Маълумот

Кӯмак дар омода кардани TSA Red Congo

Кӯмак дар омода кардани TSA Red Congo


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Аз ин рӯ, ман мехоҳам Конго Red TSA созам. Инструктори ман чанд маслиҳат дод, аммо ман то ҳол чанд савол дорам:

  1. Ман аз қабули ду маҳлули саҳҳомӣ оғоз мекунам: 20 мг/мл конго сурх ва комасси дар ду найчаи лочини гуногун. Барои тайёр кардани 30 мл ҳар як, оё ман 600 мг-ро дар оби безарар гудохтам?
  2. Консентратсияи ниҳоӣ дар ҳалли 500 мл TSA бояд 40 мкл/мл CR ва 20 мкг/мл coomassie бошад. Чӣ тавр ман миқдори маҳлули барои TSA лозимиро ҳисоб мекунам?

1) Бале, ин дуруст аст.

2) Ин танҳо як масъалаи оддии татбиқи муодилаи $C_1V_1=C_2V_2$ аст. Барои сурхи конго:

  • $C_1=20frac{mg}{mL}$
  • $ C_2 = 0.04 frac {mg} {mL} $
  • $ V_2 = 500 мл $

Ман боварӣ дорам, ки шумо ва як ҳисобкунак боқимондаро ҳисоб карда метавонед.


Усулҳои лаборатории асептикӣ: Усулҳои кашидан

Микроорганизмҳо дар ҳама сатҳҳои беҷон мавҷуданд, ки дар лаборатория сарчашмаҳои олудашавии эҳтимолиро ба вуҷуд меоранд. Муваффақияти таҷрибавӣ аз қобилияти олим вобаста ба безараргардонии сатҳи корӣ ва таҷҳизот, инчунин пешгирии тамос бо асбобҳо ва маҳлулҳои стерилизатсияшуда бо сатҳи безарар вобаста аст. Дар ин ҷо мо қадамҳои якчанд усулҳои пӯшишро пешниҳод мекунем, ки дар лаборатория барои ҷудо кардан, паҳн кардан ё номбар кардани микроорганизмҳо ба монанди бактерияҳо ва фагҳо истифода мешаванд. Ҳама панҷ усул техникаи асептикӣ ё расмиётро дар бар мегиранд, ки безурётии маводи таҷрибавиро нигоҳ медоранд. Тартибҳои тавсифшуда иборатанд аз (1) культураҳои бактериявӣ барои ҷудо кардани колонияҳои якхела, (2) рехтан ва (3) паҳн кардан барои номбар кардани колонияҳои бактериявии қобили ҳаёт, (4) қабатҳои нарм агар барои ҷудо кардани фаг ва номбар кардани лавҳаҳо ва ( 5) такрори такрорӣ барои интиқоли ҳуҷайраҳо аз як табақ ба табақи дигар дар шакли шабеҳи фазоии якхела. Ин тартиботро метавон дар суфраи лабораторӣ анҷом дод, ба шарте ки онҳо штаммҳои патогении микроорганизмҳоро дар бар гиранд (Биоса бехатарии Сатҳи 1, BSL-1). Агар кор бо организмҳои BSL-2, пас ин манипулятсияҳо бояд дар як шкафи бехатарии биологӣ сурат гиранд. Ба нашри охирини нашрия муроҷиат кунед Бехатарии биологӣ дар лабораторияҳои микробиологӣ ва биотиббӣ (BMBL) инчунин Варақаҳои маълумоти бехатарии моддӣ (MSDS) барои моддаҳои сироятӣ барои муайян кардани таснифи биологӣ, инчунин чораҳои эҳтиётӣ ва иншооти нигоҳдорӣ, ки барои микроорганизми мавриди назар заруранд. Штаммҳои бактериявӣ ва захираҳои фагҳоро аз муфаттишони тадқиқотӣ, ширкатҳо ва коллексияҳое гирифтан мумкин аст, ки аз ҷониби ташкилотҳои махсус нигоҳ дошта мешаванд, ба монанди Маҷмӯаи фарҳанги навъи амрикоӣ (ATCC). Тавсия дода мешавад, ки штаммҳои ғайрипатогенӣ ҳангоми омӯхтани усулҳои гуногуни пластинка истифода шаванд. Бо риояи тартиботе, ки дар ин протокол тавсиф шудааст, донишҷӯён бояд қодир бошанд: ● Бе ифлос кардани васоити ахбори омма расмҳоро иҷро кунанд. ● Колонияҳои ягонаи бактериявиро бо усули рах-плавиш ҷудо кунед. ● Барои муайян кардани консентратсияи бактерияҳо усулҳои рехтан ва пошиданро истифода баред. ● Ҳангоми кор бо фаг қабатҳои мулоими агар -ро иҷро кунед. ● Ҳуҷайраҳои бактериявиро аз як табақ ба дигараш бо истифода аз тартиби репликатсия интиқол диҳед. ● Бо назардошти вазифаи таҷрибавӣ, усули мувофиқи пӯшишро интихоб кунед.


Реферат

Биотипҳои патогении Yersinia enterocolitica (серотипҳои О:3, О:8, О:9 ва О:13), аммо биотипҳои экологӣ нестанд (серотипҳои О:5, О:6, О:7,8 ва О:7,8,13,19 ), гузаронандагии онҳо ба пробҳои гидрофобӣ ҳангоми афзоиш дар pH 5.5 ё дар васоити иловагии EGTA (Ca 2 + -маҳдудшуда) дар 37 ଌ афзоиш ёфт. Мушоҳидаи шабеҳ инчунин ҳангоми санҷиши штаммҳои намояндагии серотипҳои О:8 ва О:5 пас аз тамоси кӯтоҳ бо моноцитҳои инсон гузаронида шуд. Афзоиши гузариш новобаста аз плазми вирусӣ буд. Нақши липополисахарид (LPS) дар ин падида тавассути истифодаи Y. enterocolitica серотип О:8. Агрегатҳои LPS-и бактерияҳое, ки дар шўрбои кислотавӣ ё бо EGTA иловашуда парвариш карда шудаанд, бештар гирифтанд Н.-фенилнафтиламин нисбат ба LPS агрегатҳои бактерияҳои дар шўрбои стандартӣ парваришшуда ва инчунин афзоиши назарраси моеъи занҷири ацилро нишон дод, ки бо гузарандагӣ алоқаманд аст, тавре ки аз рӯи андозагирӣ дар ҳузури рангҳои гидрофобӣ муайян карда шудааст. Дар полимеризатсияи O-антиген тағироти назаррас ба назар нарасидааст, аммо вобаста ба шароити афзоиш ацилизатсияи липидҳои А тағир ёфтааст. Дар муҳити муқаррарӣ дар 37 ଌ, шаклҳои гекса-, пента- ва тетраацил липидҳои А мавҷуданд ва шакли пентаацил бартарӣ дошт. Миқдори тетраацил липидҳои А дар муҳити иловагии EGTA ва кислотаҳо афзоиш ёфт ва дар шароити охирин липидҳои гексаацил қариб нопадид шуданд. Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки патогенӣ аст Y. enterocolitica штаммҳо ациляцияи липидҳои А-ро бо ифодаи сафедаҳои вирулентӣ ҳамоҳанг мекунанд ва ба ин васила бастабандии LPS-ро коҳиш медиҳанд ва гузариши мембранаи беруниро зиёд мекунанд. Тағирот дар гузаронандагӣ, тағирёбии занҷири acyl LPS ва акилизатсияи липидҳои А дар патогенӣ Y. enterocolitica штаммҳо ба хусусиятҳо тақрибан мувофиқат мекунанд Псевдотуберкулёзи йерсиния ва Yersinia pestis ва пешниҳод мекунанд, ки як шакли умумии мембранаи беруна, ки бо патогенез алоқаманд аст, вуҷуд дорад.

