Маълумот

Транскрипсияи баръакси миқёси калон?


Ман бояд дуплексҳои RNA:DNA созам. Ман метавонам аз 100 то 200 мг mRNA ба воситаи in vitro транскрипсия ва ман медонам, ки чӣ гуна транскрипсияи баръаксро барои сохтани китобхонаи cDNA истифода барам, аммо ман бо ин саволҳо дорам.

mRNA, ки ман бо IVT месозам, ҳама поли А РНК аст ва маҷмӯаи транскрипсияи баръакс ман мегӯяд, ки 5 г РНК ё 500 нг поли А РНК-ро истифода барад. Ба ман лозим аст, ки ҳадди аққал 10 г РНК: ДНК созам, ки ин аз маҳдудияти пешниҳодшуда барои поли А РНК 20 маротиба зиёд аст, бинобар ин, миқёси мустақимро боло бурдан мумкин нест.

Ман адабиётеро барои сохтани ин қадар миқдори зиёди ДНК тавассути транскрипсияи баръакс пайдо карда наметавонам, ҳама чизеро, ки ман дарёфтам, ки РНК-ро истифода мебарад: Дуплексҳои ДНК риштаҳои кӯтоҳеро истифода мебаранд, ки аз ҷиҳати кимиёвӣ синтез ва муттаҳид шудаанд, mRNA-и ман 1800 асос дароз аст, бинобар ин ман метавонам' т танҳо як олиго фармоиш диҳед, ман бояд онро созам.

Таҳрир: Ман дар бораи саволи худ шарҳ дода наметавонам.

Дуплексҳо тақрибан 1800 пойгоҳро ташкил медиҳанд, ки он барои люциферазаи оташфишон аст.

Кӯшиши сохтани ДНК барои дуплекс аз қолаби аслии ДНК масъалаҳои дигарро пешкаш мекунад. Дар ҳоле, ки буридани он аз плазмид осон аст, он дуқатор хоҳад буд ва ман бояд бо РНК омехта ва онро гарм кунам, то ҳама чизро ҷудо созам ва умедворам, ки РНК пеш аз риштаҳои ДНК дубора пайваст мешавад. Ман инчунин фикр мекунам, ки ин идоракунии маро душвортар мекунад, зеро гуфтан душвортар аст, ки ҳар гуна ифодае, ки ман пас аз расонидани ин дуплексҳо мебинам, аз РНК меояд, на аз ДНК. Албатта, синтези ДНК аз РНК низ метавонад ин мушкилотро ба вуҷуд орад.

Баъзе ҳисобҳои хом нишон медиҳанд, ки dNTPҳо реагентҳои маҳдудкунанда барои транскрипти ин андоза мебошанд ва ҳатто бо 5 г mRNA ман бояд барои реаксия праймери олиго dT дошта бошам. Ман ҳоло аз 0,5 то 5 г mRNA, 1uL праймер ва 4uL dNTP реаксияҳоро иҷро мекунам, то боварӣ ҳосил кунам, ки ман кофӣ дорам. Умедворам, ки гел хуб мешавад.

Таҳрир: Ман натиҷаҳоро гирифтам. То ҳол чунин ба назар мерасад, ки 3.0ug mRNA беҳтарин кор мекунад. Он ториктарин банд дорад ва дарозии дуруст ба назар мерасад. Камтар mRNA бандҳои заифтареро медиҳад, ки хеле кӯтоҳ ба назар мерасанд ва бештар mRNA бандҳои каме сусттарро медиҳад, ки каме хеле кӯтоҳ ба назар мерасанд. Инчунин, ман реаксияро ба ҷои 1 соат 2 соат иҷро кардам.


Беҳтарин роҳи васеъ кардани ин гуна аксуламалҳо ташкили реаксияҳои зиёд аст. Мастермиксро барои 20 реаксия омода кунед. Шумо метавонед онҳоро якҷоя кунед, РНК-ро таҳрик диҳед ва ба консентратсияи мувофиқ дар оби нуклеазҳо об кунед. Инчунин, ба ҷои олиго-dT як праймери мушаххаси генро истифода баред ва думҳои поли-Аро илова накунед (поли-А ба устувории in vitro РНК таъсир намерасонад).

Тавре Mad Scientist аллакай қайд кард, ба шумо лозим нест, ки дубора аз РНК ДНК созед. Танҳо таносуби молярии 1:2-и қолаби IVT-и худ dsDNA (маҳдудияти ҳазмшуда) ва RNA (пас аз IVT) -ро гиред. Оҳиста-оҳиста гарм кунед ва гарм кунед. Гибридҳои ДНК-РНК нисбат ба гибридҳои ДНК-ДНК қавитаранд ва аввалӣ эҳтимоли пас аз коркард ба вуҷуд меоянд. Шумо метавонед риштаҳои ҷудонашударо бо истифода аз ферментҳо, ба монанди нуклеазаи мош ҳазм кунед.


Реаксияи занҷири транскрипсияи баръакси полимераз дар весикулаҳои азими якқабата

Мо татбиқи весикулаҳои азими якқабатаро (GUV) барои муайян кардани РНК бо истифода аз он арзёбӣ кардем. дар весикул Реаксияи занҷири полимеразии транскрипсияи баръакс (RT-PCR). Мо GUV-ҳоро омода кардем, ки омехтаи реаксияи як деги RT-PCR, аз ҷумла шаблони РНК, праймерҳо ва зондҳои Такманро бо истифода аз усули интиқоли эмульсия дар равған дарбар мегиранд. Пас аз гардиши гармӣ, мо GUV-ро таҳлил кардем, ки сигналҳои пуршиддати флуоресцентиро нишон доданд, ки тақвияти cDNA-ро ифода мекунанд. Таҳлили муфассали маълумоти цитометрии ҷараён нишон дод, ки rRNA ва mRNA дар РНК-и умумӣ метавонанд аз 10-100 нусха дар GUVs бо диаметри 5-10 мкм афзоиш дода шаванд, гарчанде ки фраксияи GUV реаксияшаванда ҳадди аксар тақрибан 60% буд. Ғайр аз он, мо хабар медиҳем, ки РНК-и мақсаднок, ки мустақиман ба реакторҳои GUV тавассути синтези мембрана интиқол дода шудааст, метавонад бо истифода аз он тақвият ва муайян карда шавад. дар весикул RT-PCR. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки GUVs метавонад ҳамчун реакторҳои биомиметикӣ истифода шавад, ки қодиранд PCR ва RT-PCR -ро иҷро кунанд, ки дар барномаҳои таҳлилӣ ва ташхисӣ бо вазифаҳои иловагӣ муҳиманд.


Хатти транскрипсияи баръакс

Консентратсияи нисбии умумии РНК метавонад ба самаранокии РТ ва консентратсияи cDNA аз транскрипти додашуда таъсир расонад. Аз ин рӯ, матлуб аст, ки консентратсияи якхела ё хеле шабеҳи РНК ба ҳама реаксияҳои синтези cDNA ду марҳила дохил карда шавад, ба шарте ки системаи RT ҷавоби хаттӣ дошта бошад. Чунон ки дар Расми 8.2, бо истифода аз протоколи анъанавии RT, 100-каратаи ҳалкунии РНК-и воридотӣ ба фарқияти мувофиқи 100-каратаи ҳосили cDNA барои қолибҳои санҷидашуда оварда намерасонад. Ҷолиб он аст, ки маълумоти пешниҳодшуда такрори qPCR дар реаксияҳои такрории RT мебошанд. Тавре ки нишон дода шудааст, набудани хатти байни ду реаксияи RT такроршаванда аст.

Расми 8.2. РНК-и умумӣ тавассути 100 маротиба илова карда шуд ва баръакс бо истифода аз ду марҳилаи тасодуфӣ ду реаксияи мустақили RT иҷро карда шуд. β-актин дар qPCR-ҳои такрорӣ барои ҳар як реаксияи RT муайян карда шуд. RT такроршаванда аст, аммо ҳосили cDNA ба консентратсияи RNA-и воридшаванда мутаносиб нест. Аз ин рӯ, агар маҳдудиятҳои таҷрибавӣ талаб кунанд, ки консентратсияи тағирёбандаи РНК ба РТ дохил карда шавад, тафтиш кардани он, ки протокол ва омезиши реагентҳо ба вокуниши хатӣ оварда мерасонад, муҳим аст.

Дар мисоле, ки дар Расми 8.3, Реагенти ReadyScript ® RT (RDRT) барои баргардонидани транскрипсияи умумии РНК аз 2-карата ва 10-каратаи сершавии пайдарпайи қолаб бо истифода аз протоколи дуқадамӣ ва омезиши oligo-dT (O4387) ва пешбурди тасодуфӣ (тавсифшуда) истифода шудааст. дар зер). Ген CANX дар ҳарду силсилаи ҳалкунанда бо мутаносибии мустақим ба консентратсияи РНК воридшуда муайян карда шуд.

Расми 8.3. Реагенти ReadyScript® RT (RDRT) барои баргардонидани транскрипсияи умумии РНК аз разряди силсилавии 2 ва 10-карата истифода шуд. Ген CANX дар ҳарду силсилаи маҳлул ошкор карда шуд, ки дар натиҷа мутаносибии мустақим ба консентратсияи РНК-и воридотӣ ба вуҷуд омад (маълумот аз гурӯҳҳои донишҷӯён, ки дар Семинари EMBL Advanced qPCR иштирок мекунанд).


