуҷуд меоянд, мо як инҳиробии стандартии тағирёбанда барои Гауссиан дар (6) истифода кардем, яъне σ = 2,5 дар басомадҳои паст ва σ = 0,9 дар басомадҳои баланд. Аҳамият диҳед, ки миёнаравии кунҷӣ дар домени мутақобила сурат мегирад ва σ бо шумораи бинҳо ифода мешавад. Каҷҳои инфиродии MTF барои ҳар як даҳ тасвир ҳисоб карда шуданд, ки усули ниҳоии садо MTF ба ҳисоби миёна аз онҳо буд.

Барои муайян кардани MTF ҳам қатъи нур ва ҳам диафраксияи дифраксия истифода шуданд тавассути усули канор. Истгоҳи нур мустақиман дар болои экрани флуоресцентӣ дар кунҷи каме моил нисбат ба массиви пиксел ҷойгир карда шуд (Samei ва дигарон. , 1998). Даҳ тасвири канора бо равшании якхела гирифта шуда, ба радди берунӣ ва ислоҳи майдони ҳамвор дучор шуданд. Шиддати миёна дар паҳлӯҳои равшан ва торикии истгоҳи нур ҳисоб карда шуда, барои ба эътидол овардани тасвир истифода мешуд. Профилҳои миёнаи канори канори кандашудаи чӯбдаст аз тасвир гирифта шуданд. Профилҳои канорӣ ҳашт маротиба аз ҳад зиёд интихоб карда шуданд ва мувофиқи Мулликин коркард карда шуданд ва дигарон. (1994). Ба ҳисоби миёна 128 хат дар канори канор садоро пахш кард ва функсияи якченакаи паҳншавии канор (ESF) дод. Функсияи паҳншавии нуқта (PSF)-и детектор тавассути ҳисоб кардани ҳосилаи ESF ба даст оварда шудааст. тавассути фарқияти ниҳоӣ. Owing to Poisson statistics, it proved to be necessary to reduce the noise of the bright side of the edge by setting the tails of the PSF to zero. Individual MTFs were obtained after down-sampling the PSF to the original pixel pitch and computing the magnitude of the Fourier transform. We repeated this procedure for ten images and averaged the ten MTFs to obtain a more robust estimation.

Images of the diffraction aperture were taken at low magnification of the projection lens system (1000×) and these images were normalized to yield an average value of one inside and zero outside the aperture hole. Edge profiles perpendicular to the edge were extracted, averaged and further processed as described above. The curved edge of the aperture was found using the Plus operator (Verbeek & van Vliet, 1994 ) with subpixel precision.

3.6. Conversion factor and the detective quantum efficiency

The conversion factor C was measured by relating the beam current Ман чӯб and exposure time т exp to the integrated intensity О (in ADU) in the corrected output image. The beam diameter was made to be smaller than the field of view of the camera to ensure that the detector captured all incident electrons. The incident beam current was obtained through the Tecnai TEMscripting ActiveX server interface, which reads the current from the fluorescence screen. For all microscopes, the incident beam current readings were postcalibrated using independent current measurements from a Faraday cage of a double tilt analytical holder (Gatan, Inc., model 646). A Keithley model 602 was used as a picoamperemeter. The conversion factor C in ADUs per primary electron (ADU pe −1 ) was calculated using the formula C = (1.6 × 10 −19 О / Ман чӯб т exp ), дар куҷо т exp is the exposure time of the detector.

The MTF from the edge method was used for the DQE calculation. The NNPS was based on the subtraction of two raw uniformly illuminated dark-subtracted images that were measured with the same exposure time Ман дар = ( Ман 1Ман 2 )/2 1/2 C , бо Ман 1 = Ман white1 − and Ман 2 = Ман white2 − . The dose Н. = 〈 Ман 1 + Ман 2х , y /2 C used for these images was 176, 149 and 124 primary electrons per pixel for detectors X , Я ва З , мутаносибан. A sine-shaped windowing function ( w ) was applied to this image in order to avoid edge artefacts from the implementation of the discrete Fourier transform (DFT). The square of the Fourier transform was multiplied by four to compensate for the power loss as a result of the windowing. Angular averaging of the spectrum was performed. The influence of the readout noise was represented by the term NNPS р = DFT 2 [ Ман rn ( х , y )/ C ]. The normalized noise power spectrum NNPS was obtained from (11) and (13) after dividing the contributions from the Poisson noise and readout noise by the dose Н. ,

After determining the NNPS, the DQE was computed using (12) .