Yersiniae бактерияҳои грам-манфӣ мебошанд, ки ба оила мансубанд Enterobacteriaceae. Ҷинс Йерсиния намудҳои ғайрипатогениро дар бар мегирад, ки асосан дар муҳити зист мавҷуданд, ду намуди патогенӣ (Псевдотуберкулёзи йерсиния ва Yersinia pestis), ва Yersinia enterocolitica, ки штаммҳои маъмулан экологӣ ва инчунин штаммҳоеро дар бар мегиранд, ки ҳарчанд онҳо дар муҳит афзоиш ёфта метавонанд, боиси лимфаденит мезентерӣ, дарунравӣ ва энтерит дар одамон мешаванд. Ду намуди Y. enterocolitica штаммхоро аз чихати бактериологй ва серологй фарк кардан мумкин аст. Панҷ гурӯҳи биологӣ (ва ду зергурӯҳҳои биогруппа 1) ва якчанд серотипҳо кластери зотҳои экологиро дар биогруппа 1А эътироф мекунанд ва штаммҳои патогенӣ аъзои биогруппаҳои 1В, 2, 3, 4 ва 5 мебошанд ва ба серотипҳои нисбатан кам мансубанд (серотипҳо) O: 3, O: 4, O: 5,27, O: 8, O: 9, O: 13 ва O: 21) (8). Аммо, фарқияти аз ҳама намоён дар он аст, ки штаммҳои патогенӣ дорои плазмиди (pYV) барои сафедаҳои вирулентӣ, ба монанди Йерсиния сафедаҳои берунӣ (Yops) ва Йерсиния адгезин А (ЯдА), ки фагоцитоз, опсонизатсия ва фаъолсозии комплементро манъ мекунад (13, 16, 23). Штаммҳои патогенӣ инчунин омилҳои вирусии аз ҷиҳати хромосомӣ рамзшударо ифода мекунанд, аз ҷумла Йерсиния энтеротоксин (Yst), мукоид Йерсиния сафедаҳои омил (Myf), invasin (Inv) ва замима-ишғол (Ail), ки ба ҳуҷум ва муқовимати хуноба марбутанд (22, 44). Азбаски ин бактерияҳо аз муҳити атроф ба рӯда мегузаранд ва сипас тавассути ҳуҷайраҳои М ба бофтаҳои ҳамсоя мегузаранд, тааҷҷубовар нест, ки ифодаи генҳои вирусӣ тавассути як ё якчанд сигналҳо ҳамчун нишонаи милионе, ки онҳо дучор мешаванд, пай дар пай фаъол ва хомӯш карда мешавад. (44). Ҳамин тариқ, сафедаҳои бо pYV-рамзгузоришуда дар 37 ଌ (ҳарорати бадани мизбон) ифода карда мешаванд ва ифодаи Yops инчунин тамоси ҳуҷайраҳои бактериявӣ-эукариотӣ ё дар vitro мавҷудияти маҳдудшудаи Ca 2 + -ро талаб мекунад (9, 11, 44) . Ифодаи Yst ва Inv in vitro дар 23°С ва дар марҳилаи статсионарӣ баландтар аст, аммо ҳарду сафеда низ дар 37°С дар шароити осмолярии мувофиқ ва рН ифода мешаванд. Ail ва Myf дар 37ºС ифода карда мешаванд ва инчунин мутаносибан бо шиддати оксиген ва рН танзим карда мешаванд (23).

Илова бар ин омилҳои вирусии классикӣ, Y. enterocolitica штаммҳои патогенӣ аз штаммҳои муҳити зист бо баъзе хосиятҳои мембранаи берунӣ (ОМ) фарқ мекунанд. Вақте ки ин бактерияҳо дар 37 ଌ мерӯянд, ОМ -ҳои штампҳои патогенӣ нисбат ба ОМ -ҳои штампҳои экологӣ ба пептидҳои бактерицидӣ тобовартаранд (4). Ғайр аз он, OM-ҳои штаммҳои патогенӣ ба зондҳои гидрофобӣ дар муҳити оксалати Mg 2 гузаранда мешаванд (барои тавлиди шароити пасти Ca 2' истифода мешаванд, ки дар vitro ифодаи pYV-ро ба вуҷуд меоранд), дар ҳоле ки OM-ҳои штаммҳои муҳити зист намегузаранд ( 4). Як далели иловагӣ ин аст, ки дар ҳамон муҳити оксалати Mg 2 +, афзоиши шаффофият дар штаммҳои патогении pYV-табобатшуда низ мушоҳида мешавад (4), ки нишон медиҳад омилҳои ангезандаи ифодаи pYV структураи ОМ ва физиологияро дар сатҳи хромосомӣ модулятсия мекунанд. Ин мушоҳидаҳо вақте ҷолибтар мешаванд, ки далели он Y. Pseudotuberculosis ва Y. pestis ОМҳо ба пайвастагиҳои гидрофобӣ дар муҳити стандартӣ гузаранда мебошанд (3) ва аз ин рӯ, эҳтимол дорад, ки гузаранда ба пайвастагиҳои гидрофобӣ як хислатест, ки ҳама патогенҳои патогенӣ доранд. Йерсиния spp. ки дар патогенӣ танзим карда мешавад Y. enterocolitica. Дар ин тадқиқот, мо ин гипотезаро тавассути озмоиши таъсири кислотаи pH, маҳдудкунии Ca 2 + ва тамос бо моноцитҳои инсон ба гузаронандагии Y. enterocolitica ба зондҳои гидрофобӣ. Ғайр аз он, азбаски маълум аст, ки монеаи гузаранда ҳадди аққал қисман ба хосиятҳои липополисахариди OM (LPS) алоқаманд аст (46, 47), мо инчунин ин молекуларо барои тағироти химиявӣ ва физикӣ-химиявии вобаста ба тағирёбии гузаранда тафтиш кардем. Мо дар ин ҷо дар бораи патогенӣ гузориш медиҳем Y. enterocolitica штаммҳо гузариши ОМ ва таркиби липидҳоро дар ҷавоб ба омилҳое, ки барои танзими ифодаи он маълуманд, тағир медиҳанд Йерсиния сафедаҳои вирусӣ, ки ё pYV ё хромосомӣ рамзӣ шудаанд.


Доғҳо

На танҳо аксари бактерияҳо хеле хурданд, балки онҳоро хеле равшан ва дар зери микроскоп дидан бидуни доғи аввал душвор аст. Шумо бояд бактерияҳоятонро ба слайдҳои шишагӣ маҳкам часпонед, то онҳоро ранг накунед. Ҳангоми омода кардани слайд барои рангкунӣ ду чизи муҳимро бояд ба назар гирифт:

  1. Бактерияҳо бояд баробар ва сабук пароканда карда шаванд. Агар дар слайд бактерияҳо зиёд бошанд, онҳо як глобуси калонро ташкил медиҳанд ва шумо морфологияи ҳуҷайраҳои инфиродиро дида наметавонед. Блокҳои калони ҳуҷайраҳо низ дуруст ранг намекунанд ва метавонанд аз рангубори нодуруст натиҷаҳои хато диҳанд.
  2. Бактерияҳо бояд ба слайд сахт часпонида шаванд, то онҳо ҳангоми расмиёти рангкунӣ шуста нашаванд. Ҳама тартиботе, ки бактерияҳоро ба слайд мепайванданд, боиси тағироти морфологӣ мешаванд. Ҳуҷайраҳо одатан андозаи хурд мешаванд ва баъзе тағиротҳоро дар шакл ва матритсаҳои берун аз ҳуҷайра нишон медиҳанд.

Шумо слайдҳоро барои ранг кардани ҳам сатҳи шӯрбо ва ҳам агар омода мекунед. Гарчанде ки ҳадафҳо барои ҳарду якхелаанд, ҳуҷайраҳои ҳамвор ва сабук пароканда ба сатҳи слайд сахт часпидаанд, усулҳо каме фарқ мекунанд. Рангсозӣ ҳам мисли илм санъат аст. Пеш аз он ки шумо муваффақ шавед, бешубҳа, шумо якчанд кӯшишро талаб мекунед.

Материалхо

  • Слайдҳои шишагинро тоза кунед
  • Доиравӣ ё сӯзанҳои тазриқӣ
  • Оби стерилӣ
  • Қаламчаи аломатгузорӣ
  • Фарҳангҳои шӯрбо ва табақҳои гуногун

Мулоҳизаҳои бехатарӣ

Ҳангоми интиқоли бактерияҳо аз ҳалқаи худ ба слайд аз аэрозолҳо эҳтиёт шавед. Давра хеле чандир аст ва халос кардани ҳалқаи пур аз организмҳо осон аст. Фикр накунед, ки организматон мурдааст. Таъмини гармӣ ё метанол барои куштани организм кафолат дода намешавад. Слайдҳои анҷомёфтаи худро дар сатили дезинфексия дар назди курсии худ партоед.

Мулоҳизаҳои умумӣ

Шумо барои таваққуфи сабуки ҳуҷайраҳо саъй мекунед, ки дар слайдатон пасандози абрнокро боқӣ мегузорад. Шумо дар слайди худ фазои зиёде доред, аз он истифода баред! Он дар аввал дар поёни слайд доира кашидан кӯмак мекунад, то шумо донед, ки доғи худро дар куҷо ҷустуҷӯ кунед. Омехта шудан хеле осон аст, ки доғи шумо дар кадом тарафи слайд аст. Боварӣ ҳосил кунед, ки канори дури слайдро қайд кунед. Инро пайваста дар ҳамон охири слайд иҷро кунед, то слайди худро ориентация кунед.

Сабр кунед ва вақт ҷудо кунед, то слайди худро хушк кунад, пеш аз он ки ба слайд пайваст шавед. Агар слайдҳои шумо тар бошад ва шумо онро гарм кунед, бактерияҳо ҷӯш мезананд ва морфологияи ҳуҷайра гум мешавад. Агар слайди шумо тар бошад ва онро дар метанол ислоҳ кунед, эҳтимолан он слайдро шуст. Дӯхҳои аз ҳад ғафс, новобаста аз усули фиксатсия, эҳтимолан слайдро шуста мебаранд.