Мундариҷа

Транскриптазаҳои баръакс аз ҷониби Ҳовард Темин дар Донишгоҳи Висконсин-Мэдисон дар ш. Саркомаи Рус virions [5] ва мустақилона аз ҷониби Дэвид Балтимор дар соли 1970 дар MIT аз ду вируси варами РНК ҷудо карда шудааст: вируси лейкемияи мурӣ ва боз вируси саркомаи Рос. [6] Барои дастовардҳои худ онҳо дар соли 1975 Ҷоизаи Нобелро дар физиология ва тиб (бо Ренато Дулбекко) тақсим карданд.

Транскриптазаҳои баръакси хуб омӯхташуда инҳоро дар бар мегиранд:

  • Транскриптазаи баръакси ВИЧ-1 аз вируси норасоии масунияти одам навъи 1 (PDB: 1HMV ​) дорои ду зербахш аст, ки вазни мувофиқи молекулавии 66 ва 51 кДас доранд. [7]
  • Транскриптазаи баръакси M-MLV аз вируси лейкемияи мури Молоней як мономери ягонаи 75 кДа мебошад. [8]
  • Транскриптазаи баръакси AMV аз вируси миелобластозҳои парранда низ ду зербахш дорад, зербахши 63 кДа ва зербахши 95 кДа. [8] ки теломерҳои эукариотхромосомаҳоро нигоҳ медорад. [9]

Ферментҳо аз ҷониби вирусҳо рамзгузорӣ карда мешаванд ва истифода мешаванд, ки транскрипсияи баръаксро ҳамчун марҳила дар раванди репликатсия истифода мебаранд. Вирусҳои РНК-и баръакс, ба монанди ретровирусҳо, ферментро барои баръакс транскриптсияи геномҳои РНК-и худ ба ДНК истифода мебаранд, ки баъдан ба геномҳои мизбон дохил карда, дар баробари он такрор мешаванд. Вирусҳои ДНК-и баръакс, ба монанди гепаднавирусҳо, метавонанд ба РНК имкон диҳанд, ки дар ҷамъоварӣ ва сохтани риштаҳои ДНК ҳамчун қолаб хизмат кунанд. ВНМО бо истифода аз ин фермент одамро сироят мекунад. Бе транскриптазаи баръакс, геноми вирусӣ наметавонад ба ҳуҷайраи мизбон дохил шавад, ки дар натиҷа репликатсия карда намешавад.

Раванди транскрипсияи баръакс ё ретротранскрипт Таҳрир

Транскриптазаи баръакс аз як қолаби РНК ДНК-и дуқабата эҷод мекунад.

Дар намудҳои вирус бо транскриптазаи баръакс, ки фаъолияти полимеразаи ДНК-и ДНК вобаста нестанд, эҷоди ДНК-и дуқабата мумкин аст тавассути полимеразаи ДНК-и аз ҷониби мизбон рамзшуда δ, ДНК-РНК-и вирусиро ҳамчун праймер иштибоҳ карда, ДНК-и дуқаторро бо усули шабеҳ синтез кардан мумкин аст. механизме, ки дар хориҷ кардани праймер, ки дар он ДНК-и нав синтезшуда қолаби аслии РНК-ро иваз мекунад.

Раванди транскрипсияи баръакс, ки онро ретротранскрипсия ё ретротрас низ меноманд, ба хатогиҳо хеле майл дорад ва маҳз дар ин марҳила метавонад мутацияҳо ба амал оянд. Чунин мутацияҳо метавонанд муқовимати маводи мухаддирро ба вуҷуд оранд.

Транскрипсияи баръакси ретровирусӣ Таҳрир

Ретровирусҳо, ки онро инчунин вирусҳои синфи VI ssRNA-RT меноманд, вирусҳои транскрипсияи баръакси РНК бо миёнаравии ДНК мебошанд. Геномҳои онҳо аз ду молекулаи РНК-и якқатораи мусбӣ бо думи 5' сарпӯш ва 3' думи полиаденилшуда иборатанд. Намунаҳои ретровирусҳо вируси норасоии масунияти одам (ВНМО) ва вируси Т-лимфотропии инсон (HTLV) мебошанд. Эҷоди ДНК-и дуқабата дар ситозол [10] ҳамчун як қатор ин қадамҳо ба амал меояд:

    tRNA ҳамчун праймер амал мекунад ва ба як қисми иловагии геноми РНК вирус, ки макони ҳатмии праймер ё PBS ном дорад, гибрид мешавад.
  1. Пас аз он транскриптаза баръакс нуклеотидҳои ДНК-ро ба охири 3'-и праймер илова мекунад ва ДНК-ро ба U5 (минтақаи рамзгузорӣнашаванда) ва минтақаи R (такрори мустақим дар ҳарду канори молекулаи РНК) аз РНК вирусӣ синтез мекунад.
  2. Домени ферменти баръакси транскриптаза бо номи RNAse H минтақаҳои U5 ва R-ро дар охири 5'-и РНК таназзул мекунад.
  3. Пас аз он праймери tRNA ба охири 3'-и геноми вирус "ҷаҳида" мешавад ва риштаҳои ДНК-и нав синтезшуда ба минтақаи комплементарии R дар РНК гибридизатсия мешаванд.
  4. ДНК-и комплементарӣ (cDNA), ки дар (2) илова карда шудааст, минбаъд васеъ карда мешавад.
  5. Аксарияти РНК-и вирусӣ аз ҷониби RNAse H таназзул карда, танҳо пайдарпаии РР боқӣ мемонад.
  6. Синтези риштаи дуюми ДНК оғоз мешавад ва бо истифода аз порчаи боқимондаи РН РНК вирусӣ ҳамчун праймер.
  7. Примери tRNA тарк мешавад ва "ҷаҳида" ба амал меояд. PBS аз риштаи дуюм бо PBS иловагӣ дар риштаи якум гибридизатсия мешавад.
  8. Ҳарду ришта дароз карда мешаванд, то як нусхаи пурраи ДНК-и дуқабата аз геноми аслии вирусии РНК-ро ба вуҷуд оранд, ки пас аз он тавассути интегразаи фермент метавонад ба геноми мизбон дохил карда шавад.

Эҷоди ДНК-и дуқабата низ дар бар мегирад интиқоли ришта, ки дар он интиқоли маҳсулоти кӯтоҳи ДНК аз синтези ибтидоии ДНК вобаста ба РНК ба минтақаҳои қолаби аксепторӣ дар канори дигари геном мавҷуд аст, ки баъдтар тавассути транскриптазаи баръакс барои фаъолияти ДНК вобаста ба ДНК дастрас ва коркард мешавад. [11]

РНК ретровирусӣ дар охири 5' то 3' ҷойгир шудааст. Ҷойе, ки дар он праймер ба РНК-и вирусӣ пайваст карда мешавад, макони ҳатмии праймер (PBS) номида мешавад. РНК 5'-нӯги сайти PBS U5 номида мешавад ва RNA 3' охири PBS пешво номида мешавад. Примери tRNA аз 14 то 22 нуклеотид кушода мешавад ва дуплекси ҷуфтшудаи асосиро бо РНК вирусӣ дар PBS ташкил медиҳад. Далели он, ки PBS дар наздикии 5' терминали РНК вирус ҷойгир аст, ғайриоддӣ аст, зеро транскриптазаи баръакс ДНК-ро аз 3' охири праймер дар самти 5' то 3' синтез мекунад (нисбат ба риштаи ДНК-и нав синтезшуда). Аз ин рӯ, праймер ва транскриптазаи баръакс бояд ба 3' охири РНК вирусӣ кӯчонида шаванд. Барои ба амал баровардани ин ҷойгиркунӣ, қадамҳои сершумор ва ферментҳои гуногун, аз ҷумла полимеразаи ДНК, рибонуклеаза H (RNase H) ва кушодани полинуклеотид лозиманд. [12] [13]

Транскриптазаи баръакси ВНМО инчунин дорои фаъолияти рибонуклеаза мебошад, ки РНК-и вирусро ҳангоми синтези cDNA таназзул мекунад ва инчунин фаъолияти полимеразаи ДНК-и вобаста ба ДНК, ки риштаи ҳисси cDNA-ро ба DNA нусхабардорӣ мекунад. антисенс ДНК барои ташаккули ДНК-и дуқабата миёнаравии вирусӣ (vDNA). [14]

Қисмҳои худи такроршавандаи геномҳои эукариотӣ, ки бо номи ретротранспозонҳо маълуманд, транскриптазаи баръаксро барои гузаштан аз як мавқеъ дар геном ба дигараш тавассути миёнаравии РНК истифода мебаранд. Онҳо дар геномҳои растаниҳо ва ҳайвонот ба таври фаровон мавҷуданд. Теломераза боз як транскриптазаи баръакс аст, ки дар бисёр эукариотҳо, аз ҷумла одамон, мавҷуд аст, ки қолаби РНК-и худро дорад, ин РНК ҳамчун қолаб барои репликатсияи ДНК истифода мешавад. [15]

Ҳисоботи ибтидоӣ дар бораи транскриптазаи баръакс дар прокариотҳо ҳанӯз соли 1971 дар Фаронса (Белянски ва дигарон, 1971a, 1972) ва чанд сол пас дар СССР (Ромащенко 1977 [16]) омада буданд. Аз он вақт инҷониб онҳо ба таври васеъ ҳамчун як қисми ретронҳои бактериявӣ тавсиф карда шуданд, пайдарпаии мушаххасе, ки транскриптазаи баръаксро рамзгузорӣ мекунанд ва дар синтези msDNA истифода мешаванд. Барои оғоз кардани синтези ДНК як праймер лозим аст. Дар бактерияҳо, праймер ҳангоми репликатсия синтез карда мешавад. [17]