4. Results

4.1. Outliers

Fig. 1 presents the number of outliers рӯ ба рӯи integration time (for the dark reference images) or exposure time (for the white reference images) for each detector. анҷир. 1 ( а ) and 1 ( в ) show a comparable increase of almost 1500 outliers in the dark reference images when increasing the integration time from milliseconds to 10 s. This increase was not observed for detector Я (Fig. 1 б ). The number of outliers in the white reference images was similar for all three detectors (Fig. 1 г ).


Расми 1
Number of outliers рӯ ба рӯи time. ( а )–( в ) show the number of outliers in the dark images and ( г ) shows those in the white reference images. Detectors X ва З show an increase in the number of outliers with integration time in the dark references. The number of outliers in the white references was comparable for the three detectors

4.2. Bias and the dark current

The bias in the images can differ for each of the four quadrants, as each readout port has its own AD converter. Fig. 2 shows a histogram of the bias for each quadrant of the three detectors. The average bias values for the four quadrants are 496, 498, 487 and 485 ADUs for detector X , 505, 504, 508 and 505 ADUs for detector Я , and 1003, 1002, 1002 and 1002 ADUs for detector З (Table 1 ).

Table 1
Characteristics of three in-house 4k TEM detectors at 120 kV

The single-chip sensors are read out from four different ports: upper left, lower left, upper right and lower right.


Расми 2
Histogram of the bias for each quadrant of the three detectors. The bin width of the histogram is 1 ADU. The average bias is 492, 506 and 1002 ADUs for detectors X , Я ва З , мутаносибан. Detector З shows the smallest spread of the bias.

Fig. 3 shows a histogram of the dark current for each of the three detectors. The average (standard deviation) of the dark current is 0.31 (0.37), 2.9 (1.14) and 0.05 (0.11) ADU pixel −1 s −1 for detectors X , Я ва З , мутаносибан. Dark-current generation is a Poisson process. Therefore, it is to be expected that pixels with a high dark current will also have a high standard deviation of the dark current.


Расми 3
Histogram of the dark current for the three detectors. The bin width of the histogram is 0.025 ADU. Detector З has the smallest spread of the dark current.

Pixels that have an excessive dark current are the so-called `hot pixels'. A complementary cumulative distribution of these is shown in Fig. 4 . The numbers of pixels with a dark current larger then 100, 50 and 30 ADU pixel −1 s −1 are 40, 144 and 675 for detector X , 19, 86 and 853 for detector Я , and 4, 9 and 21 for detector З , мутаносибан.


Расми 4
Complementary cumulative distribution function of the hot pixels, showing the number of pixels that have a dark current higher than a certain value. The number of pixels with a dark current larger then 100 ADU pixel −1 s −1 is 40, 19 and 4 for detectors X , Я ва З , мутаносибан.

4.3. Readout noise

Owing to the differences in readout circuitry, the readout noise is measured separately for each of the four quadrants of the image. The specification for the readout noise for a Fairchild CCD 486 Image Sensor is 8 ADU (12 e with 1.5 CCDe per ADU nominal gain). The mean of the readout noise is 8.5 ADU for detector X , 7.1 ADU for detector Я and 3.4 ADU for detector З (Table 1 ). The nominal gain for each detector was determined from a comparison between full well capacity and saturation intensity in the image. It was estimated to be 1.5 CCDe per ADU for detectors X ва Я and 3 CCDe per ADU for detector З .

4.4. Lookup tables

Fig. 5 ( а ) depicts the average outlier-corrected and background-corrected Ман фоида image of detector X with normalized gain values. In close-up (Fig. 5 б ), the image fibre bundles and even the individual fibres can be clearly seen. Fig. 5 ( в ) shows a close-up of Ман фоида of detector З displayed at the same magnification as in Fig. 5 ( б ).


Тасвири 5
The dark-corrected and scaled Ман фоида тасвир. ( а ) Overview for detector X , showing the difference between the four quadrants. ( б ) Detail of ( а ), showing the fibre-optic coupling and individual fibres. ( в ) Detail of Ман фоида of detector З , shown at the same magnification as in ( б ). The size of the fibre bundles is about 1.1 mm for detectors X ва Я and 450 µm for detector З .