Шӯрбо аз шўрбо

Одатан кор бо фарҳангҳои шўрбо осонтар аст, зеро ҳуҷайраҳо аллакай дар шўрбо омехта шудаанд. Боварӣ ҳосил кунед, ки найчаи фарҳангиро бодиққат омехта кунед, то бактерияҳоро дар шўрбо боздоред.

  1. Слайди худро нишон диҳед. Ба таври асептикӣ ҳалқаи пур аз организмро ба маркази слайди худ интиқол диҳед.
  2. Қисми ҳамвори ҳалқаро истифода бурда, қатраи шӯрбо дар атрофи слайдро молед. Барои паҳн кардани қатра ҳаракати даврашакл ва давраро истифода баред. Азбаски шӯрбо пур аз сафеда аст, доғ одатан паҳн мешавад ва дар рӯи слайд нахоҳад монд.
  3. Слайдро барои хушк кардани ҳаво ҷудо кунед. Ин ҳадди аққал якчанд дақиқа мегирад. Ба ин қадам шитоб накунед.

Моҳ аз табақ

Шумо метавонед бо ҳалқаи худ бисёр организмҳоро нест кунед. Шояд шумо мехоҳед сӯзанаки эмкунандаро барои интиқоли организм ба слайд истифода баред. Боварӣ ҳосил кунед, ки барои халалдор кардани намунаҳои худ оби стерилизатсияро истифода баред. Оби муқаррарии лӯла ё оби деионизатсияшуда дар шишаҳои шустушӯи шумо аксар вақт бо бактерияҳо олуда мешавад.

  1. Слайди худро нишон диҳед. Ба таври асептикӣ ҳалқаи пур аз оби безарарро ба маркази слайд интиқол диҳед.
    • Ин барои ҳам ҳазм кардани бактерияҳои шумо ва ҳам ба шумо чизе паҳн кардан хизмат мекунад.
  2. Як колонияи хуб ҷудошударо интихоб кунед.
  3. Онро бо сӯзани хушкидаи худ сӯрох кунед ё канори колонияро бо ҳалқаи безараратон каме кашед.
  4. Сӯзан/халқаи худро дар маркази қатра ҷойгир кунед ва бо як ҳаракати даврзананда бактерияҳоро дар слайд паҳн кунед.
  5. Слайдро ба ҳаво хушк кунед. Ин ҳадди аққал якчанд дақиқа мегирад. Ба ин қадам шитоб накунед.

Муайянкунӣ

Тартиби ислоҳкунӣ новобаста аз манбаи доғ, табақ ё шӯрбо якхела аст. Ду усули пайваст кардани бактерияҳои шумо ба слайд вуҷуд дорад, собит кардани гармӣ ё фиксанти метанол. Таъмини гармӣ танҳо дар организмҳои BSL1 истифода мешавад. Организмҳое, ки мо бо онҳо кор хоҳем кард, BSL2 мебошанд, аз ин рӯ ба шумо лозим аст, ки техникаи фиксанти метанолро истифода баред. Таъмини гармӣ слайд метавонад аэрозолҳо эҷод кунад ва бо организмҳои BSL2, мо бояд ба қадри имкон пешгирӣ кунем. Пайвастшавии метанол дар морфологияи ҳуҷайра тағйироти камро ба вуҷуд меорад ва аэрозолҳоро ба вуҷуд намеорад.

Лутфан ҳангоми кор бо метанол эҳтиёт бошед, агар шумо фаромӯш кардаед, ки онро бо метанол таъмир кардаед ва слайдатон комилан хушк нашудааст, метаноли боқимонда оташ мегирад.

Таъмини метанол (BSL2)

  1. Боварӣ ҳосил кунед, ки слайдатон комилан хушк аст. Онро дар рахи рангкунӣ дар болои раковина ҷойгир кунед.
  2. Бодиққат слайдро бо 95% метанол пур кунед. Бигзор он ду дақиқа нишинад.
  3. Слайдро хам кунед ва метанолро рехт.
    • Барои тоза кардани метаноли барзиёд ба канори слайд ба дастмоле коғазӣ расед.
  4. Слайдро пеш аз ранг кардан дар ҳаво хушк кунед.

Доғи оддӣ

Доғҳои оддӣ маҳз ҳамин чизанд - ба слайдҳои доғи собун як доғ илова кунед, бигзоред нишинад, бишӯед, хушк кунед ва бинед. Ин як амали фаврӣ барои муайян кардани мавҷудият ва морфологияи бактерияҳо дар намунаҳои клиникӣ ба монанди табларза ва ихроҷ мебошад.

Кабуди метиленӣ барои муайян кардани морфологияи фузиформ ва спирохетаҳо дар сироятҳои даҳон истифода мешавад. Он инчунин доғи интихоб барои муайян кардани гранулҳои метахроматӣ дар он аст Corynebacterium diphtheriae. Гранулҳо нисбат ба бактерияҳои кабуди атроф кабуди амиқтар ранг мекунанд. Дигар намудхои Коринебактерия гранулаҳои метахроматӣ надоранд. Ҳар гуна рангҳои асосӣ, аз қабили метилен кабуд, бунафши булур, сабз малахит ё сафранин хуб кор мекунанд.

Рангҳои асосӣ (катионӣ ё мусбат заряднок) ба ҷузъҳои зарядноки манфии мембранаи ҳуҷайра ва цитоплазма пайваст мешаванд.

Материалхо

  • Метилен кабуд
  • Сафранин
  • Арғувони булӯр
  • Малахит Грин
  • Рангҳои рангкунӣ
  • Қуттиҳои асбобҳои хурд
  • Слайдҳои слайдҳои омодашуда

Мулоҳизаҳои умумӣ

Рангкунӣ як қисми санъат ва як қисми илм аст. Ҳеҷ гуна қоидаҳои сахт ва зуд барои ранг кардан ва шустани вақт вуҷуд надоранд. Вақтҳои номбаршуда пешниҳодҳое мебошанд, ки одатан хуб кор мекунанд. Ба шумо лозим меояд, ки бо он чизе, ки барои бактерияҳое, ки шумо доред ва усулҳоеро, ки шумо истифода мебаред, таҷриба кунед.

Муҳим аст, ки шумо дар дафтари лабораторияи худ маҳз чӣ кор карда истодаед ва натиҷаҳои мушоҳидашударо сабт кунед. Шумо ин доғҳоро дертар дар семестр такрор хоҳед кард ва намехоҳед, ки вақти худро барои аз нав сохтани тартиби бомуваффақияти рангубори худ сарф кунед. Барои ҳар як узви курсии лаборатория интихоби доғи дигар муфид хоҳад буд, то шумо бубинед, ки ҳама чӣ гунаанд.

Тартиби оддии доғ

  1. Слайдҳои скрабии бодиққат омодакардаи худро дар болои доғи болои танӯр ҷойгир кунед.
    • Дар як вақт як слайд кунед.
    • Ҳар гуна рангҳои асосии барои шумо дастрасро доғро пӯшонед.
    • Барои пӯшонидани доғ ба шумо танҳо миқдори кофии ранг лозим аст. Доғ набояд аз слайд ҷорӣ шавад.
  2. Бигзор доғ барои 1-5 дақиқа нишинад.
  3. Бо истифода аз махлуқи либос, охири дарозии слайдро гиред, слайдро аз болои танӯр хам кунед ва доғро бо ҷараёни об аз шишаи шустушӯй бишӯед.
    • Итминон ҳосил кунед, ки ба болои сметана пошед ва бигзоред, ки он ба поён равад.
    • Агар шумо мустақиман ба масх пошед, шумо бояд лӯндаро аз слайд шуста кунед.
    • То он даме, ки об шаффоф шавад ё каме ранг шавад, бишӯед.
  4. Барои тоза кардани оби зиёдатӣ канори слайдро ба дастмоле коғазӣ ламс кунед. Шумо ҳоло метавонед онро дар ҳаво хушк кунед. Баръакс, шумо метавонед онро бо коғази блотинг хушк кунед ва онро дар китоби коғази блотинг ҷойгир кунед ва сабук пахш кунед. Гарчанде ки ин усул зудтар аст, шумо инчунин метавонед доғи суст часпидашударо тоза кунед.
  5. Слайди худро дар зери обдиҳии равған бинед ва мушоҳидаҳои худро дар китоби лаборатории худ сабт кунед.
  6. Слайдҳои оғуштаи истифодашудаи худро дар сатили дезинфексия дар раковина партоед.

Доғҳои манфӣ

Доғҳои манфӣ ҳатто нисбат ба доғҳои оддӣ соддатаранд, зеро ба шумо лозим нест, ки доғдор кунед. Қатраи ҳуҷайраҳо дар слайд паҳн карда шуда, бе фиксатсия дида мешавад. Доғ таваққуфи карбон аст, ки дар сиёҳ ё нигрозини Ҳиндустон мавҷуд аст. Зарраҳои карбон заряди манфӣ доранд ва мембранаи ҳуҷайра. Замина ранги сиёҳ ё сепия ба назар мерасад ва ҳуҷайраҳо равшан боқӣ мемонанд, зеро онҳо рангро дафъ мекунанд.