Валериан Долҷа аз иёлати Орегон бар ин назар аст, ки вирусҳо аз сабаби гуногунии худ дар рушди ҳаёти ҳуҷайра нақши эволютсионалӣ бозидаанд ва транскриптазаи баръакс нақши марказӣ мебозад. [18]

Транскриптазаи баръакс сохтори "дасти рост" -ро истифода мебарад, ки ба он сохторе, ки дар дигар полимеразҳои кислотаи нуклеинҳои вирусӣ мавҷуд аст. [19] [20] Илова ба функсияи транскриптатсия, транскриптазаҳои баръакси ретровирусӣ домени мутааллиқ ба оилаи RNase H доранд, ки барои такрори онҳо муҳим аст. Бо таназзули қолаби РНК, он имкон медиҳад, ки риштаи дигари ДНК синтез карда шавад. [21] Баъзе порчаҳои ҳозима инчунин ҳамчун праймер барои полимеразаи ДНК хидмат мекунанд (ё ҳамон фермент ё сафедаи мизбон), ки барои сохтани риштаи дигар (плюс) масъуланд. [19]

Дар давраи ҳаёти ретровирус се системаи такрории гуногун мавҷуданд. Раванди аввал ин синтези баръакси транскриптазавии ДНК-и вирусӣ аз РНК-и вирусӣ мебошад, ки баъдан риштаҳои ДНК-и иловагиро ба вуҷуд меорад. Раванди репликатсия вақте рух медиҳад, ки ДНК-и ҳуҷайравии полимераза ДНК-и вирусиро такрор мекунад. Ниҳоят, РНК полимераза II ДНК-и провирусиро ба РНК интиқол медиҳад, ки он ба вирионҳо печонида мешавад. Мутация метавонад дар давоми як ё ҳамаи ин қадамҳои такрорӣ рух диҳад. [22]

Транскриптазаи баръакс ҳангоми транскрипсияи РНК ба ДНК сатҳи баланди хатогӣ дорад, зеро бар хилофи аксари дигар полимеразҳои ДНК, он қобилияти хонданро надорад. Ин сатҳи баланди хатогӣ имкон медиҳад, ки мутатсияҳо нисбат ба шаклҳои репликатсия бо суръати тезтар ҷамъ шаванд. Транскриптҳои баръакси аз ҷониби тиҷоратӣ дастрасшуда, ки Промега истеҳсол кардааст, дар дастури онҳо ҳамчун хатогиҳо дар ҳудуди 1 дар 17,000 асос барои AMV ва 1 дар 30,000 асос барои M-MLV оварда шудаанд. [23]

Ба ғайр аз эҷоди полиморфизмҳои якнуклеотидӣ, транскриптазаҳои баръакс инчунин дар равандҳо ба монанди синтези транскрипт, омехтакунии экзонҳо ва эҷоди транскриптҳои антисенси сунъӣ иштирок мекунанд. [24] [25] Тахмин шудааст, ки ин иваз кардани шаблон фаъолияти транскриптазаи баръакс, ки онро пурра нишон додан мумкин аст дар зинда, шояд яке аз сабабҳои дар геномҳои организмҳои моделӣ пайдо кардани якчанд ҳазор транскриптҳои беанотатсияшуда бошад. [26]

Гузариш ба Шаблон Таҳрир

Ду геноми РНК ба ҳар як заррачаи ретровирус бастабандӣ карда мешавад, аммо пас аз сироят, ҳар як вирус танҳо як провирус тавлид мекунад. [27] Пас аз сироят, транскрипсияи баръакс бо иваз кардани шаблон байни ду нусхаи геномӣ (рекомбинатсияи интихоби нусхабардорӣ) ҳамроҳ мешавад. [27] Ду модел вуҷуд дорад, ки нишон медиҳанд, ки чаро транскриптазаи РНК қолибҳоро иваз мекунад. Якум, модели маҷбурии интихоби нусхабардорӣ, пешниҳод мекунад, ки транскриптазаи баръакс ҳангоми дучор шудан бо ник қолаби РНК-ро тағир диҳад ва ин маънои онро дорад, ки рекомбинатсия барои нигоҳ доштани якпорчагии геноми вирус ҳатмист. Дуюм, модели интихоби динамикӣ, пешниҳод мекунад, ки транскриптазаҳои баръакс қолибҳоро тағир медиҳанд, вақте ки функсияи RNAse ва функсияи полимераз аз ҷиҳати суръат ҳамоҳанг нестанд, ин маънои онро дорад, ки рекомбинатсия ба таври тасодуфӣ рух медиҳад ва дар ҷавоб ба осеби геномӣ нест. Тадқиқот аз ҷониби Раусон ва дигарон. ҳарду модели рекомбинатсияро дастгирӣ карданд. [27] Дар ҳар як давраи такрорӣ аз 5 то 14 ҳодисаи рекомбинатсия дар як геном рух медиҳанд. [28] Гузариши шаблон (рекомбинатсия) барои нигоҳ доштани якпорчагии геном ва ҳамчун механизми таъмир барои наҷот додани геномҳои вайроншуда зарур аст. [29] [27]

Доруҳои зидди вирусӣ Таҳрир

Азбаски ВНМО транскриптазаи баръаксро барои нусхабардории маводи генетикии худ ва тавлиди вирусҳои нав (қисми гардиши паҳншавии ретровирус) истифода мебарад, доруҳои мушаххас барои халалдор кардани раванд ва ба ин васила афзоиши он тарҳрезӣ шудаанд. Дар маҷмӯъ, ин доруҳо ҳамчун ингибиторҳои баръакси транскриптаза маълуманд ва аналогҳои нуклеозидҳо ва нуклеотидҳо зидовудин (номи тиҷоратии Ретровир), ламивудин (Эпивир) ва тенофовир (Viread), инчунин ингибиторҳои ғайринуклеозид, ба монанди невирапин (Viramune) мебошанд.

Таҳрири биологияи молекулавӣ

Транскриптазаи баръакс одатан дар тадқиқот барои татбиқи техникаи реаксияи занҷири полимераз ба РНК бо усуле истифода мешавад, ки реаксияи занҷири полимеразии транскриптӣ (RT-PCR) номида мешавад. Техникаи классикии ПТР метавонад танҳо ба риштаҳои ДНК татбиқ карда шавад, аммо бо ёрии транскриптазаи баръакс, РНК-ро ба ДНК транскрипт кардан мумкин аст ва ҳамин тавр таҳлили ПТР-и молекулаҳои РНК имконпазир мегардад. Транскриптазаи баръакс инчунин барои сохтани китобхонаҳои cDNA аз mRNA истифода мешавад. Мавҷудияти тиҷоратии транскриптазаи баръакс донишро дар соҳаи биологияи молекулавӣ хеле беҳтар кард, зеро дар баробари дигар ферментҳо ба олимон имкон дод, ки РНК-ро клон, пайдарпай ва тавсиф кунанд.

Транскриптазаи баръакс низ дар истеҳсоли инсулин истифода шудааст. Бо ворид кардани mRNA эукариотӣ барои истеҳсоли инсулин дар якҷоягӣ бо транскриптазаи баръакс ба бактерияҳо, mRNA-ро метавон ба геноми прокариот ворид кард. Пас аз он миқдори зиёди инсулинро эҷод кардан мумкин аст, ки аз зарурати ҷамъоварии гадуди хук ва дигар манбаъҳои анъанавӣ канорагирӣ мекунад. Ба таври мустақим ворид кардани ДНК-и эукариотӣ ба бактерияҳо кор намекунад, зеро он интронҳо дорад, бинобар ин бо истифода аз рибосомаҳои бактериявӣ бомуваффақият тарҷума карда намешавад. Коркард дар ҳуҷайраи эукариотӣ ҳангоми истеҳсоли mRNA ин интронҳоро хориҷ мекунад, то қолаби мувофиқро таъмин кунад. Транскриптазаи баръакс ин РНК-и таҳриршударо дубора ба ДНК табдил медиҳад, то он метавонад ба геном дохил карда шавад.


Транскрипсияи баръакси миқёси калон? - Биология

Фаъолияти устувори каталитикӣ (ҳатто дар ҳарорати баланд) ва дақиқии баланд ва наздикии шаблон ба праймер хосиятҳои матлуби транскриптаза (RT) дар аксари барномаҳои биотехнологӣ мебошанд.

RT-ҳои тарроҳии вируси лейкемияи мурӣ ферментҳои маъмултарин истифода мешаванд, гарчанде ки ферментҳои ретровирусҳои дигар (вируси миелобластоз ё ВИЧ-1) ва RT-ҳои бактериявии гурӯҳи II интрон низ дар аксари барномаҳо самараноканд.

Технологияҳои наве, ки транскрипсияи баръаксро истифода мебаранд ва дар таҳқиқот ва технологияи илмҳои ҳаёт ваъда медиҳанд, пайдарпайии РНК (RNA-seq) (таҳлили транскриптомӣ), эпитранскриптомия ва биологияи синтетикӣ ва таҳрири геномҳо (тавассути истифодаи муҳаррирони асосӣ) мебошанд.