A mask is made for those pixels for which a very low signal was observed ( Ман фоида < 0.2, масалан owing to dust or broken fibres) or where the signal was excessively large ( Ман фоида > 2, масалан owing to thicker parts of the scintillator). The low and high threshold values (0.2 and 2.0, respectively) were selected empirically. Pixels within this mask could be either replaced by a value based on the mean and variance of the closest `normal' neighbouring pixels or remain marked as `unobserved' during subsequent processing. This mask forms a lookup table together with the list of pixel defects identified during the analysis of the dark reference images.

4.5. Linearity of the response

The linearity of the response was assessed by making a linear least-squares fit to the intensity of the white reference images рӯ ба рӯи exposure time. Р 2 was calculated for every pixel. For all three detectors, the linear response was good within the range of intensity values measured: Р 2 was higher than 0.999 for almost all pixels. It proved to be unnecessary to extend the mask of bad pixels (lookup table) with pixels that had a particular low Р 2 value ( масалан < 0.9).

The average effective detector gain was calculated for each quadrant separately using both white reference and gradient images. Fig. 6 shows the effective gain for the upper right quadrant of the CCD using white reference images. Table 1 shows the effective gain in ADUs per primary electron for all quadrants. Detectors X ва З have a comparable effective gain of on average 5 ADU pe −1 . Detector Я gives more ADUs per primary electron (7.7) and its effective gain is very homogenous over each of the four quadrants. All three cameras showed excellent linearity of the variance in pixel response as a function of the pixel intensity. The method with gradient images was used for comparison and the effective gain values of the upper right quadrant were 5.6, 6.7 and 4.8 ADU pe −1 for detectors X , Я ва З , мутаносибан.


Расми 6
Effective gain measurements from white reference images of the upper right quadrant for detectors X (dashed line), Я (dotted line) and З (solid line). The values for the other quadrants are given in Table 1 .

4.6. MTF

The modulation transfer function (MTF) was calculated with the noise (Fig. 7 ) and the edge methods (Fig. 8 ). Both the beam stop (Fig. 8 а ) and the diffraction aperture (Fig. 8 б ) were used to generate an edge. The MTF at half Nyquist was similar when determined using either of the two edge methods: 0.19 for detector З and 0.12 (beam-stop measurement) or 0.13 (aperture measurement) for detectors X ва Я . The MTF reached a higher minimum at higher frequencies for the noise method compared with the edge method.


Тасвири 7
MTF obtained with the noise method. Radial averaging was performed with Gaussian rings in order to diminish the discretization error.

Расми 8
MTF obtained with the edge method employing ( а ) a beam stop (detector З is characterized at 120 and 200 kV) and ( б ) an aperture.

The MTF of detector З was also determined at 200 kV (Fig. 8 а ). It showed a more rapid decrease at lower frequencies. The MTF at half Nyquist was measured as 0.19 at 120 kV and 0.13 at 200 kV.

4.7. Conversion factor and DQE

The conversion factors at 120 kV as measured using the screen current method were 76, 100 and 34 ADU pe −1 for detectors X , Я ва З , мутаносибан. The conversion factor for detector З at 200 kV was 23 ADU pe −1 . Fig. 9 shows the DQE for all three detectors. The DQE at frequencies close to zero is about 0.6 for all three detectors (Table 1 ).


Расми 9
DQE for three detectors, measured with a dose of 182, 146 and 80 primary electrons per pixel for detectors X , Я ва З , мутаносибан. The similarity in the graphs indicates that the lower MTFs of detectors X ва Я are compensated for by large conversion factors.

5. Discussion

Raw images provide useful system information. Quantification of noise based on raw (unprocessed) CCD images will give different values compared with quantification based on corrected (calibrated) images owing to image rescaling by flat-fielding. In this study, the characterization of the cameras was based on raw images, which could fortunately be obtained through scripting for all of our in-house detectors. Data-acquisition software, such as Digital Micrograph (http://www.gatan.com/products/software/ ) and Serial EM (Mastronarde, 2005 ), typically collect one new dark reference image prior to the collection of each new series of images, thus ensuring that the dark reference image noise was representative for the imaging conditions used. The disadvantage of this approach is that the acquisition of new dark reference images for every new series of images takes time. Multiple dark reference images would be needed in order to reject zingers. The FEI Tecnai software (v.3.1.2 http://www.fei.com ) also allows online dark subtraction, but relies on previously collected dark reference images. These images are collected for one exposure time only, making dark subtraction less accurate if deviating exposure times were used. The possible advantage of the use of a series of previously collected dark reference images (apart from the gain in data-collection speed) is that more elaborate outlier-rejection schemes could be applied. Fig. 1 shows that the number of outliers, including decreased pixel values, can be quite substantial: up to one per 1000 (or 0.1%) for detector X .