Баъзе ҷасадҳои дохилкунии мусбат, аз қабили сулфур, метавонанд доғдор шаванд. Ин доғ дар бораи морфологияи ҳуҷайра ва мавҷудияти капсулаҳо маълумоти дақиқ медиҳад, зеро ҳуҷайраҳо собит нестанд. Андозаи ҳуҷайра каме калонтар ба назар мерасад, зеро ҳама гуна қабатҳои берун аз ҳуҷайра ё секретҳо дар беруни мембранаи ҳуҷайра низ доғдор намешаванд. Доғҳои манфӣ барои зуд муайян кардани мавҷудияти муфид мебошанд Cryptococcus neformans, ангезандаи криптококкиз, дар моеъи сутунмӯҳраи мағзи сар. Ин усул инчунин ҳангоми доғдор кардани эндоспораҳо ва капсулаҳо истифода мешавад.

Материалхо

Мулоҳизаҳои умумӣ

Тавре ки ҳангоми омода кардани сметана ба шумо танҳо миқдори ками организм лозим аст. Агар шумо организмҳои аз ҳад зиёд дошта бошед, шумо морфологияи ҳуҷайраҳои инфиродиро дида наметавонед. Инчунин муҳим аст, ки нигрозинро аз ҳад зиёд истифода набаред. Агар он хеле ғафс бошад, пасзамина намуди кафидае хоҳад дошт, ки ба кӯлҳои лой дар офтоб хушк мешавад. Шумо мехоҳед, ки филми сабук гиред. Омӯзгоратон ин техникаро барои шумо нишон медиҳад.

Тартиби рангкунии манфӣ

  1. Слайди худро нишон диҳед. Агар шумо аз фарҳанги шўрбо кор карда истода бошед, як ҳалқаи пур аз организмҳо тақрибан аз чор се ҳиссаи роҳро дар тарафи чапи слайд ҷойгир кунед. Агар шумо аз фарҳанги табақкорӣ кор карда истода бошед, ба слайд як қатра оби хушкида илова кунед ва организматонро дар қатра бе паҳн кардани қатра об кунед.
  2. Як ё ду қатра нигросинро ба слайди дигар гузоред. Барои гирифтани ҳалқаи пур аз нигрозин ҳалқаи стерилизатсияшудаи худро истифода баред. Бодиққат онро бо қатраҳои ҳуҷайраҳо омехта кунед, бе он ки қатраро аз ҳад зиёд паҳн кунед.

  1. Нӯги рости слайдро бо дасти чапатон дар дасти рост нигоҳ доред, слайди дигарро бо кунҷи 45° ё камтар аз слайди аввал, танҳо аз тарки нигрозин/ҳуҷайраҳои худ бигиред.
  2. Слайди кунҷиро дар рӯи слайди аввал то он қафо кашед танҳо ба тарки нигрозин ва ҳуҷайраҳо мерасад. То амали капилляриро интизор шавед, то моеъро дар канори пеши слайди кунҷӣ кашад.
  3. Слайдҳои кунҷиро аз рӯи слайдҳои ҳамвор тела диҳед. Қисми зиёди нигросин бояд дар ҷои аввала боқӣ монад. Слайдро дар сатили дезинфексия партоед.
  4. Слайди оғуштаро пеш аз дидани он, ки дар зери об мондани равған дар ҳаво хушк кунед, як сӯ гузоред. Боварӣ ҳосил кунед, ки ба таҳқиқи слайдҳои худ дар ин минтақа бо заифтарин заминаи хокистарӣ шурӯъ кунед.
  5. Мушоҳидаҳои худро дар дафтари лабораторияи худ сабт кунед.
  6. Слайдҳои доғдоршудаи худро дар сатили дезинфексионӣ партоед.

Шарҳи махсус

Нигросин аз слайд ва ба линзаи обгузаронии равғани шумо ба осонӣ меояд. Боварӣ ҳосил кунед, ки ҳангоми ба охир расидани линзаи равғани худ бодиққат тоза кунед. Сипас онро дубора тоза кунед. Пас аз он ки дар линза хушк мешавад, хориҷ кардан хеле душвор аст ва қобилияти шуморо (ва дигар донишҷӯёни хурдро, ки ин миқдорро истифода мебаранд) аз чашм равшан дидан мумкин аст.

Gram Stain

Доғи Грам доғи маъмултаринест, ки дар микробиология истифода мешавад. Доғҳои дифференсиалӣ зиёда аз як рангро истифода мебаранд. Ҷузъҳои беназири ҳуҷайравии бактерияҳо муайян мекунанд, ки онҳо ба рангҳои гуногун чӣ гуна муносибат мекунанд. Тартиби доғи Грам асосан аз соли 1884 таҳия карда шудааст, тақрибан бетағйир мондааст. Қариб ҳамаи бактерияҳоро ба ду гурӯҳ тақсим кардан мумкин аст: грам манфӣ ё грам мусбат. Баъзе бактерияҳо грам -тағирёбанда мебошанд. Трихомонас, Стронгилоидҳо, баъзе занбӯруғҳо ва баъзе кистаҳои протозоа низ вокуниши грам доранд. Бактерияҳои хеле хурд ё бактерияҳо бе девори ҳуҷайра, масалан Трепонема, Микоплазма, Хламидиоз, ё Риккетсия вокуниши грамм надоранд. Тавсифи ҳар як бактерияҳои нав бояд реаксияи грамми онҳоро дар бар гирад.

Одатан доғи дифференсиалӣ дорои чаҳор ҷузъи доғи аввала, мордант, ки доғро мегузорад, агенти рангорангкунанда барои тоза кардани доғи аввала ва доғи муқобил мебошад. Дар доғи Грам доғи аввала бунафши булур аст. Ин ба ҳуҷайра ранги шадиди арғувонӣ медиҳад. Мордант, йод як комплексро бо бунафшаи булӯр дар дохили девори ҳуҷайра ташкил медиҳад. Сипас ҳуҷайра бо рангорангкунандаи Gram ё 95% этанол шуста мешавад. Ҳуҷайраҳои грам мусбат комплекси рангро нигоҳ медоранд ва арғувон боқӣ мемонанд. Ранг дар ҳуҷайраҳои грам-манфӣ шуста мешавад. Доғи муқобил, сафранин барои ранг кардани ҳуҷайраҳое, ки доғи аввалияро аз даст додаанд, истифода мешавад, дар акси ҳол онҳо рангин мемонанд ва шумо онҳоро дида наметавонед.

Аз сабаби сохтори молекулавии қабатҳои сершумори пептидогликан дар девори ҳуҷайра комплекси калони бунафши йод-булӯр рангест дар деворҳои ҳуҷайраҳои ҳуҷайраҳои грам-мусбат нигоҳ дошта мешавад. Миқдори зиёди кислотаҳои тейхоиии ба ҳам алоқаманд мавҷуданд ва комплекси йод-ранг ҷисман берун баромада наметавонад. Дар мембрана инчунин липид камтар аст ва агенти рангорангкунанда наметавонад ба он бирасад. Ҳуҷайраҳои грам -манфӣ мембранаи берунӣ ва танҳо як қабати пептидогликан доранд, ки липидҳои бештар доранд. Ранг бунафшаи булӯр ба осонӣ шуста мешавад.

Мулоҳизаҳои умумӣ

Дақиқии доғи Грам аз тамомияти девори ҳуҷайраҳои бактерия вобаста аст. Чизҳои гуногун мавҷуданд, ки метавонанд ба ҳуҷайраҳои кӯҳнаи девори ҳуҷайра таъсир расонанд (яъне фарҳангҳои аз 24 -сола боло), намуна аз шахсе гирифта шудааст, ки бо антибиотикҳо табобат карда шудааст, ки ба он девори ҳуҷайра, ба монанди пенициллин, ҳуҷайраҳо тақрибан коркард шудаанд ё шумо гарм онҳоро ислоҳ кард. Дар ин шароит, ҳуҷайраҳои грам-мусбат ҳамчун грам-манфӣ пайдо мешаванд. Агар шумо рангро аз ҳад дароз кашед, ҳуҷайраҳои грам-мусбат ба ҳуҷайраҳои грам-манфӣ монанд мешаванд. Ва баръакс, агар шумо рангро ба қадри кофӣ ранг накунед, грам-негативҳо ба грам-позитивҳо монанд мешаванд. Ягона роҳе, ки шумо метавонед ба натиҷаҳои худ эътимод кунед, ин аст, ки ҳамеша дар як слайд як грам-позитиви маъруф ва як грам-манфиро иҷро кунед. Агар онҳо мувофиқи пешгӯӣ доғдор шаванд, шумо метавонед итминон ҳосил кунед, ки натиҷаи намунаи номаълуми шумо эътимоднок аст.

Ранг кардани Грам барои дуруст ба даст овардани таҷриба лозим аст. Интизор нашавед, ки дар кӯшиши аввалини худ доғи хуби Gram ба даст меоред. Ғояи хубест, ки слайди худро бо қуттии либос нигоҳ доред, дастпӯшакҳои шумо мисли ҳар чизе, ки шумо ламс мекунед, хеле рӯҳӣ хоҳанд шуд!