Транскриптазаҳои баръакс (RTs) ферментҳое мебошанд, ки метавонанд аз РНК як қатори иловагии ДНК (cDNA) тавлид кунанд. Дар якҷоягӣ бо PCR, RTs барои муайян кардани РНК ва клон кардани генҳои ифодашуда васеъ истифода мешуданд. RT-ҳои ретровирусии классикӣ тавассути муҳандисии протеин такмил дода шудаанд. Ин ферментҳо ва RT-ҳои нав тавсифшуда унсурҳои калидӣ дар таҳияи усулҳои пайдарпайии насли оянда мебошанд, ки ҳоло барои омӯзиши транскриптомика истифода мешаванд. Илова бар ин, RT-ҳои муҳандисие, ки бо никазаи CRISPR/Cas9 муттаҳид шудаанд, ба наздикӣ потенсиали бузургро ҳамчун абзор барои коркарди геномҳои эукариотӣ нишон доданд. Дар ин барраси, мо хосиятҳо ва истифодаи RT-ҳои ваҳшӣ ва муҳандисиро дар барномаҳои биотехнологӣ, аз RT-PCR анъанавӣ то таҳрири ибтидоии ба наздикӣ ҷорӣшуда муҳокима мекунем.


Мундариҷа

Омодасозии китобхона Таҳрир

Қадамҳои умумӣ барои омода кардани китобхонаи иловагии ДНК (cDNA) барои пайдарпай дар зер тавсиф шудаанд, аммо аксар вақт дар байни платформаҳо фарқ мекунанд. [8] [3] [9]

  1. Изолятсияи РНК:РНК аз бофта ҷудо карда мешавад ва бо дезоксирибонуклеаза (DNase) омехта мешавад. DNase миқдори ДНК-и геномиро коҳиш медиҳад. Миқдори таназзули РНК бо гел ва электрофорези капиллярӣ тафтиш карда мешавад ва барои таъин кардани рақами якпорчагии РНК ба намуна истифода мешавад. Ин сифати РНК ва ҳаҷми умумии РНК-и оғозёбӣ ҳангоми омодасозии минбаъдаи китобхона, пайдарпайӣ ва таҳлили марҳилаҳо ба назар гирифта мешаванд.
  1. Интихоби РНК: Барои таҳлили сигналҳои мавриди таваҷҷӯҳ, РНК-и ҷудошударо метавон тавре нигоҳ дошт, ки барои РНК бо думҳои 3' полиаденилонидашуда (поли(А)) филтр карда, танҳо мРНК, аз РНК рибосомӣ (rRNA) тамомшуда ва/ё барои РНК филтр карда мешавад, ки пайдарпаии мушаххасро мепайвандад (Усулҳои интихоб ва камшавии РНК ҷадвал, дар поён). РНК бо думҳои 3' поли(А) асосан аз пайдарпаии баркамол, коркардшуда ва рамзгузорӣ иборат аст. Интихоби поли(А) тавассути омезиши РНК бо олигомерҳои поли(Т) ба таври ковалентӣ ба субстрат, маъмулан маҳтобҳои магнитӣ пайваст карда мешавад. [10][11] Интихоби Poly(A) дар муайянкунии биотипи РНК маҳдудиятҳои муҳим дорад. Бисёре аз биотипҳои РНК полиаденил карда нашудаанд, аз ҷумла бисёр РНК-и коднашаванда ва транскриптҳои сафедаи гистон-аслӣ, ё тавассути дарозии думҳои поли(А) онҳо танзим карда мешаванд (масалан, ситокинҳо) ва аз ин рӯ пас аз интихоби поли(А) ошкор карда намешаванд. [12] Ғайр аз он, интихоби поли(А) метавонад 3' ғаразро зиёд кунад, алахусус бо РНК-и пастсифат. [13][14] Ин маҳдудиятҳоро бо камшавии рибосомаҳо пешгирӣ кардан мумкин аст ва rRNA-ро нест мекунад, ки маъмулан зиёда аз 90% РНК-ро дар ҳуҷайра ташкил медиҳад. Ҳам қадамҳои ғанисозии поли(А) ва ҳам камшавии рибосомаҳо меҳнатталабанд ва метавонанд ғаразҳоро ба вуҷуд оранд, аз ин рӯ равишҳои соддатаре таҳия шудаанд, ки ин қадамҳоро сарфи назар мекунанд. [15] Ҳадафҳои хурди РНК, ба монанди miRNA, метавонанд минбаъд тавассути интихоби андоза бо гелҳои истисноӣ, маҳтобҳои магнитӣ ё маҷмӯаҳои тиҷоратӣ ҷудо карда шаванд.
  1. Синтези cDNA: РНК ба cDNA баръакс транскрипт карда мешавад, зеро ДНК устувортар аст ва барои амплификация (ки полимеразҳои ДНК-ро истифода мебарад) имкон медиҳад ва технологияи пайдарпайии ДНК-и баркамолро истифода барад. Амплификация пас аз транскрипсияи баръакс боиси гум шудани ришта мегардад, ки онро бо тамғагузории кимиёвӣ ё пайдарпаии як молекула пешгирӣ кардан мумкин аст. Интихоби фрагментатсия ва андоза барои тоза кардани пайдарпайҳо, ки дарозии мувофиқ барои мошини пайдарпайӣ мебошанд, анҷом дода мешавад. РНК, cDNA ё ҳардуи онҳо бо ферментҳо, sonication ё nebulizers тақсим карда мешаванд. Фрагментатсияи РНК 5' ғарази транскрипсияи ба таври тасодуфӣ асосёфтаи баръакс ва таъсири маконҳои пайвастшавии праймерро коҳиш медиҳад [11], [11] бо манфии он, ки нӯги 5' ва 3' ба ДНК камтар самараноктар табдил меёбад. Пас аз фрагментатсия интихоби андоза сурат мегирад, ки дар он ё пайдарпаии хурд хориҷ карда мешаванд ё доираи қатъии дарозии пайдарпай интихоб карда мешаванд. Азбаски РНКҳои хурд ба монанди miRNAs гум мешаванд, онҳо мустақилона таҳлил карда мешаванд. cDNA барои ҳар як озмоиш метавонад бо штрих-коди гексамер ё октамер индексатсия карда шавад, то ин таҷрибаҳо метавонанд дар як хатти ягона барои пайдарпайии мултиплексӣ муттаҳид карда шаванд.

Пайдарпаии ДНК-и иловагӣ (cDNA-Seq) Таҳрири

Пас аз он китобхонаи cDNA, ки аз биотипҳои РНК гирифта шудааст, ба формати барои компютер хондашаванда пайдарпай карда мешавад. Технологияҳои зиёди пайдарпайии баландсуръат барои пайдарпайии cDNA мавҷуданд, аз ҷумла платформаҳое, ки аз ҷониби Illumina, Thermo Fisher, BGI/MGI, PacBio ва Oxford Nanopore Technologies таҳия шудаанд. [16] Барои пайдарпаии кӯтоҳмуддати Illumina, як технологияи маъмул барои пайдарпайии cDNA, адаптерҳо ба cDNA пайваст карда мешаванд, ДНК ба ҳуҷайраи ҷараён пайваст карда мешаванд, кластерҳо тавассути давраҳои амплификация ва денатуризатсияи пул тавлид мешаванд ва пайдарпаӣ аз рӯи синтез аст. дар давраҳои синтези риштаҳои комплементарӣ ва ангезиши лазерии асосҳо бо терминаторҳои баръакс иҷро карда мешаванд. Интихоби пайдарпайии платформа ва параметрҳо бо тарҳрезии таҷрибавӣ ва арзиши роҳнамоӣ карда мешаванд. Мулоҳизаҳои маъмулии тарроҳии таҷрибавӣ аз қабули қарор дар бораи дарозии пайдарпай, умқи пайдарпай, истифодаи пайдарпаии ягона ва ҷуфт-охири, шумораи такрорҳо, мултиплекс, тасодуфӣ ва хӯшаҳоро дар бар мегиранд. [17]

РНК хурд/пайдабандии РНК-и ғайри рамзгузорӣ Таҳрири

Ҳангоми пайдарпайии РНК ғайр аз mRNA, омодасозии китобхона тағир дода мешавад. РНК-и ҳуҷайра дар асоси диапазони андозаи дилхоҳ интихоб карда мешавад. Барои ҳадафҳои хурди РНК, ба монанди miRNA, РНК тавассути интихоби андоза ҷудо карда мешавад. Инро метавон бо гели истиснои андоза, тавассути интихоби андозаи маҳтобҳои магнитӣ ё бо маҷмӯаи аз ҷиҳати тиҷорат таҳияшуда анҷом дод. Пас аз ҷудошавӣ, пайвандҳо ба охири 3' ва 5' илова карда мешаванд ва сипас тоза карда мешаванд. Қадами ниҳоӣ тавлиди cDNA тавассути транскрипсияи баръакс мебошад.

Таҳрири пайдарпайии мустақими РНК

Азбаски табдил додани РНК ба cDNA, ligation, amplification ва дигар коркардҳои намунавӣ нишон дода шудааст, ки ғаразҳо ва артефактҳоро ҷорӣ мекунанд, ки метавонанд ба тавсифи дуруст ва миқдори транскриптҳо халал расонанд, [18] пайдарпайии мустақими РНК-и як молекула аз ҷониби ширкатҳо, аз ҷумла Helicos омӯхта шудааст. (муфлис), Oxford Nanopore Technologies, [19] ва дигарон. Ин технология молекулаҳои РНК-ро мустақиман ба таври оммавӣ параллел пайдарпай мекунад.