The number of outliers in the dark reference images increased for both detectors X ва З as a function of exposure time, at a rate of approximately 150 pixels s −1 . This high rate can probably be attributed to the larger influence of cosmic rays and radioactive decay with increased integration time. In contrast, detector Я did not show such an increase. This detector has a much higher dark current (Fig. 3 Table 1 ) compared with detectors X ва З . The increased noise level of detector Я at longer exposure times probably masks the detection of the increased occurrences of outliers as observed for the other two detectors. For all three detectors, the dark current is much higher then the tabulated nominal value of 0.005 CCDe pixel −1 s −1 for the 486 Fairchild sensor cooled to 213 K. A doubling of the dark current for every 7 K of temperature increase (http://www.fairchildimaging.com/main/documents/Condor486-90_RevE.pdf ) would suggest that these sensors, despite their identical set temperature of 248 K, are actually used at temperatures of 259 K (detector X ), 281 K (detector Я ) and 248 K (detector З ). An increased dark current could also be a consequence of radiation damage to the CCD itself (Allinson, 1994 ) however, detector Я was basically new at the time of characterization. We interpret these values as a strong indication that detectors X ва Я are not cooled as well as detector З .

Macromolecular crystallography (MX) CCD sensors are generally cooled to far lower temperatures compared with TEM CCD sensors. For instance, the Bruker APEXII detector (based on the Fairchild 486 sensor) is cooled to 213 K and the Rayonix 165 detector to 203 K. The lower temperature is partly required because of the longer exposure times that are used at older X-ray sources and the lower conversion factors for X-ray photons compared with high-energy electrons. These X-ray detectors are thermally isolated units that are placed separately from the goniometer holding the specimen. This allows these detector manufacturers to accurately control the vacuum and temperature of the CCD, overcoming the need for routine recalibration. In contrast, TEM detectors are directly mounted on the electron microscope in a vacuum that is controlled by the electron-microscope manufacturer rather than the detector manufacturer. This vacuum also contains the specimen, films ва гайра . and is therefore not guaranteed to be of constant quality. Deeper cooling of the CCD sensor and the coupled fibre-optic plate could result in condensation on the detector surface. In contrast to X-ray CCD detectors, TEM detectors do seem to require repetitive recalibrations. It is our impression that the frequency of calibration could be lessened if the vacuum and cooling conditions of the camera could be better controlled яъне to a standard comparable to those of MX detectors. A more constant and deeper cooling of the TEM detector would allow the use of more accurate bias-correction and gain-correction schemes, faster data collection (no need to recollect the dark image every time) and a decoupling of the correction for CCD fixed-pattern noise from the correction for beam inhomogeneities.

Fig. 4 shows the number of pixels with a dark current higher than a certain threshold. Various criteria can define a hot pixel, for example a dark current higher than ten times the average dark current or dark signals higher than one per 1000 of the maximum encoding range at the nominal exposure time (Ponchut, 2006 ). Fig. 4 seems to strongly favour detector З over detectors X ва Я , but this difference would be less striking if the first criterion had been used. The `hottest' pixels, particularly for detector X , will saturate, with the column valves closed, if integration times between 10 and 60 s are used leakage will result in pixel column defects. Not all detector manufacturers give image-blemish grades (point, cluster and column defects), as this is a delicate balance between system cost, industrial state of the art and actual experimental needs. As long as no recalibration of the detector is needed, `hot' pixels can be reliably identified and taken into account during subsequent data processing by either replacing them with a value based on the statistics of neighbouring pixels or marking them as `unknown'. This lookup table will also contain extreme values from the gain-normalized image as obtained using (5) .

The impact of the use of lookup tables for image correction becomes particularly apparent during the calculation of cross-correlation functions with the purpose of measuring image shifts. Image shifts are often measured in automated TEM procedures, масалан during automated tomographic data collection (Koster ва дигарон. , 1997). These automated procedures fail if image shifts are not measured correctly. Therefore, if the fixed-pattern noise is not fully accounted for then images are not measured correctly because of the appearance of an additional undesired peak at the origin of the cross-correlation function. This origin peak corresponds to the unshifted fixed pattern between the two images. The height (intensity) of the origin peak can dominate the true cross-correlation peak when low-contrast specimens such as vitrified biological materials are imaged. Under these conditions, the true correlation peak will be relatively low and the appearance of an origin peak owing to imperfect calibration may well pose limits to reliable automation. The use of lookup tables could mitigate part of the problem of fixed-pattern noise, but unfortunately not all software packages can employ these at present. Correction of the raw images with our own average dark and white reference images virtually eliminates the cross-correlation origin peak.