Тартиби доғи грам

  1. Слайдро қайд кунед. Нишонаҳои худро дар слайд бо Грам-манфии дар тарафи чап, номаълуми шумо дар мобайн ва Грам-мусбии дар тарафи рост омода кунед.
    • Ислоҳ кардани слайдҳои худро бо метанол фаромӯш накунед!
  2. Слайди худро дар болои лавҳаи рангубор гузошта, доғҳоро бо рангестаи булӯр дар давоми 1 дақиқа пӯшонед.
    • Барои пурра пӯшонидани масх танҳо доғи кофӣ истифода баред, аммо на он қадар зиёд, ки он аз слайд мерезад ё мечакад.
  3. Слайдро хам кунед ва бунафшаи булӯрро резед ва бо оби шишаи шустушӯи худ ба муддати кӯтоҳ бишӯед.
    • Фаромӯш накунед, ки бевосита ба доғҳо пошида нашавед, вагарна шумо онҳоро мешӯед.
  4. Слайдро бо морданти йод барои 1 дақиқа об кунед.
  5. Слайдро хам кунед, йоди барзиёдро рехт ва бо рангорангкунандаи Gram оҳиста рангашро тоза кунед, то он даме ки тоза ба кор дарояд.
    • Ин қисми ҷолиб аст!
  6. Барои тоза кардани де-рангсозандаи зиёдатӣ слайди худро ба баъзе дастмолҳои коғазӣ хам кунед.
  7. Слайдҳои худро бо сафранин дар давоми 1 дақиқа пур кунед.
  8. Слайдро хам кунед, то сафранини барзиёд рехта шавад ва то тоза шудани он бо об мулоим бишӯед.
  9. Бигзор ҳавои слайд хушк шавад
  10. Дар зери ғарқ кардани равған мушоҳида кунед.
    • Назорати мусбии грам бояд арғувон ва назорати манфии грам бояд гулобӣ бошад.
  11. Слайди истифодашудаи худро дар сатили дезинфексия партоед.

Доғи капсулаи сурхи Конго

Доғи капсулаи сурхи Конго як тағир додани доғи манфии нигрозин аст, ки шумо қаблан карда будед. Бактерияҳо ранги сурхи Конгоро мегиранд ва пас замина бо ранги кислотаи фуксин ранг карда мешавад. Капсулаҳо ё қабатҳои шлам, полимерҳои хеле гидратшуда ҳарду рангро истисно мекунанд. Замина кабуд, ҳуҷайраҳои бактериявӣ гулобӣ пайдо мешаванд ва галоҳои равшан капсулаҳо мебошанд.

Аз ҷиҳати клиникӣ капсулаҳои баъзе бактерияҳои хеле патогенӣ (масалан: пневмококкҳо, Зукоми гемофилис, ва менингококкҳо) -ро метавон бо истифодаи антисераи махсус барои ин намуди капсула фарқ кард. Бактерияҳо дар антисера боздошта мешаванд ва сипас бо кабуди метилин омехта карда мешаванд. Дар тартиби рангкунии антисера, бактерияҳо кабуд дар иҳотаи ҳалои равшан пайдо мешаванд ва сипас бо хати тунуки кабуд иҳота шудаанд, ки антисераҳо ба капсула пайваст шудаанд.

Материалхо

  • Доғи сурхи Конго
  • Доғи кислотаи фуксин
  • Спирти кислота
  • Klebsiella pneumoniae маданият
  • Enterobacter aerogenes маданият

Тартиби ранг кардани капсулаи сурхи Конго

  1. Дар слайд як ҳалқаи пур аз Congo Red ҷойгир кунед
  2. Миқдори ками организми худро ба қатраи Конго Сурх омехта кунед.
    • Дар слайд организм/суспензияи рангро хуб паҳн кунед
  3. Бигзор слайд бодиққат дар ҳаво хушк шавад.
    • Метанолро ислоҳ накунед!
  4. Слайди хушкро бо спирти кислота барои 15 сония ислоҳ кунед.
  5. Бо оби соф шуста, слайдро бо кислотаи фуксина барои 1-5 дақиқа пӯшонед.
  6. Бо об бишӯед ва иҷозат диҳед, ки дар ҳаво хушк шавад.
  7. Слайдро дар зери об кардани равған тафтиш кунед.
    • Ҳуҷайраҳо сурх/гулобӣ ранг мекунанд ва капсулаҳо ҳамчун галоҳои беранг дар заминаи кабуди торик пайдо мешаванд.

Доғи эндоспораи Виртц

Ташаккули эндоспораҳо хос аст Clostridum ва Бациллус spp. Қобилияти мутамарказ кардан ва пӯшонидани протоплазмаи онҳо ба онҳо имкон медиҳад, ки аз шароити номусоиди муҳити зист, ки дар муҳити зисти онҳо эҳсос мекунанд, наҷот ёбанд. Ин инчунин имкон медиҳад, ки қаламчаҳо ба доғ муқовимат кунанд. Организмҳои "зинда" бо доғҳои оддӣ ва доғҳои Грам ба осонӣ тасаввур карда мешаванд.

Эндоспораҳо маъмулан хеле рефраксия мебошанд, нуре, ки ба онҳо зарба мезанад, пароканда мешавад. Бисёр Бациллус намудҳо ҷисмҳои дохилшаванда доранд, ки хеле рефраксия мебошанд. Ин мақомоти дохилшаванда метавонанд ба эндоспораҳо бо рангкунии мунтазам монанд бошанд. Мавҷудияти эндоспораҳо бояд бо доғҳои хоси эндоспора тасдиқ карда шавад. Ҳузур ва шакл ва мавқеи хоси эндоспораҳо барои ворид кардани қабати эндоспора тартиби махсусро талаб мекунад. Аксари доғҳои эндоспора гармкунии слайдҳоро дар бар мегиранд ва онҳоро доимо бо ранг тар мекунанд. Дар ҳоле ки зудтар, он кимиёвии идоранашаванда истеҳсол мекунад ва танҳо як бесарусомони бузург аст. Ҳамин гуна натиҷаҳоро тавассути гузоштани ранг дар слайд барои 30 дақиқа ба даст овардан мумкин аст. Ин як фикри хуб аст, ки аввал ин слайдро оғоз кунед ва дар доғи дигар кор кунед, вақте ки шумо мунтазири гузариши ранг ба эндоспора ҳастед.

Мулоҳизаҳои умумӣ

Шумо a -ро истифода хоҳед бурд Бациллус намудҳо барои доғи эндоспора. Шакл ва мавқеи B. мағзи сар спораҳо ба онҳо хеле монанданд B. anthracis. Бациллус то ба охир нарасидани ғизо ба ташаккули спораҳо шурӯъ намекунад. Агар фарҳангҳо хеле ҷавон бошанд, шумо асосан танҳо чӯбҳои гулобии бактерияҳоро хоҳед дид. Агар фарҳангҳо хеле кӯҳна бошанд, шумо асосан танҳо байзаҳои хурди сабзи эндоспораҳоро хоҳед дид. Идеалӣ, шумо бояд ҷисмҳои байзавии сабзи эндоспораро бинед, ки дар иҳотаи ҳуҷайраи бактериявии гулобии растанӣ ҷойгиранд. Намунаеро аз миёнаи колония бо сӯзани рости эмкунӣ барои натиҷаҳои беҳтарин интихоб кунед. Канори колония ҳоло ҳам фаъолона меафзояд ва чанд эндоспора хоҳад дошт.


Сохтмони китобхонаҳои комплексии ДНК-и иловагӣ дар SfiI

Буферҳои ферментӣ

Ҳама дайджестҳои маҳдудкунандаи эндонуклеаз дар буфери 0,5–2 × KGB [2 × = 200 м анҷом дода шуданд.М. глутамати калий, 20 мМ. Трис-ацетат, рН 7,6, 20 мМ. ацетати магний, 100 мкг/мл альбумини хуноба (BSA) 1 мМ. 2-меркаптоэтанол (2-ME)]. 7 Фосфоризатсия дар буферии 1 × полинуклеотид киназ гузаронида шуд [PNKB 1 × = 70 мМ. Трис, pH 7.6, 10 мМ. MgCl2, 50 мМ. дититреитол (ДТТ)]. Лигаҳо дар 0,5 × КГБ ё 1 × ПНКБ бо илова кардани ATP ба консентратсияи ниҳоии 1 м иҷро карда шудандМ..