Якмолекула дар вақти воқеӣ пайдарпайии РНК Таҳрир

RNA-Seq як молекулаи ба таври оммавӣ параллелӣ ҳамчун алтернатива ба RNA-Seq анъанавӣ омӯхта шудааст, ки дар он табдилдиҳии РНК-ба cDNA, пайвастшавӣ, амплификация ва дигар марҳилаҳои коркарди намуна метавонад ғаразҳо ва артефактҳоро ба вуҷуд оранд. [20] Платформаҳои технологӣ, ки як молекулаи RNA-Seq-ро дар вақти воқеӣ иҷро мекунанд, иборатанд аз Oxford Nanopore Technologies (ONT) секвенсияи Nanopore, [19] PacBio IsoSeq ва Helicos (муфлис). Пайдарпайкунии РНК дар шакли модарии худ тағиротро ба монанди метилизатсия нигоҳ медорад ва имкон медиҳад, ки онҳо мустақиман ва ҳамзамон тафтиш карда шаванд. [19] Бартарии дигари якмолекулаи RNA-Seq дар он аст, ки транскриптҳо метавонанд бо дарозии пурра фаро гирифта шаванд, ки имкон медиҳад, ки дар муқоиса бо пайдарпайии кӯтоҳмуддат барои муайян кардани изоформ ва миқдорӣ эътимоди бештар дошта бошад. Одатан, усулҳои якмолекулаи RNA-Seq дар муқоиса бо пайдарпаии кӯтоҳмуддати хондан сатҳи хатогиҳои баландтар доранд, аммо усулҳои навтар ба монанди ONT хатогиҳои мустақими RNA-Seq-ро тавассути канорагирӣ аз фрагментатсия ва табдили cDNA маҳдуд мекунанд. Истифодаи охирини ONT мустақими RNA-Seq барои ифодаи дифференсиалӣ дар популяцияҳои ҳуҷайраҳои инсон нишон дод, ки ин технология метавонад маҳдудиятҳои зиёди пайдарпайии cDNA-и кӯтоҳ ва дарозро бартараф кунад. [21]

Пайдарпаии РНК-и якҳуҷайра (scRNA-Seq) Таҳрири

Усулҳои стандартӣ ба монанди микроаррейҳо ва таҳлили стандартии RNA-Seq ифодаи РНК-ро аз шумораи зиёди ҳуҷайраҳо таҳлил мекунанд. Дар популяцияҳои ҳуҷайраҳои омехта, ин андозагирӣ метавонанд фарқиятҳои муҳими байни ҳуҷайраҳои инфиродӣ дар дохили ин популятсияҳоро пинҳон кунанд. [22] [23]

Пайдарпаии РНК-и якҳуҷайра (scRNA-Seq) профилҳои ифодаи ҳуҷайраҳои алоҳидаро таъмин мекунад. Гарчанде, ки маълумоти пурра дар бораи ҳар як РНК-и аз ҷониби ҳар як ҳуҷайра ифодашуда имконнопазир аст, аз сабаби миқдори ками мавод, намунаҳои ифодаи генҳоро тавассути таҳлили кластеркунии генҳо муайян кардан мумкин аст. Ин метавонад мавҷудияти намудҳои нодири ҳуҷайраҳоро дар дохили популятсияи ҳуҷайра, ки қаблан дида нашудаанд, ошкор кунад. Масалан, ҳуҷайраҳои махсусгардонидашудаи шуш, ки ионоцитҳои шуш номида мешаванд, дар соли 2018 аз ҷониби ду гурӯҳе, ки scRNA-Seq дар эпителияи роҳи нафасро иҷро мекунанд, муайян карда шуданд. [24] [25]

Тартиби таҷрибавӣ Таҳрир

Протоколҳои кунунии scRNA-Seq қадамҳои зеринро дар бар мегиранд: ҷудокунии як ҳуҷайра ва РНК, транскрипсияи баръакс (RT), амплификация, тавлиди китобхона ва пайдарпаӣ. Ҳуҷайраҳои ягона ё ба таври механикӣ ба микроэлементҳо ҷудо карда мешаванд (масалан, BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform, ё CellMicrosystems CellRaft) ё дар қатрачаҳо капсула карда мешаванд (масалан, 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQio, NaD1D1 DollioB). [26] Ҳуҷайраҳои якхела бо илова кардани маҳтобӣ бо олигонуклеотидҳои штрих-код нишон дода мешаванд, ҳам ҳуҷайраҳо ва ҳам маҳтобҳо ба миқдори маҳдуд таъмин карда мешаванд, ки ҳамбастагӣ бо ҳуҷайраҳои сершумор ва маҳтобӣ як ҳодисаи хеле нодир аст. Пас аз ба итмом расидани транскрипсияи баръакс, cDNA-ҳои бисёр ҳуҷайраҳоро бо ҳам омехта кардан мумкин аст, то транскриптҳои як ҳуҷайраи мушаххас бо штрих-коди беназири ҳар як ҳуҷайра муайян карда шаванд. [27] [28] Идентификатори беназири молекулавӣ (UMIs) метавонад ба пайдарпаии ҳадафҳои mRNA/cDNA замима карда шавад, то дар вақти омодасозии китобхона муайян кардани артефактҳо кӯмак расонад. [29]

Мушкилот барои scRNA-Seq аз нигоҳ доштани фаровонии нисбии ибтидоии mRNA дар ҳуҷайра ва муайян кардани транскриптҳои нодир иборат аст. [30] Қадами транскрипсияи баръакс муҳим аст, зеро самаранокии реаксияи RT муайян мекунад, ки чӣ қадар шумораи аҳолии РНК ҳуҷайра дар ниҳоят аз ҷониби секвенсер таҳлил карда мешавад. Раванди транскриптазаҳои баръакс ва стратегияҳои ибтидоии истифодашуда метавонанд ба истеҳсоли пурраи cDNA ва тавлиди китобхонаҳое, ки ба охири 3' ё 5' генҳо нигаронида шудаанд, таъсир расонанд.

Дар марҳилаи амплификация, ё PCR ё транскрипсияи in vitro (IVT) айни замон барои тақвият додани cDNA истифода мешавад. Яке аз бартариҳои усулҳои ба ПТР асосёфта қобилияти тавлиди cDNA-и пурраи дарозӣ мебошад. Бо вуҷуди ин, самаранокии гуногуни PCR дар пайдарпаии мушаххас (масалан, мундариҷаи GC ва сохтори snapback) метавонад ба таври экспоненсиалӣ афзоиш ёбад, ки китобхонаҳоро бо фарогирии нобаробар тавлид кунад. Аз тарафи дигар, дар ҳоле ки китобхонаҳои аз ҷониби IVT тавлидшуда метавонанд аз ғарази пайдарпайии аз ҷониби ПТР ба вуҷуд омада худдорӣ кунанд, пайдарпаии мушаххас метавонанд бесамар транскрипт карда шаванд ва ба ин васила боиси тарки пайдарпай ё тавлиди пайдарпайии нопурра гардад. [31] [22] Якчанд протоколҳои scRNA-Seq нашр шудаанд: Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] Quartz -seq [37] ва C1-CAGE. [38] Ин протоколҳо аз рӯи стратегияҳои транскрипсияи баръакс, синтези cDNA ва амплификация ва имкони ҷойгир кардани штрих-кодҳои пайдарпай (яъне UMI) ё қобилияти коркарди намунаҳои ҷамъшуда фарқ мекунанд. [39]

Дар соли 2017, ду равиш барои ҳамзамон чен кардани mRNA-и якҳуҷайра ва ифодаи сафеда тавассути антителоҳои олигонуклеотидҳо бо номи REAP-seq, [40] ва CITE-seq ҷорӣ карда шуданд. [41]

Таҳрири барномаҳо

scRNA-Seq дар саросари фанҳои биологӣ, аз ҷумла рушд, неврология, [42] онкология, [43] [44] [45] бемории аутоиммунӣ, [46] ва бемориҳои сироятӣ васеъ истифода мешавад. [47]

scRNA-Seq дар бораи рушди ҷанин ва организмҳо, аз ҷумла кирмҳо фаҳмиши васеъ фароҳам овард. Caenorhabditis elegans, [48] ва regenerative planarian Schmidtea mediterraea. [49] [50] Аввалин ҳайвоноти сутунмӯҳрае, ки бо ин роҳ ба харита гирифта шуда буданд, зебраҳиҳо буданд [51] [52] ва Xenopus laevis. [53] Дар ҳар як ҳолат марҳилаҳои сершумори ҷанин омӯхта шуданд, ки имкон медиҳад тамоми раванди рушд дар асоси ҳуҷайра ба ҳуҷайра харита карда шавад. [8] Илм ин пешрафтҳоро ҳамчун пешрафт дар соли 2018 эътироф кард. [54]

Мулоҳизаҳои таҷрибавӣ Таҳрир

Ҳангоми тарҳрезӣ ва гузаронидани таҷрибаҳои RNA-Seq параметрҳои гуногун ба назар гирифта мешаванд:

  • Хусусияти матоъ: Ифодаи ген дар дохили бофтаҳо ва байни бофтаҳо фарқ мекунад ва RNA-Seq ин омехтаи намудҳои ҳуҷайраҳоро чен мекунад. Ин метавонад ҷудо кардани механизми биологии таваҷҷӯҳро душвор гардонад. Пайдарпайвандии як ҳуҷайра метавонад барои омӯзиши ҳар як ҳуҷайра ба таври инфиродӣ истифода шавад, ки ин масъаларо сабук мекунад.
  • Вобастагии вақт: Ифодаи ген бо мурури замон тағир меёбад ва RNA-Seq танҳо як аксро мегирад. Барои мушоҳида кардани тағирот дар транскриптом таҷрибаҳои курси вақт гузаронида мешаванд.
  • Фарогирӣ (инчунин ҳамчун амиқ маълум аст): РНК ҳамон мутатсияҳои дар ДНК мушоҳидашударо дарбар мегирад ва ошкоркунӣ фарогирии амиқтарро талаб мекунад. Бо фарогирии кофӣ, RNA-Seq метавонад барои арзёбии ифодаи ҳар як аллел истифода шавад. Ин метавонад фаҳмишро дар бораи падидаҳо, аз қабили таъсири импринтинг ё cis-танзим таъмин кунад. Амиқии пайдарпайии барои барномаҳои мушаххас заруриро аз таҷрибаи озмоишӣ экстраполятсия кардан мумкин аст. [55]
  • Артефактҳои тавлиди маълумот (инчунин ҳамчун ихтилофи техникӣ маълум аст): Реагентҳо (масалан, маҷмӯаи омодасозии китобхона), кормандони ҷалбшуда ва навъи секвенсер (масалан, Illumina, Pacific Biosciences) метавонанд ба артефактҳои техникӣ оварда расонанд, ки метавонанд ҳамчун натиҷаҳои пурмазмун нодуруст шарҳ дода шаванд. Мисли ҳама гуна таҷрибаи илмӣ, гузаронидани RNA-Seq дар муҳити хуб назоратшаванда оқилона аст. If this is not possible or the study is a meta-analysis, another solution is to detect technical artifacts by inferring latent variables (typically principal component analysis or factor analysis) and subsequently correcting for these variables. [56]
  • Data management: A single RNA-Seq experiment in humans is usually 1-5 Gb (compressed), or more when including intermediate files. [57] This large volume of data can pose storage issues. One solution is compressing the data using multi-purpose computational schemas (e.g., gzip) or genomics-specific schemas. The latter can be based on reference sequences or de novo. Another solution is to perform microarray experiments, which may be sufficient for hypothesis-driven work or replication studies (as opposed to exploratory research).

Transcriptome assembly Edit

Two methods are used to assign raw sequence reads to genomic features (i.e., assemble the transcriptome):

  • De novo: This approach does not require a reference genome to reconstruct the transcriptome, and is typically used if the genome is unknown, incomplete, or substantially altered compared to the reference. [58] Challenges when using short reads for de novo assembly include 1) determining which reads should be joined together into contiguous sequences (contigs), 2) robustness to sequencing errors and other artifacts, and 3) computational efficiency. The primary algorithm used for de novo assembly transitioned from overlap graphs, which identify all pair-wise overlaps between reads, to de Bruijn graphs, which break reads into sequences of length k and collapse all k-mers into a hash table. [59] Overlap graphs were used with Sanger sequencing, but do not scale well to the millions of reads generated with RNA-Seq. Examples of assemblers that use de Bruijn graphs are Trinity, [58] Oases [60] (derived from the genome assembler Velvet[61] ), Bridger, [62] and rnaSPAdes. [63] Paired-end and long-read sequencing of the same sample can mitigate the deficits in short read sequencing by serving as a template or skeleton. Metrics to assess the quality of a de novo assembly include median contig length, number of contigs and N50. [64]
  • Genome guided: This approach relies on the same methods used for DNA alignment, with the additional complexity of aligning reads that cover non-continuous portions of the reference genome. [65] These non-continuous reads are the result of sequencing spliced transcripts (see figure). Typically, alignment algorithms have two steps: 1) align short portions of the read (i.e., seed the genome), and 2) use dynamic programming to find an optimal alignment, sometimes in combination with known annotations. Software tools that use genome-guided alignment include Bowtie, [66] TopHat (which builds on BowTie results to align splice junctions), [67][68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] and GMAP. [71] The output of genome guided alignment (mapping) tools can be further utilized by tools such as Cufflinks [68] or StringTie [72] to reconstruct contiguous transcript sequences (яъне, a FASTA file).The quality of a genome guided assembly can be measured with both 1) de novo assembly metrics (e.g., N50) and 2) comparisons to known transcript, splice junction, genome, and protein sequences using precision, recall, or their combination (e.g., F1 score). [64] In addition, дар силико assessment could be performed using simulated reads. [73][74]

A note on assembly quality: The current consensus is that 1) assembly quality can vary depending on which metric is used, 2) assembly tools that scored well in one species do not necessarily perform well in the other species, and 3) combining different approaches might be the most reliable. [75] [76] [77]

Gene expression quantification Edit

Expression is quantified to study cellular changes in response to external stimuli, differences between healthy and diseased states, and other research questions. Transcript levels are often used as a proxy for protein abundance, but these are often not equivalent due to post transcriptional events such as RNA interference and nonsense-mediated decay. [78]

Expression is quantified by counting the number of reads that mapped to each locus in the transcriptome assembly step. Expression can be quantified for exons or genes using contigs or reference transcript annotations. [8] These observed RNA-Seq read counts have been robustly validated against older technologies, including expression microarrays and qPCR. [55] [79] Tools that quantify counts are HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] and Cuffquant. These tools determine read counts from aligned RNA-Seq data, but alignment-free counts can also be obtained with Sailfish [85] and Kallisto. [86] The read counts are then converted into appropriate metrics for hypothesis testing, regressions, and other analyses. Parameters for this conversion are:

  • Sequencing depth/coverage: Although depth is pre-specified when conducting multiple RNA-Seq experiments, it will still vary widely between experiments. [87] Therefore, the total number of reads generated in a single experiment is typically normalized by converting counts to fragments, reads, or counts per million mapped reads (FPM, RPM, or CPM). The difference between RPM and FPM was historically derived during the evolution from single-end sequencing of fragments to paired-end sequencing. In single-end sequencing, there is only one read per fragment (яъне, RPM = FPM). In paired-end sequencing, there are two reads per fragment (яъне, RPM = 2 x FPM). Sequencing depth is sometimes referred to as library size, the number of intermediary cDNA molecules in the experiment.
  • Gene length: Longer genes will have more fragments/reads/counts than shorter genes if transcript expression is the same. This is adjusted by dividing the FPM by the length of a feature (which can be a gene, transcript, or exon), resulting in the metric fragments per kilobase of feature per million mapped reads (FPKM). [88] When looking at groups of features across samples, FPKM is converted to transcripts per million (TPM) by dividing each FPKM by the sum of FPKMs within a sample. [89][90][91]
  • Total sample RNA output: Because the same amount of RNA is extracted from each sample, samples with more total RNA will have less RNA per gene. These genes appear to have decreased expression, resulting in false positives in downstream analyses. [87] Normalization strategies including quantile, DESeq2, TMM and Median Ratio attempt to account for this difference by comparing a set of non-differentially expressed genes between samples and scaling accordingly. [92]
  • Variance for each gene's expression: is modeled to account for sampling error (important for genes with low read counts), increase power, and decrease false positives. Variance can be estimated as a normal, Poisson, or negative binomial distribution [93][94][95] and is frequently decomposed into technical and biological variance.

Spike-ins for absolute quantification and detection of genome-wide effects Edit

RNA spike-ins are samples of RNA at known concentrations that can be used as gold standards in experimental design and during downstream analyses for absolute quantification and detection of genome-wide effects.

  • Absolute quantification: Absolute quantification of gene expression is not possible with most RNA-Seq experiments, which quantify expression relative to all transcripts. It is possible by performing RNA-Seq with spike-ins, samples of RNA at known concentrations. After sequencing, read counts of spike-in sequences are used to determine the relationship between each gene's read counts and absolute quantities of biological fragments [11][96] In one example, this technique was used in Xenopus tropicalis embryos to determine transcription kinetics. [97]
  • Detection of genome-wide effects: Changes in global regulators including chromatin remodelers, transcription factors (e.g., MYC), acetyltransferase complexes, and nucleosome positioning are not congruent with normalization assumptions and spike-in controls can offer precise interpretation. [98][99]

Differential expression Edit

The simplest but often most powerful use of RNA-Seq is finding differences in gene expression between two or more conditions (масалан, treated vs not treated) this process is called differential expression. The outputs are frequently referred to as differentially expressed genes (DEGs) and these genes can either be up- or down-regulated (яъне, higher or lower in the condition of interest). There are many tools that perform differential expression. Most are run in R, Python, or the Unix command line. Commonly used tools include DESeq, [94] edgeR, [95] and voom+limma, [93] [100] all of which are available through R/Bioconductor. [101] [102] These are the common considerations when performing differential expression:

  • Inputs: Differential expression inputs include (1) an RNA-Seq expression matrix (M genes x N samples) and (2) a design matrix containing experimental conditions for N samples. The simplest design matrix contains one column, corresponding to labels for the condition being tested. Other covariates (also referred to as factors, features, labels, or parameters) can include batch effects, known artifacts, and any metadata that might confound or mediate gene expression. In addition to known covariates, unknown covariates can also be estimated through unsupervised machine learning approaches including principal component, surrogate variable, [103] and PEER [56] analyses. Hidden variable analyses are often employed for human tissue RNA-Seq data, which typically have additional artifacts not captured in the metadata (масалан, ischemic time, sourcing from multiple institutions, underlying clinical traits, collecting data across many years with many personnel).
  • Усулҳо: Most tools use regression or non-parametric statistics to identify differentially expressed genes, and are either based on read counts mapped to a reference genome (DESeq2, limma, edgeR) or based on read counts derived from alignment-free quantification (sleuth, [104] Cuffdiff, [105] Ballgown [106] ). [107] Following regression, most tools employ either familywise error rate (FWER) or false discovery rate (FDR) p-value adjustments to account for multiple hypotheses (in human studies,

20,000 protein-coding genes or

Downstream analyses for a list of differentially expressed genes come in two flavors, validating observations and making biological inferences. Owing to the pitfalls of differential expression and RNA-Seq, important observations are replicated with (1) an orthogonal method in the same samples (like real-time PCR) or (2) another, sometimes pre-registered, experiment in a new cohort. The latter helps ensure generalizability and can typically be followed up with a meta-analysis of all the pooled cohorts. The most common method for obtaining higher-level biological understanding of the results is gene set enrichment analysis, although sometimes candidate gene approaches are employed. Gene set enrichment determines if the overlap between two gene sets is statistically significant, in this case the overlap between differentially expressed genes and gene sets from known pathways/databases (масалан, Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) or from complementary analyses in the same data (like co-expression networks). Common tools for gene set enrichment include web interfaces (масалан, ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [114] and software packages. When evaluating enrichment results, one heuristic is to first look for enrichment of known biology as a sanity check and then expand the scope to look for novel biology.