Uncorrected systematic outliers can result in undesirable artefacts if the data are used for three-dimensional reconstructions. State-of-the-art tomographic reconstruction packages such as IMOD (Mastronarde, 2008 ) and Inspect 3 Д (http://www.fei.com ) can use statistical criteria to identify and correct cosmic rays and detector flaws prior to reconstruction. However, more subtle systematic errors will still propagate unless adequate lookup tables are used.

The use of four readout ports of data from a CCD chip can result in both bias (Fig. 2 ) and gain (Fig. 5 а ) inhomogeneities. Gain inhomogeneities in corrected diffraction images of ±1% or less with respect to the average values are deemed to be acceptable (Ponchut, 2006 ). The quadrant gain inhomogeneities in the raw images are less then 1% for detector З , whereas they are around 6% for detectors X ва Я . An improper correction of poorly balanced offsets could lead to quadrant-edge effects, especially in Fourier domains (Zheng ва дигарон. , 2007). Correction will be more precise if the spread of the bias is smaller.

The conversion factor is rather large for detectors X (76 ADU pe −1 ) and Я (100 ADU pe −1 ), whereas detector З has a conversion factor (34 ADU pe −1 at 120 kV, 23 ADU pe −1 at 200 kV) that is close to the values given in the literature for this type of detector. The readout noise, in CCDe, is slightly higher for detector X then for detectors Я ва З (Table 1 ). The effective gain is rather similar for detector X (5.3 ADU pe −1 ) and for detector З (4.8 ADU pe −1 ), whereas detector Я is the most sensitive, with an effective gain of 7.7 ADU pe −1 . For simulated data, the effective gain will converge to the conversion factor for increased pixel binning as the dampening effect of the point-spread function will decrease for higher binning. For the data presented here, 16 × 16 rebinning reduces the difference between the effective gain and the conversion factor to less than 10%. However, for higher binning the effective gain does not converge to the conversion factor owing to detector-response inhomogeneities (Ponchut, 2006 ).

Both the edge and the noise method give a comparable relative ranking of the three detectors. Detector З shows better propagation at low frequency compared with detectors X ва Я . Even for 200 kV electrons, detector З looks better between 0 and 0.2 Nyquist rate compared with detectors X ва Я for 120 kV electrons, whereas it is comparable at higher frequencies. For higher voltages of the electron source, the percentage of electrons that are backscattered from the support layer of the CCD camera will be higher (Meyer & Kirkland, 2000 ). They re-enter the scintillator and give rise to intensity at a large lateral distance from the place they initially hit the scintillator and cause a more rapid decrease of the signal for low frequencies. By changing the thickness of the phosphor layer one can alter the balance between sensitivity and resolution, as a thicker layer gives a better sensitivity but also a larger point spread. This might explain why detectors X ва Я have better sensitivity but lower resolution compared with detector З , although the differences in the size of the fibre-optic bundles (1.1 mm for detector X , Fig. 5 б 450 µm for detector З , Fig. 5 в ) are also likely to have an effect on the MTF at low resolution. The noise method gives values for the MTF that are too optimistic at higher frequencies where the noise contributions of the camera start to dominate. Both the beam-stop (Fig. 8 б ) and the aperture (Fig. 8 а ) MTF graphs approximate zero towards the Nyquist frequency, which has been reported to be an over-pessimistic estimate of the true MTF (Fan & Ellisman, 2000 ).

For all three detectors, the DQE at frequencies close to zero is about 0.6. Measurement errors in conversion factor would give proportional errors in the DQE measurement (10) . TEM detectors with larger pixel sizes can show even better DQE(0) values of 0.8 (Kim ва дигарон. , 2007 ) or 0.76 (Meyer ва дигарон. , 2000 ). The normalized noise power spectrum will be dose-dependent Fig. 9 shows the DQE for our three detectors measured with a relatively high dose of 182, 146 and 80 primary electrons per pixel. Overall, the DQEs of the more sensitive detectors X ва Я are remarkably comparable with the DQE of the sharper and less noisy detector З (Fig. 9 ).