ВАО

SB: Бакто-триптон, 32 г иқтибоси Бакто-хамиртуруш, 20 г хлориди натрий, 5 г. 1 литр Н дукарата дистиллятсия карда мешавад 2Эй ва стерилизатсия дар автоклав

LB: Бакто-триптон, 10 г иқтибоси Бакто-хамиртуруш, 5 г хлориди натрий, 5 г. Табақҳо бо иловаи Bacto-agar, 15 г омода карда мешаванд. 1 литр Н-и дукарата тозашуда илова кунед2Эй ва стерилизатсия дар автоклав SOC: Бакто-триптон, 20 г иқтибоси Бакто-хамиртуруш, 5 г 10 мМ. NaCl (2 мл 5 М. маҳлул) 2,5 мМ. KCl (1,25 мл 2 М. маҳлул) 10 мМ. MgCl2 (1 мл 1 М. маҳлул) 10 мМ. MgSO4 (1 мл 1 М. ҳалли) 20 мМ. глюкоза (2 мл 1 М. ҳалли). 1 литр Н дукарата дистиллятсия карда мешавад2Эй, аликвот, ва стерилизатсияро дар автоклав


Натиҷаҳо

Таназзули кератин аз фарҳангҳои якранг

Деградатсияи кератин дар фарҳангҳои ларзиш бо муҳити моеъи кератини (KLM) дорои 10 мг/мл кератин санҷида шуд. Пас аз 4 рӯзи кишт, таназзули кератин тавассути чен кардани вазни боқимондаи хушк баҳо дода шуд. Афзоиши аҳолӣ тавассути ҳисоб кардани воҳидҳои ташаккули колония (CFU) арзёбӣ карда шуд. X. ретрофлексус миқдори хеле зиёди кератинро таназзул кардааст (2.1 ± 0.2 мг/мл, инҳирофи стандартӣ [SD]) (pадж & lt 0.05, Lin.1) (Расми 1А) ва дар муқоиса бо дигар намудҳои ягонаи CFU ба таври назаррас баландтар расид (Расми S8A). Таназзули кератин аз С.. ризофила, аммо М.. оксидон ва П. amylolyticus қобилияти маҳдуди хориҷ кардани кератин аз муҳити атрофро нишон дод. Ҳисоб кардани CFU дар фарҳангҳои С.. ризофила ва М.. оксиданҳо нисбат ба онхо баландтар буд П. amylolyticus, ки шумораи хеле пасттарини CFU -ро нишон дод (саҳад & lt 0.05, Lin.1) (Расми S8A). Ко-культивация микдори зиёд шуд П. амилолитикӣ (Расми S8B). Таназзули кератин ба ҳисобҳои CFU барои таҳқиқи потенсиали таназзули ҳар як намуд муқаррар карда шуд. Бо ба эътидол овардани CFU, X. ретрофлекс ва С.. ризофила дар таназзули кератин баробар самаранок буданд ва таназзули ба таври назаррас баландтар аз он дошт М.. оксиданҳо (S9 Расми) (саҳад < 0,05, Лин.1). Ҳисоб кардани таназзули кератин дар як CFU барои П. amylolyticus хориҷ карда шуд, чун П. амилолитикӣ хамчун моно-маданият инкишоф наёфтааст. Супернатантҳои озод аз ҳуҷайра X. ретрофлекс ки дар кератин парвариш карда шудааст, натавонист ба афзоиши штампҳои дигар мусоидат кунад, ки ин нишон медиҳад, ки муҳити зист аз маводи ғизоӣ хеле кам аст ва кератини таназзулёфта зуд метаболизм мешавад. Таназзули кератин инчунин бо алкализатсияи мушоҳидаи ВАО дар тӯли вақт дастгирӣ карда шуд X. ретрофлекс якка ва ко-культурахо. Алкализатсия барои ин фарҳангҳо аз pH ибтидоии 7 то pH 8.5 мушоҳида карда шуд.

С.. ризофила, X. ретрофлекс, М.. оксиданҳо ва П. амилолитикӣ мутаносибан бо ҳарфҳои S, X, M ва P ифода карда мешаванд. Фарҳангҳои муштарак бо ҳарфҳое ифода карда мешаванд, ки ҷузъҳои ягонаи онро ифода мекунанд, масалан. XS фарҳанги муштаракро ифода мекунад X. ретрофлексус ва С.. ризофила. Барҳои хато инҳирофи стандартии се такрори биологиро ифода мекунанд. A) Таназзули кератин (мг/мл) барои фарҳангҳои якранг пас аз 4 рӯзи инкубатсия. Ҳарфҳои гуногун гурӯҳбандии омориро муайян мекунанд (тартиби афзоиш, саҳадж & lt 0.05, Lin.1) B) Афзоиши таназзули кератин дар ҳамфарҳангҳои X. ретрофлекс, нисбат ба X. ретрофлекс моно-фарҳанг (бо хати сурхи нуқта нишон дода шудааст). Фарқи оморӣ аз ҷониби Lin.3 хулоса карда мешавад. C) Таназзули андоза ва назариявии кератин (мг/мл) дар X. ретрофлекс моно-фарҳанг ва ҳамфарҳангҳо. ‘Measured’ refers to the measured keratin degradation, whereas ´expected´ refers to the expected theoretical amount of keratin degraded by the given co-culture. The expected amount was calculated as follows: Expected XS co-culture degradation = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of С.. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of С.. rhizophila in the XS co-cultures. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. Significant difference was inferred by a two-tailed independent two-sample t-test.

Keratin degradation in co-cultures

Degradation from co-cultivation was evaluated for all combinations of dual-species and the 4-species cultures. However, only co-cultures containing X. retroflexus had enhanced keratin degradation as compared to the best single species degrader of the individual co-cultures. X. retroflexus constituted the majority of these communities according to CFU counts (S8A Fig). The enhanced degradative effect of co-cultures had an average fold-change of 1.29, indicating that keratin degradation in co-cultures was on average enhanced by

30% as compared to X. retroflexus mono-cultures (Fig 1B). Co-cultures XM (mean fold change [MFC] = 1.297, p = 0.02, Lin.3), XP (MFC = 1.38, p < 0.01, Lin.3) and XSMP (MFC = 1.27, p = 0.03, Lin.3) displayed significantly enhanced keratin degradation (Fig 1B). Measurements of keratin degradation for all X. retroflexus mono and co-cultures are presented in S10A Fig. Although average total cell counts of co-cultures were not significantly different from that of X. retroflexus mono-cultures, keratin degradation was normalized to cell counts to account for potential variations. Measurements of keratin degradation normalised to CFU counts for all X. retroflexus mono and co-cultures are shown in S10B Fig. With CFU normalisation, the co-culture of XP and the four-species co-culture still had significantly enhanced keratin degradation compared to that in X. retroflexus mono-cultures (S10C Fig).

Community-intrinsic properties

To test for the presence of community-intrinsic properties, the measured degradation of the individual co-cultures was compared to the predicted maximum degradation from the sum of their constituent single species cultures (S11A Fig). Data included three biological replicates, yielding three measures of community degradation with associated measures of single species degradation. Notably, co-culture XP had a significantly higher mean degradation than the predicted maximum. The XM co-culture non-statistically supported the trend of co-cultures having higher degradation than the predicted level. However, comparing co-culture degradation to the sum of multiple single species cultures can make identification of community-intrinsic properties difficult. Instead co-culture degradation was compared to a normalised theoretical degradation of the co-culture, e.g. for the XS culture (Fig 1C) Expected theoretical degradation of the XS co-culture = Degradation potential of X. retroflexus in mono-culture per CFU * CFU count of X. retroflexus in XS co-culture + degradation potential of С.. rhizophila in mono-culture per CFU * CFU count of С.. rhizophila in the XS co-culture. For convenience a complete calculation of the XS co-culture has been added as S12 Fig. All co-cultures had a higher mean of measured keratin degradation, as compared to the theoretical degradation, indicating that community-intrinsic properties resulted in enhanced degradation. For co-cultures of XP and XSMP (p < 0.0073 and 0.0042 respectively, independent two-tailed t-test) the measured mean was significantly higher than the theoretical estimate. Normalizing with CFU revealed that co-cultures XP and the four-species community were still significantly more productive than the expected theoretical degradation (S11B Fig).

Quantitative PCR analysis for keratin adhered cells

Previous studies on microbial degradation of recalcitrant material have linked the degree of degradation to the amount of microbes physically associated to the material. Quantitative analysis using universal eubacterial primers targeting the 16S rRNA gene (qPCR) was used to address the number of cells adhered to the keratin particles, with the assumption that total bacterial cell counts on the particles could indicate a level of biofilm formation on the particles. QPCR analysis was performed on mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Among the mono-cultures cultures of X. retroflexus contained significantly higher counts of copy numbers, as compared to any other type of mono-culture (S13A Fig, p < 0.001, Lin.1) at both time points. С.. rhizophila displayed the second highest level of copy numbers, although it was not significantly different from М.. oxydans ва П. amylolyticus, (S13A Fig).

After two days of incubation only the co-culture XM contained higher amounts of attached cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture (Fig 2). However, after 4 days of incubation all co-cultures contained more attached cells than the X. retroflexus mono-culture, suggesting that a synergistic biofilm production or attachment was at play during co-cultivation. Co-cultures of XM (MFC = 1.61, p = 0.018, Lin.3) and XP (MFC = 1.52, p = 0.014, Lin.3) displayed significantly higher numbers of attached cells, as compared to X. retroflexus mono-cultures. Co-cultures of XS and the four-species culture also presented higher fold change, although not significantly (Fig 2). Biofilm counts from co-cultures are included in S13B Fig.