Alternative splicing Edit

RNA splicing is integral to eukaryotes and contributes significantly to protein regulation and diversity, occurring in >90% of human genes. [115] There are multiple alternative splicing modes: exon skipping (most common splicing mode in humans and higher eukaryotes), mutually exclusive exons, alternative donor or acceptor sites, intron retention (most common splicing mode in plants, fungi, and protozoa), alternative transcription start site (promoter), and alternative polyadenylation. [115] One goal of RNA-Seq is to identify alternative splicing events and test if they differ between conditions. Long-read sequencing captures the full transcript and thus minimizes many of issues in estimating isoform abundance, like ambiguous read mapping. For short-read RNA-Seq, there are multiple methods to detect alternative splicing that can be classified into three main groups: [116] [89] [117]

  • Count-based (also event-based, differential splicing): estimate exon retention. Examples are DEXSeq, [118] MATS, [119] and SeqGSEA. [120]
  • Isoform-based (also multi-read modules, differential isoform expression): estimate isoform abundance first, and then relative abundance between conditions. Examples are Cufflinks 2 [121] and DiffSplice. [122]
  • Intron excision based: calculate alternative splicing using split reads. Examples are MAJIQ [123] and Leafcutter. [117]

Differential gene expression tools can also be used for differential isoform expression if isoforms are quantified ahead of time with other tools like RSEM. [124]

Coexpression networks Edit

Coexpression networks are data-derived representations of genes behaving in a similar way across tissues and experimental conditions. [125] Their main purpose lies in hypothesis generation and guilt-by-association approaches for inferring functions of previously unknown genes. [125] RNA-Seq data has been used to infer genes involved in specific pathways based on Pearson correlation, both in plants [126] and mammals. [127] The main advantage of RNA-Seq data in this kind of analysis over the microarray platforms is the capability to cover the entire transcriptome, therefore allowing the possibility to unravel more complete representations of the gene regulatory networks. Differential regulation of the splice isoforms of the same gene can be detected and used to predict their biological functions. [128] [129] Weighted gene co-expression network analysis has been successfully used to identify co-expression modules and intramodular hub genes based on RNA seq data. Co-expression modules may correspond to cell types or pathways. Highly connected intramodular hubs can be interpreted as representatives of their respective module. An eigengene is a weighted sum of expression of all genes in a module. Eigengenes are useful biomarkers (features) for diagnosis and prognosis. [130] Variance-Stabilizing Transformation approaches for estimating correlation coefficients based on RNA seq data have been proposed. [126]

Variant discovery Edit

RNA-Seq captures DNA variation, including single nucleotide variants, small insertions/deletions. and structural variation. Variant calling in RNA-Seq is similar to DNA variant calling and often employs the same tools (including SAMtools mpileup [131] and GATK HaplotypeCaller [132] ) with adjustments to account for splicing. One unique dimension for RNA variants is allele-specific expression (ASE): the variants from only one haplotype might be preferentially expressed due to regulatory effects including imprinting and expression quantitative trait loci, and noncoding rare variants. [133] [134] Limitations of RNA variant identification include that it only reflects expressed regions (in humans, <5% of the genome), could be subject to biases introduced by data processing (e.g., de novo transcriptome assemblies underestimate heterozygosity [135] ), and has lower quality when compared to direct DNA sequencing.

RNA editing (post-transcriptional alterations) Edit

Having the matching genomic and transcriptomic sequences of an individual can help detect post-transcriptional edits (RNA editing). [3] A post-transcriptional modification event is identified if the gene's transcript has an allele/variant not observed in the genomic data.

Fusion gene detection Edit

Caused by different structural modifications in the genome, fusion genes have gained attention because of their relationship with cancer. [136] The ability of RNA-Seq to analyze a sample's whole transcriptome in an unbiased fashion makes it an attractive tool to find these kinds of common events in cancer. [4]

The idea follows from the process of aligning the short transcriptomic reads to a reference genome. Most of the short reads will fall within one complete exon, and a smaller but still large set would be expected to map to known exon-exon junctions. The remaining unmapped short reads would then be further analyzed to determine whether they match an exon-exon junction where the exons come from different genes. This would be evidence of a possible fusion event, however, because of the length of the reads, this could prove to be very noisy. An alternative approach is to use paired-end reads, when a potentially large number of paired reads would map each end to a different exon, giving better coverage of these events (see figure). Nonetheless, the end result consists of multiple and potentially novel combinations of genes providing an ideal starting point for further validation.

RNA-Seq was first developed in mid 2000s with the advent of next-generation sequencing technology. [139] The first manuscripts that used RNA-Seq even without using the term includes those of prostate cancer cell lines [140] (dated 2006), Medicago truncatula [141] (2006), maize [142] (2007), and Arabidopsis thaliana [143] (2007), while the term "RNA-Seq" itself was first mentioned in 2008 [144] The number of manuscripts referring to RNA-Seq in the title or abstract (Figure, blue line) is continuously increasing with 6754 manuscripts published in 2018. The intersection of RNA-Seq and medicine (Figure, gold line) has similar celerity. [145]

Applications to medicine Edit

RNA-Seq has the potential to identify new disease biology, profile biomarkers for clinical indications, infer druggable pathways, and make genetic diagnoses. These results could be further personalized for subgroups or even individual patients, potentially highlighting more effective prevention, diagnostics, and therapy. The feasibility of this approach is in part dictated by costs in money and time a related limitation is the required team of specialists (bioinformaticians, physicians/clinicians, basic researchers, technicians) to fully interpret the huge amount of data generated by this analysis. [146]

Large-scale sequencing efforts Edit

A lot of emphasis has been given to RNA-Seq data after the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) and The Cancer Genome Atlas (TCGA) projects have used this approach to characterize dozens of cell lines [147] and thousands of primary tumor samples, [148] respectively. ENCODE aimed to identify genome-wide regulatory regions in different cohort of cell lines and transcriptomic data are paramount in order to understand the downstream effect of those epigenetic and genetic regulatory layers. TCGA, instead, aimed to collect and analyze thousands of patient's samples from 30 different tumor types in order to understand the underlying mechanisms of malignant transformation and progression. In this context RNA-Seq data provide a unique snapshot of the transcriptomic status of the disease and look at an unbiased population of transcripts that allows the identification of novel transcripts, fusion transcripts and non-coding RNAs that could be undetected with different technologies.

This article was submitted to WikiJournal of Science for external academic peer review in 2019 (reviewer reports). The updated content was reintegrated into the Wikipedia page under a CC-BY-SA-3.0 license ( 2021 ). The version of record as reviewed is: Felix Richter et al. (17 May 2021). "A broad introduction to RNA-Seq". WikiJournal of Science. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


Endogenous Reverse Transcriptase Could Allow mRNA Vaccines to Permanently Alter DNA

The Defender is experiencing censorship on many social channels. Be sure to stay in touch with the news that matters by subscribing to our top news of the day. It’s free.

Research on SARS-CoV-2 RNA by scientists at Harvard and MIT has implications for how mRNA vaccines could permanently alter genomic DNA, according to Doug Corrigan, Ph.D., a biochemist-molecular biologist who says more research is needed.

Over the past year, it would be all but impossible for Americans not to notice the media’s decision to make vaccines the dominant COVID narrative, rushing to do so even before any coronavirus-attributed deaths occurred.

The media’s slanted coverage has provided a particularly fruitful public relations boost for messenger RNA (mRNA) vaccines — decades in the making but never approved for human use — helping to usher the experimental technology closer to the regulatory finish line.

Under ordinary circumstances, the body makes (“transcribes”) mRNA from the DNA in a cell’s nucleus. The mRNA then travels out of the nucleus into the cytoplasm, where it provides instructions about which proteins to make.

By comparison, mRNA vaccines send their chemically synthesized mRNA payload (bundled with spike protein-manufacturing instructions) directly into the cytoplasm.

According to the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and most mRNA vaccine scientists, the buck then stops there — mRNA vaccines “do not affect or interact with our DNA in any way,” the CDC says. The CDC asserts first, that the mRNA cannot enter the cell’s nucleus (where DNA resides), and second, that the cell — Mission-Impossible-style — “gets rid of the mRNA soon after it is finished using the instructions.”

A December preprint about SARS-CoV-2, by scientists at Harvard and Massachusetts Institute of Technology (MIT), produced findings about wild coronavirus that raise questions about how viral RNA operates.