A number of programs exist to aid macromolecular crystallographers in planning their data-collection strategy (Leslie, 1992 Ravelli ва дигарон. , 1997 Popov & Bourenkov, 2003 ). From one or a few images, these programs will characterize the specimen, simulate data-set statistics for different combinations of data-collection parameters and suggest the most optimal ones. The program Беҳтарин (Popov & Bourenkov, 2003 ) honours its name by being able to suggest an optimal data-collection strategy based on the most complete set of parameters. These include anisotropic diffraction, background scattering, detector statistics, geometric parameters and even radiation damage (Bourenkov & Popov, 2006 Ravelli & Garman, 2006 ). Given a number of test images, the program will suggest exposure time, rotation range, number of images and starting angle and predict data-set statistics such as signal-to-noise рӯ ба рӯи resolution for each suggestion. One could imagine a similar scheme for (cryo-)electron microscopy, in particular for tomographic data collection, where the effect of parameters such as defocus, rotation steps, number of angles, single рӯ ба рӯи double tilt, electron dose and electron-dose rate, magnification and detector binning could be simulated after an initial characterization of the specimen with a small number of test images. A detailed knowledge of all the parameters involved, including the characteristics of the camera as determined here, will aid the development of an `expert system' (Leslie ва дигарон. , 2002 ) that will help the electron microscopist to make objective and reproducible decisions for their (tomographic) data collection.

6. Хулоса

A general methodology for characterizing TEM CCD detectors has been presented. The set of algorithms have been added to the publicly available image-processing toolbox for MATLAB (http://www.diplib.org/home22266 ) to allow non-expert electron-microscopy users to characterize, based on uncorrected images, the properties of their CCD detector. Furthermore, it can facilitate information exchange between detector users and producers. Three 4k in-house CCDs have been characterized, showing different strengths in terms of sensitivity, resolution, DQE and noise. The need for the use of lookup tables is demonstrated. Fixed-pattern noise could be fully accounted for by using large sets of dark and white reference images. Unfortunately, the noise patterns seem to drift in time, possibly because of unstable cooling of the CCD sensors, thereby limiting the useful lifetime of these reference sets.

Эътирофҳо

The authors thank Frank Faas and Montserat Barcena for useful discussions, Remco Schoenmakers for critical reading of the manuscript and Paul Mooney for crucial help in the determination of the conversion factors by calibration of the incident beam currents. MV was financially supported by the FOM Industrial Partnership program No. 07.0599. RBGR acknowledges financial support from NWO under project No. 016.072.321. This article includes work presented at The Max-Inf2/Lorentz Center Workshop on New Algorithms in Macromolecular Crystallography and Electron Microscopy, May 2008.