Q-PCR analysis was based on universal eubacterial 16s rDNA gene primers. Keratin particles were isolated from mono- and co-cultures after 2 and 4 days of incubation. Counts of 16S gene copy numbers were believed to correspond to cells associated to the particles in a biofilm state. Co-culture counts were compared to counts of X. retroflexus mono-cultures. Dotted red line corresponds to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures are represented by letters of their constituent species e.g. X.retroflexus–S.rhizophila (XS), X.retroflexus–M.oxydans (XM) and X.retroflexus–P.amylolyticus (XP). At day 2, the level of adhered cells was not significantly different between co-cultures and the X. retroflexus mono-culture. At day 4, the co-cultures trended an increased fold change of adhered cells, as compared to the X. retroflexus mono-culture. Co-cultures of X.retroflexus–M.oxydans ва X.retroflexus–P.amylolyticus had a significantly increased fold change (Lin. 3).

To further investigate the relevance of cell attachment in relation to keratin degradation, we performed a correlation analysis between measured keratin degradation, total cell counts in the supernatant and biofilm counts. The correlation analysis was performed on day 4 data of X. retroflexus mono- and co-cultures. Using Pearson’s correlation, a significant (padj = 0.04, FDR corrected p-value) strong positive (р = 0.98) correlation coefficient was observed between keratin degradation and biofilm counts. Oppositely, total CFU counts from the supernatant (as presented in S8 Fig) showed only a non-significant weak negative correlation with keratin degradation. Hence, biofilm formation on the keratin particles is a better predictor for keratin degradation than total CFU counts (S15 Fig and S2 Table). To further support this observation a Spearman’s ranked correlation approach was also adopted. Similar to the Pearson’s approach a strong positive correlation (рс = 1) was observed for keratin degradation and biofilm counts, although the correlation in this case was only nominal significant (p = 0.01667, padj = 0.14 with FDR correction). Again, total culture CFU and keratin degradation only showed a weak negative non-significant correlation (S15 Fig and S3 Table).

Enzymatic assays and protein measurements

Protease and keratinase activity were measured on a spectrophotometer using azocasein and azokeratin dyed substrates, respectively. Among mono-cultures, protease activity, keratinase activity and soluble protein concentration in the medium were found to increase with time for X. retroflexus ва С.. rhizophila (S16A–S16C Fig). Барои М.. oxydans ва П. amylolyticus, no clear proteinase and keratinase activity was observed, and protein content did not change over time. At day 4, the protease and keratinase activity of X. retroflexus was significantly higher than that of all other mono-cultures (protease: 39.42 ±2.34 U/mL, keratinase: 34.58 ±12.1 U/mL, standard deviation, Lin.1). С.. rhizophila had the second highest proteinase and keratinase activity at day 4 (S16A and S16B Fig), which was significantly higher than М.. oxydans ва П. amylolyticus in regards to protease activity, but only nominal significant in regards to keratinase activity (protease: 12.26 ±1.96 U/mL, keratinase: 15.57 ±4.59 U/mL, standard deviation, Lin.1). X. retroflexus ва С.. rhizophila (0.29 ±0.01 mg/ml and 0.24 ±0.005 mg/ml respectively, SD) produced significantly higher amounts of soluble protein (Lin.1) compared to М.. oxydans ва П. amylolyticus, but there was no significant difference between the production from X. retroflexus ва С.. rhizophila (S16C Fig). At day 4, observed protease and keratinase activities for co-cultures of X. retroflexus were similar to that of X. retroflexus mono-cultures Only the protease activity of the XS co-culture deviated significantly, and was significantly lower (padj = 0.0118, Lin.1) (Fig 3A and 3B).

Lines represent a linear regression of three biological replicates across sampling time. A) Protease production by different co-cultures using azo-casein as substrate. One unit protease activity was defined (U) as the amount of protein that increased the absorbance by 0.01. B) Keratinase production by different co-cultures using azo-keratin as substrate. One unit keratinase activity was defined as the amount of protein that increases the absorbance by 0.01 under given conditions. C) Protein production from degraded keratin by different co-cultures. Bradford assay was used for protein quantification with BSA as standard.

When comparing changes in activity over time, steeper activity increases were observed for some co-cultures, as judged from linear slope’s coefficients. Slope coefficients and p-values have been appended as S4 Table. The slope coefficient for the four-species community was higher for both protease and keratinase activity (slope = 7.87 and p = 0.007 and padj = 0.0276 for protease activity slope = 8.03 and p = 0.0184 and padj = 0.0718 for keratinase activity, Lin.2) as compared to the X. retroflexus mono-culture, indicating an increased turn-over within the tested time-span. Co-cultures of XM and XP also trended a higher slope coefficient, although not significantly different (p = 0.0571 and padj = 0.2095 for XM p = 0.064 and padj = 0.2323 for XP, Lin.2).

Although slope coefficients of most co-cultures with X. retroflexus were higher, the soluble protein concentration did not vary significantly between these co-cultures and that of X. retroflexus mono-cultures (Fig 3C).

Observation of protease activity, keratinase activity and protein concentration was included in the correlation analysis with keratin degradation, total CFU counts and biofilm counts, with day 4 observations. For both the Pearson’s and Spearman’s ranked correlation analysis keratinase activity displayed a higher correlation coefficient with keratin degradation than protease activity. However, none of the correlations were significant (S14 and S15 Figs and S2 and S3 Tables). Of the three, protein concentration had the second highest correlation coefficients to keratin degradation, although not significant for neither Pearson’s nor Spearman’s ranked correlations.

Secretome analysis by mass spectroscopy

To further resolve the increased keratin degradation in co-culture, the secretome of X. retroflexus was assessed through LC-MS/MS-based proteomics profiling. Secretome profiling was restricted to X. retroflexus as it was i) the species with the highest potential for degradation and ii) constituted the majority of cells in the co-cultures making it unlikely to obtain good proteome coverage from the other species present in the co-cultures. Secretome profiling was conducted after two days of cultivation, as preliminary tests showed that secretome profiling quality was inversely proportional to incubation time due to build-up of keratin degradation products that hampered identification of secreted bacterial proteins over time. Identified proteins from X. retroflexus were mapped with i) function and subsystem features from the RAST database [60,61], ii) prediction of signal peptides for secretion to the extracellular environment using SignalP [64] and iii) MEROPS protease functions [32,63]. Data quality is summarised in S2–S7 Figs, and the materials and methods section. Identified proteins were filtered according to the presence of signal peptides based on SignalP [64], narrowing the search towards secreted and/or membrane exported proteins. Total counts of identified proteins after SignalP filtration are summarised in Fig 4. Noticeably, several proteins were uniquely observed in the co-culture sample and not in the mono-culture X. retroflexus намунаҳо.

Identified proteins from the secretome samples were filtered by i) removing the two outlying biological replicates and ii) removing proteins which did not contain a signal peptide. A) Identified proteins and their overlap between different sample groups, only requiring that the protein is observed in one sample of all biological replicates. B) Quantifiable proteins are defined as proteins which were detectable in 4 out of the 6 biological replicates of a given culture. From each co-culture type, only proteins shared with the X. retroflexus mono-culture were included in the differential abundance analysis.

Secretome differences of X. retroflexus in mono- and co-cultures were addressed by both a supervised and un-supervised statistical approach. A supervised approach was used to make pairwise comparisons of the secretome profiles of the X. retroflexus mono-cultures to X. retroflexus in the different co-cultures using paired t-test with FDR correction. An unsupervised approach (principal component analysis) was used to identify the proteins causing separation between the different culture types.

For the paired t-test the tested proteins were required to be present in four out of the six biological replicates in both of the compared groups. Fig 4 summarises counts and culture overlap of proteins included in the pairwise comparison. Pairwise comparison identified several proteins of X. retroflexus with a significantly changed abundance between the mono-culture and either the four-species or the XS co-culture (Table 1). Notably, many of the proteins with significant changes in abundance were hypothetical proteins without known functions in the RAST or MEROPS database. When comparing the mono-culture to any of the two co-cultures, the same serine protease (S08A) was found to be significantly more abundant in the mono-cultures. An additional predicted protease was significantly more abundant in the mono-cultures when compared to the four-species co-culture (S08A / U69). Oppositely, a glutathionine peroxidase family protein was significantly more abundant for both co-cultures as compared to the mono-culture. From the four-species co-cultures, a nikel transport family protein (NikM) and a PQQ-dependent oxidoreductase, gdhB family protein were also found to be significantly increased.

Significant proteins (after FDR correction, padj < 0.05) were only observed between mono- and co-cultures of X.retroflexus-S.rhizophila and the four-species culture. Proteins are listed according to their genome reference name (Protein ID) with the log2 fold change between mono- and co-culture and the FDR corrected p-value of the paired two-sided t-test. Proteins are mapped with RAST subsystem function (Function) and MEROPS functions (MEROPS). a The first part of the Protein ID’s (fig|305959.5) were removed from the presented IDs.