The scientists conducted the analysis because they were “puzzled by the fact that there is a respectable number of people who are testing positive for COVID-19 by PCR long after the infection was gone.”

Their key findings were as follows: SARS-CoV-2 RNAs “can be reverse transcribed in human cells,” “these DNA sequences can be integrated into the cell genome and subsequently be transcribed” (a phenomenon called “retro-integration”) — and there are viable cellular pathways to explain how this happens.

According to Ph.D. biochemist and molecular biologist Dr. Doug Corrigan, these important findings (which run contrary to “current biological dogma”) belong to the category of “Things We Were Absolutely and Unequivocally Certain Couldn’t Happen Which Actually Happened.”

The findings of the Harvard and MIT researchers also put the CDC’s assumptions about mRNA vaccines on shakier ground, according to Corrigan. In fact, a month before the Harvard-MIT preprint appeared, Corrigan had already written a blog outlining possible mechanisms and pathways whereby mRNA vaccines could produce the identical phenomenon.

In a second blog post, written after the preprint came out, Corrigan emphasized that the Harvard-MIT findings about coronavirus RNA have major implications for mRNA vaccines — a fact he describes as “the big elephant in the room.” While not claiming that vaccine RNA will necessarily behave in the same way as coronavirus RNA — that is, permanently altering genomic DNA — Corrigan believes that the possibility exists and deserves close scrutiny.

In Corrigan’s view, the preprint’s contribution is that it “validates that this is at least plausible, and most likely probable.”

Транскрипсияи баръакс

As the phrase “reverse transcription” implies, the DNA-to-mRNA pathway is not always a one-way street. Enzymes called reverse transcriptases can also convert RNA into DNA, allowing the latter to be integrated into the DNA in the cell nucleus.

Nor is reverse transcription uncommon. Geneticists report that “Over 40% of mammalian genomes comprise the products of reverse transcription.”

The preliminary evidence cited by the Harvard-MIT researchers indicates that endogenous reverse transcriptase enzymes may facilitate reverse transcription of coronavirus RNAs and trigger their integration into the human genome.

The authors suggest that while the clinical consequences require further study, detrimental effects are a distinct possibility and — depending on the integrated viral fragments’ “insertion sites in the human genome” and an individual’s underlying health status — could include “a more severe immune response … such as a ‘cytokine storm’ or auto-immune reactions.”

In 2012, a study suggested that viral genome integration could “lead to drastic consequences for the host cell, including gene disruption, insertional mutagenesis and cell death.”

Corrigan makes a point of saying that the pathways hypothesized to facilitate retro-integration of viral — or vaccine — RNA into DNA “are not unknown to people who understand molecular biology at a deeper level.”

Even so, the preprint’s discussion of reverse transcription and genome integration elicited a maelstrom of negative comments from readers unwilling to rethink biological dogma, some of whom even advocated for retraction (though preprints are, by definition, unpublished) on the grounds that “conspiracy theorists … will take this paper to ‘proof’ that mRNA vaccines can in fact alter your genetic code.”

More thoughtful readers agreed with Corrigan that the paper raises important questions. For example, one reader stated that confirmatory evidence is lacking “to show that the spike protein only is expressed for a short amount of time (say 1-3 days) after vaccination,” adding, “We think that this is the case, but there is no evidence for that.”

In fact, just how long the vaccines’ synthetic mRNA — and thus the instructions for cells to keep manufacturing spike protein — persist inside the cells is an open question.

Ordinarily, RNA is a “notoriously fragile” and unstable molecule. According to scientists, “this fragility is true of the mRNA of any living thing, whether it belongs to a plant, bacteria, virus or human.”

But the synthetic mRNA in the COVID vaccines is a different story. In fact, the step that ultimately allowed scientists and vaccine manufacturers to resolve their decades-long mRNA vaccine impasse was when they figured out how to chemically modify mRNA to increase its stability and longevity — in other words, produce RNA “that hangs around in the cell much longer than viral RNA, or even RNA that our cell normally produces for normal protein production.”

It is anyone’s guess what the synthetic mRNA is doing while it is “hanging around,” but Corrigan speculates that its enhanced longevity raises the probability of it “being converted over into DNA.”

Moreover, because the vaccine mRNA is also engineered to be more efficient at being translated into protein, “negative effects could be more frequent and more pronounced with the vaccine when compared to the natural virus.” ….


Натиҷаҳо

Experimental Design

To study the RT error and RDD rates at STRs, we designed the following experiment ( fig. 1). We isolated genomic DNA and total RNA from the same sample (orangutan testis of a single individual). The genomic DNA was sequenced using two different library preparation protocols—PCR-containing and PCR-free (see Materials and Methods section for details)—allowing us to test for genotype congruence between the two libraries (see “Genotyping STRs Using the DNA Sequencing Data” in Results). Total RNA was divided into two aliquots that were used to construct two separate RNA-seq libraries. Each of these two libraries was sequenced in two separate batches. Such an experiment, ideally, should allow one to differentiate between RDDs (such differences from the DNA sequence should be present in both RNA-seq libraries) and RT errors (such variants should be present in only one of the two RNA-seq libraries but in both sequencing batches). However, empirical data frequently have missing information at some loci due to limited sampling, which can distort results. For example, if a deviant STR variant is not sampled in one cDNA library, then an RT error can be incorrectly inferred instead of an RDD. For instance, if one-tenth of RNA molecules at a locus was modified from (A)6 to (A)7 due to RDD, then we should expect to observe (A)7 in both replicated cDNA libraries sequenced. However, if (A)7 was not sampled in one library, then we will observe (A)7 only in the other library, thereby misclassifying this situation as an RT error. Therefore, we developed a full likelihood method that permits sampling errors in the likelihood calculation to avoid error misclassifications.


CDNA cloning and library construction

One of the first applications of reverse transcriptase in molecular biology was the construction of cDNA libraries [2-4]. A cDNA library consists of cDNA clones that represent the transcribed sequences within a specific sample. Therefore, a library provides information about the temporal and spatial expression of genes for a given cell type, organ, or developmental stage, for example. The cDNA library clones are used in the characterization of novel RNA transcripts, determination of gene sequences, and expression of recombinant proteins.

Essential in constructing cDNA libraries is the proper representation of RNAs in their full length and/or their relative abundance, making the selection of a reverse transcriptase extremely important. Highly processive reverse transcriptases are capable of synthesizing long cDNAs as well as capturing low-abundance RNAs. Similarly, reverse transcritpases with increased thermostability are recommended for reverse-transcribing RNA with a high degree of secondary structure. (Маълумоти бештар дар бораи reverse transcriptase attributes) (White paper:Engineered reverse transcriptase)

After reverse transcription, a number of approaches may be used to insert cDNA into a vector for cloning. The double-stranded cDNAs after second-strand synthesis often have blunt ends and can be cloned into blunt-ended vectors (Figure 5A). Although this approach involves fewer steps, blunt-end cloning may result in less efficient ligation and loss of directionality after insertion. (Learn more about cloning workflow)

Alternatively, cDNA ends may be modified to include additional nucleotides of known sequences. For example, to modify the 5′ end of cDNA, oligo(dT) primers with additional 5′ nucleotides can be used to initiate reverse transcription to modify the 3′ end, short DNA oligos called linkers or adapters with desired sequences may be ligated (Figure 5B). In this manner, sites for directional insertion (e.g., restriction and homologous recombination), promoter binding (e.g., T3 and T7 sequences), and affinity purification (e.g., biotin and His tags) can be readily incorporated into the cDNA sequence. (Learn more about DNA library construction)

In another popular strategy, the 3′ ends of cDNA inserts and vectors are enzymatically extended with complementary homopolymeric tails. Using terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and a single dNTP, a string of 20–30 nucleotides can be added to an insert, and a similar string of complementary nucleotides added to a vector (e.g., Cs on the insert and Gs on the vector), enabling the vector and insert tails to anneal to each other (Figure 5C). Ligation is not required because the gaps are repaired inside the bacteria after transformation.

When the target sequence is known, the insert may be generated by RT-PCR for cloning of a specific region of a cDNA (Figure 5D). (Learn more about PCR cloning)

Learn more

Related products


ХУЛОСА

Real-time RT-PCR is extremely powerful and can generate reliable, reproducible, and biologically meaningful results. However, this brief review of some of the underlying problems should also have made it clear that great care must be taken in planning and analyzing real-time RT-PCR assays. We have barely touched on the problems of normalization and reference genes (previously known as housekeeping genes), and have not mentioned �solute” versus relative quantification or the need for standard curves and how they should be generated. Because the reporting of Cт values alone can conceal as much as it reports, we believe it is necessary to begin a concerted effort to introduce more standard analysis and reporting procedures, as has been done for microarray technology in the establishment of the MIAME guidelines (www.mged.org/miame). Certainly, in the absence of such standards for real-time RT-PCR, it falls to the editors of journals to ensure that papers that include this technology are appropriately reviewed, and that any conclusions are rigorously supported by the actual data.

For the researcher, it is vital to consider each stage of the experimental protocol, starting with the laboratory setup and proceeding through sample acquisition, template preparation, RT, and finally the PCR step. Only if every one of these stages is properly validated is it possible to obtain reliable quantitative data. Of course, choice of chemistries, primers and probes, and instruments must be appropriate to whatever is being quantitated. Finally, data must be interpreted, and this remains a real problem. Clearly, real-time qPCR is a valuable, versatile, and powerful technique. But, like anything powerful, it needs to be treated with respect.


Видеоро тамошо кунед: Quá trình nhân lên của virus HIVAIDS (Январ 2022).