Иқтибосҳо

Aikens, R. S., Agard, D. A. & Sedat, J. W. (1989). Methods Cell Biol. 29 , 291–313. CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Allinson, N. M. (1994). J. Синхротрон рад. 1 , 54–62. CrossRef CAS Web of Science IUCr Journals Google Scholar
Bourenkov, G. P. & Popov, A. N. (2006). Акта Крист. Д 62 , 58–64. Web of Science CrossRef CAS IUCr Journals Google Scholar
Bourgeois, D., Moy, J. P., Svensson, S. O. & Kvick, Å. (1994). J. Appl. Крист. 27 , 868–877. CrossRef CAS Web of Science IUCr Journals Google Scholar
Brink, J. & Chiu, W. (1994). J. Сохтори. Биол. 113 , 23—34. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Carragher, B., Kisseberth, N., Kriegman, D., Milligan, R. A., Potter, C. S., Pulokas, J. & Reilein, A. (2000). J. Сохтори. Биол. 132 , 33–45. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Dainty, J. C. & Shaw, R. (1974). Image Science: Principles, Analysis and Evaluation of Photographic-type Imaging Processes. Ню Йорк: Матбуоти академӣ. Google Scholar
Downing, K. H. & Hendrickson, F. M. (1999). Ultramicroscopy , 75 , 215–233. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Fan, G. Y. & Ellisman, M. H. (2000). J. Microsc. 200 , 1–13. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Faruqi, A. R., Cattermole, D. M., Henderson, R., Mikulec, B. & Raeburn, C. (2003). Ultramicroscopy , 94 , 263–276. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Faruqi, A. R. & Henderson, R. (2007). Курр. Фикр. Сохтор. Биол. 17 , 549–555. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Kim, Y. M., Lee, J. Y., Moonen, D., Jang, K. I. & Kim, Y. J. (2007). J. Electron Microsc. 56 , 217–224. Web of Science CrossRef CAS Google Scholar
Koster, A. J., Chen, H., Sedat, J. W. & Agard, D. A. (1992). Ultramicroscopy , 46 , 207–227. CrossRef PubMed CAS Web of Science Google Scholar
Koster, A. J., Grimm, R., Typke, D., Hegerl, R., Stoschek, A., Walz, J. & Baumeister, W. (1997). J. Сохтори. Биол. 120 , 276–308. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Krivanek, O. L. & Mooney, P. E. (1993). Ultramicroscopy , 49 , 95–108. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Leslie, A. G. W. (1992). Jnt CCP4/ESF–EACBM Newsl. Протеини Crystallogr. 26 . Google Scholar
Leslie, A. G. W., Powell, H. R., Winter, G., Svensson, O., Spruce, D., McSweeney, S., Love, D., Kinder, S., Duke, E. & Nave, C. (2002). Акта Крист. Д 58 , 1924–1928. Web of Science CrossRef CAS IUCr Journals Google Scholar
Mastronarde, D. N. (2005). J. Сохтори. Биол. 152 , 36–51. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Mastronarde, D. N. (2008). J. Microsc. 230 , 212–217. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
McMullan, G., Cattermole, D. M., Chen, S., Henderson, R., Llopart, X., Summerfield, C., Tlustos, L. & Faruqi, A. R. (2007). Ultramicroscopy , 107 , 401–413. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Meyer, R. R. & Kirkland, A. I. (2000). Микроскоп. Res. Техник. 49 , 269–280. CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Meyer, R. R., Kirkland, A. I., Dunin-Borkowski, R. E. & Hutchison, J. L. (2000). Ultramicroscopy , 85 , 9–13. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Moy, J. P., Hammersley, A. P., Svensson, S. O., Thompson, A., Brown, K., Claustre, L., Gonzalez, A. & McSweeney, S. (1996). J. Синхротрон рад. 3 , 1–5. CrossRef CAS Web of Science IUCr Journals Google Scholar
Mullikin, J. C., van Vliet, L. J., Netten, H., Boddeke, F. R., van der Feltz, G. W. & Young, I. T. (1994). Прок. SPIE , 2173 , 73–84. CrossRef Google Scholar
Nickell, S., Forster, F., Linaroudis, A., Net, W. D., Beck, F., Hegerl, R., Baumeister, W. & Plitzko, J. M. (2005). J. Сохтори. Биол. 149 , 227–234. Web of Science CrossRef PubMed Google Scholar
Ponchut, C. (2006). J. Синхротрон рад. 13 , 195–203. Web of Science CrossRef CAS IUCr Journals Google Scholar
Popov, A. N. & Bourenkov, G. P. (2003). Акта Крист. Д 59 , 1145–1153. Web of Science CrossRef CAS IUCr Journals Google Scholar
Rabbani, M., Shaw, R. & Van Metter, R. (1987). J. Opt. Соц. Ам. А , 4 , 895–901. CrossRef CAS PubMed Web of Science Google Scholar
Ravelli, R. B. G. & Garman, E. F. (2006). Курр. Фикр. Сохтор. Биол. 16 , 624–629. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Ravelli, R. B. G., Sweet, R. M., Skinner, J. M., Duisenberg, A. J. M. & Kroon, J. (1997). J. Appl. Крист. 30 , 551–554. CrossRef CAS Web of Science IUCr Journals Google Scholar
Roberts, P. T. E., Chapman, J. N. & MacLeod, A. M. (1982). Ultramicroscopy , 8 , 385–396. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Samei, E., Flynn, M. J. & Reimann, D. A. (1998). Мед. Физ. 25 , 102–113. Web of Science CrossRef CAS PubMed Google Scholar
Sander, B., Golas, M. M. & Stark, H. (2005). J. Сохтори. Биол. 151 , 92–105. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Spence, J. C. H. & Zuo, J. M. (1988). Rev. Sci. Instrum. 59 , 2102–2105. CrossRef CAS Web of Science Google Scholar
Suloway, C., Pulokas, J., Fellmann, D., Cheng, A., Guerra, F., Quispe, J., Stagg, S., Potter, C. S. & Carragher, B. (2005). J. Сохтори. Биол. 151 , 41–60. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Verbeek, P. W. & van Vliet, L. J. (1994). IEEE Транс. Pattern Anal. Mach. Intell. 16 , 726–733. CrossRef Web of Science Google Scholar
Vliet, L. J. van, Sudar, D. & Young, I. T. (1998). Биологияи ҳуҷайра , edited by J. E. Celis, pp. 109–120. Ню Йорк: Матбуоти академӣ. Google Scholar
Zheng, S. Q., Keszthelyi, B., Branlund, E., Lyle, J. M., Braunfeld, M. B., Sedat, J. W. & Agard, D. A. (2007). J. Сохтори. Биол. 157 , 138–147. Web of Science CrossRef PubMed CAS Google Scholar
Zinger, A. (1961). Биометрия , 48 , 457–461. CrossRef Google Scholar