Proteins with a nominal significantly increased abundance were observed from comparison of the XM and XP co-cultures to the X. retroflexus mono-cultures, but no proteins presented a significantly changed abundance after FDR correction. Among these nominal significant proteins, the predicted S08A / U69 protease and a M28B protease were more abundant for the X. retroflexus mono-cultures when compared to the XP co-cultures, supporting that X. retroflexus alone had increased abundance of secreted proteases. For the XP co-culture, the glutathionine peroxidase family protein was also found to be nominal significantly more abundant than in the mono-cultures.

Principal component analysis did not yield a complete group separation on the two main axes (PCA1: 47.69% and PCA2: 35.97%). However, a trend was observed with co-cultures of XM, XP and the four-species separating away from the XS co-culture and X. retroflexus mono-cultures (S17 Fig). Focusing on the top ten features causing group separation in either direction of PCA1 and PCA2, revealed a similar protein profile as presented by the supervised approach (S18 Fig). For instance, the three proteins causing the largest separation on PCA2 were proteases, including two serine proteases and a metallo-protease, supporting that a large difference between the X. retroflexus mono-culture and the majority of the co-cultures was related to the abundance of secreted proteases. The protein with the strongest impact on group separation on both PCA1 and PCA2 was a chitinase. However, the effect from the chitinase was mostly due to its fluctuating presence and absence between culture groups, and not its abundance-variation between groups, which was revealed by performing a binary principal component analysis. Oppositely, the effect of the proteases on PCA2 could not be attributed to mere presence and absence between groups.


Пайвандҳо

Department of Microbial Ecology, Netherlands Institute of Ecology, P.O. Box 50, Wageningen, 6700 AB, The Netherlands

Irene de Bruijn, Victor de Jager, Ruth Gómez Expósito & Jos M. Raaijmakers

Wageningen University and Research Centre, Laboratory of Phytopathology, P.O. Box 8025, Wageningen, 6700 EE, The Netherlands

Irene de Bruijn, Xu Cheng & Ruth Gómez Expósito

Departments of Pharmacology, Chemistry and Biochemistry Center for Marine Biotechnology and Biomedicine, Scripps Institution of Oceanography Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California at San Diego, La Jolla, San Diego, USA

Jeramie Watrous & Pieter C. Dorrestein

Department of Plant Biology & Pathology, Cook College, Rutgers, The State University of New Jersey, New Brunswick, NJ, 08901-8520, USA

Nrupali Patel & Donald Kobayashi

Wageningen University and Research Centre, Plant Research International, PO Box 16, Wageningen, 6700 AA, The Netherlands


W-JL, MX, WH, and S-XG designed the research and project outline. B-BL and M-ML performed the DNA extraction and physicochemical analysis. MN, Z-HL, and Z-YD performed the culture-dependent and culture-independent analyses. MN drafted the manuscript. Ҳама муаллифон дастнависи ниҳоиро хонданд ва тасдиқ карданд.

The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.

Funding. This work was financially supported by the Key Realm Rɭ Program of Guangdong Province (Grant No. 2018B020206001) and the National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32061143043, 91951205, and 31800001). The Scientific Investigation Voyage supported by Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Zhuhai). The authors are grateful to the Deanship of Scientific Research, King Saud University for funding through Vice Deanship of Scientific Research Chairs.


1. Муқаддима

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (пеш Actinobacillus actinomycetemcomitans) is a member of the Pasteurellaceae, a family of Gram-negative bacteria that includes many important human and animal pathogens. A. actinomycetemcomitans colonizes the human oral cavity and causes periodontitis and nonoral infections including endocarditis [1]. Clinical isolates of A. actinomycetemcomitans are known for their ability to form extremely tenacious biofilms on abiotic surfaces in vitro [2, 3]. Mutants that fail to form biofilms in vitro are unable to colonize the oral cavity of the rat or cause bone loss in a rat model of periodontitis [4, 5]. These findings suggest that biofilm formation is an important virulence factor in A. actinomycetemcomitans.

Tenacious biofilm formation by A. actinomycetemcomitans requires the production of adhesive, bundled, type IV pili (known as Flp-pili) that form on the surface of the cell [3, 6, 7]. Mutants that lack Flp-pili are deficient in surface attachment, autoaggregation, biofilm formation and colonization of the rat oral cavity [3, 5𠄷]. However, Flp-pili mutants still form weak biofilms on abiotic surfaces in vitro [6]. These findings indicate that additional adhesins mediate cohesion in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies. Interestingly, biofilms produced by a Flp-pili mutant strain were sensitive to detachment by DNase I [6], which suggests that extracellular DNA (eDNA) may function as a biofilm matrix adhesin in A. actinomycetemcomitans.

Another major component of the A. actinomycetemcomitans biofilm matrix is a hexosamine-rich polysaccharide that is functionally and genetically related to extracellular polysaccharide adhesins produced by Staphylococcus aureus, S. эпидермис, Escherichia coli ва Actinobacillus pleuropneumoniae [8]. These polysaccharides, usually referred to as PNAG, PIA (polysaccharide intercellular adhesin), or PGA, consist of linear chains of N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) residues in β(1,6) linkage (hereafter referred to as PGA). Various forms of PGA appear to differ in their molecular weight, in the degree of N-deacetylation of the GlcNAc residues, and in the presence of O-succinate substituents [9�]. PGA has been shown to play a role in abiotic surface attachment and intercellular adhesion [11�], protection from killing by antibiotics, antimicrobial peptides and phagocytes [12, 16], and virulence [17]. Дар A. actinomycetemcomitans, PGA has been shown to mediate intercellular adhesion and resistance to killing by the anionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS) [8, 18].

The purpose of the present study was to gain better insight into the structure, synthesis and function of A. actinomycetemcomitans PGA. We purified PGA polysaccharide from a biofilm-producing clinical strain of A. actinomycetemcomitans and analyzed its chemical structure by using NMR spectroscopy. We also investigated the genetics of PGA production and the role of PGA in biofilm cohesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans. In this report we present evidence that A. actinomycetemcomitans PGA is a β(1,6)-linked GlcNAc polymer that mediates intercellular adhesion and detergent resistance in A. actinomycetemcomitans biofilm colonies.


Surface Spreading Motility Shown by a Group of Phylogenetically Related, Rapidly Growing Pigmented Mycobacteria Suggests that Motility Is a Common Property of Mycobacterial Species but Is Restricted to Smooth Colonies

АНҶИР. 1 . Smooth and rough colonies of M. chubuense (А), M. gilvum (Б), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The images are representative of hundreds of colonies obtained through the study. АНҶИР. 2018-01-11 121 2 . SEM images of smooth colonies of M. chubuense (А), M. gilvum (Б), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. АНҶИР. 3 . SEM images of rough colonies of M. chubuense (А), M. gilvum (Б), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E). The right column shows the same sample as the left column but at greater magnification. These images are representative of the studies performed with six colonies of each species. АНҶИР. 4 . Spreading of smooth colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (Б) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. The right column shows pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. АНҶИР. 5 . Spreading of rough colonies on motility medium after 6 days of growth. (A) M. chubuense (Б) M. gilvum (C) M. obuense (D) M. parafortuitum (E) M. vaccae. Arrows indicate the external margins of the colonies. In the right column are pictures obtained with a binocular stereomicroscopy. These images are representative of the studies performed with 10 colonies of each species. АНҶИР. 6 . TLC images of chloroform-methanol extracts from M. vaccae (lanes 1 and 2), M. gilvum (lanes 3 and 4), M. obuense (lanes 5 and 6), M. chubuense (lanes 7 and 8), and M. parafortuitum (lanes 9 and 10). In the odd-numbered lanes, extracts are from smooth colonies, and in the even-numbered lanes, extracts are from rough colonies. TLC was developed with methanol-chloroform (90:10, vol/vol) and revealed with anthrone. Red spots indicate SP and SP-L. АНҶИР. 7 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (А), M. gilvum (Б), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to glass tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (*, П < 0.05 **, П < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&, П & lt 0.05). АНҶИР. 8 . Cellular adhesion of smooth and rough variants of M. chubuense (А), M. gilvum (Б), M. obuense (C), M. parafortuitum (D), and M. vaccae (E) strains to polystyrene tubes at 1, 2, 3, 4, and 7 days of incubation. The cellular adhesion level is expressed as the number of CFU/cm 2 . The results are expressed as means ± standard deviations obtained from triplicates. The results are representative of one out of three independent experiments. Cellular adhesion levels of smooth variants were significantly higher than those of rough variants (**, П < 0.01). Cellular adhesion levels of rough variants were significantly higher than those of smooth variants (&&, П & lt 0.05).


Видеоро тамошо кунед: . III Year. Synthetic dyes. Congo red. कग रड (Сентябр 2022).


Шарҳҳо:

  1. Michele

    Идеяи олӣ, бо шумо мувофиқ аст.

  2. Dontaye

    Be assured.

  3. Yozshulkis

    In my opinion, you admit the mistake. I can defend my position. Write to me in PM, we will handle it.

  4. Pajackok

    Ман табрик мекунам, ин танҳо як фикри олист

  5. Boyd

    Ин аҷиб аст, як порчаи муфид



Паём нависед