Ин як мақолаи дастрас аст, ки тибқи шартҳои Литсензияи Creative Commons Attribution (CC-BY) паҳн карда шудааст, ки ба истифодаи бемаҳдуд, паҳн ва дубора дар ҳама гуна воситаҳо иҷозат медиҳад, ба шарте ки муаллифон ва сарчашмаи аслӣ истинод карда шаванд.


Calibration slide

Use a calibration slide which has a grid with known line-to-line spacing (9.9um). Align the slide so that the grid lines are parallel/perpendicular to the x and y axes. I borrowed such a slide from Peter Sorger's lab.

  • 60x DIC Plan Apo
    • 13 squares gave 1204.26 pixels in length. 1204.26 pixels/(13 square * 9.9um/squares) = 9.35 pixels/um
    • 14 squares gave 1297.30 pixels in length. 1297.30 pixels/(14 squares * 9.9um/squares) = 9.36 pixels/um
    • 60x DIC Plan Apo with 1.5x intermediate magnification:
      • Horizontal : 3 measurements of 8 squares gave 1106.2, 1105.2 and 1106.2 pixels in length. --> 13.96' pixels/um (Std error = 0.00)
      • Vertical: 3 measurements of 7 squares gave 968.2, 968.2, 968.2 pixels in length --> 13.97 pixels/um (Std error = 0.00)
      • 60x Ph Plan Apo with 1.5x intermediate magnification gave virtually the same results.

      Why is Field of View Relevant for Microscopes?

      The Field of View on a microscope determines the size of the imaged area. It gains importance when you want to measure specifics such as densities -for example, an experiment to estimate the density of cells in a solution. To get the answer, you have to acquire an image of a Field of View, count the number of cells and divide it by the imaged area. The result would be an estimate of cells/micron.

      Note that the extent of the Field of Vision depends on the magnification. Objectives with higher magnifications have smaller Fields of Vision. Thus, the size of the Field of Vision should be selected as a function of the size of the features that are to be studied. Bacteria are smaller (around 5 microns) than most human cells (a brain's astrocyte can have 90 microns in diameter). Therefore, to study astrocytes larger Fields of Vision are necessary.

      When you record the image to a digital medium the FOV can be expressed as a distance (e.g., 1 mm) or in calibrated pixel counts (e.g., 1024 pixels at 1 um/pixel) along the major axis.


      Magnification Equation Calculator

      Below is the online magnification equation calculator based on the image distance (dман) and object distance (do). The magnification of an object is the ratio of the height of the image (hман) where you can see the height of the actual object is being magnified (ho). The magnification equation is given as M = -(dман / do). In the below Lens Magnification Calculator, enter the values for the image distance and the object distance to know the magnification of lens(M).


      Бузург кардан Useful calculators and formulae.

      1: Atmospheric seeing conditions (the sky) often limits the maximum usable magnification to 250-350x.

      2: An exit pupil size (diameter of light beam as it exits eyepiece) over 7.5mm might be too large for telescope designs with central obstructions (i.e. Newtonian telescopes).

      3: Exit pupils less than 0.4mm are impractical because eye floaters and eye-lashes can interfere with the view. They might also indicate the magnification is too high.


      Видеоро тамошо кунед: СРОЧНО 3 -НАФАР МОДАРО АЗ ДАСТИ ОЗЕРХО ГИРИФТАНД БАРОИ МАЪЛУМОТ ЗАНГ ЗАНЕД.+7 995 742-84-00 (Январ 2022).