Маълумот

Механизми ҳатмии рамзи гистон бо пайвасти алтернативӣ кадомҳоянд?

Механизми ҳатмии рамзи гистон бо пайвасти алтернативӣ кадомҳоянд?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Баъзе мулоҳизаҳои биоинформатикӣ вуҷуд доранд, ки нишон медиҳанд, ки таносуби назарраси баъзеҳо байни коди гистон ва пайванди алтернативӣ вуҷуд дорад; аммо гипотеза дар бораи механизмҳои асосӣ чист? Оё дар ин масъала ягон фаҳмиши таҷрибавӣ вуҷуд дорад?


Тибқи адабиёт, ба назар чунин мерасад, ки нишонаҳои гистон ба пайвастшавӣ ҳам мустақим ва ҳам бавосита таъсир мерасонанд.

Чунин ба назар мерасад, ки танзими ғайримустақим бо сабаби монеаи биофизикӣ ба амал омадааст, ки дар он сохтори муайяни хроматин боиси сустшавии Pol-II мегардад ва имкон медиҳад, ки мошини ҷуфткунандагон кори худро иҷро кунанд.

Чунин ба назар мерасад, ки танзими мустақим аслан аз H3K36me3 ва H3K4me1 вобаста аст, ки аз ҷониби MRG15 эътироф шудаанд ва дар навбати худ танзимгари пайвасткунаки протеини пайвасткунандаи полипиримидинро ба ҷойҳои тақсимшавӣ ҷалб мекунанд.

Маълумот: Луко, РФ ва дигарон. Танзими пайвасткунии алтернативӣ бо тағир додани гистон. Илм 4 феврали 2010


Илми муосир назарияи эволютсиониро рад мекунад

Дар асоси коэффисиентҳои таносуби Пирсон, робитаҳои тасодуфии тағироти гистон дар ҷараёни пайвасткунии РНК тавассути сохтани шабакаҳои Байесии онҳо бароварда шуданд. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки дохил кардан ё хориҷ кардани экзонҳо аз намунаҳои комбинатори тағйироти гистон таъсир мерасонад. Баъзе тағиротҳои гистон мустақиман ба пайванди РНК мусоидат мекунанд (масалан, H3K36me3 ва H3K79me1), дар ҳоле ки дигар тағиротҳои гистон ба таври ғайримустақим ба пайванди РНК мусоидат мекунанд.

Натиҷае, ки H3K36me3 ва H3K79me1 метавонад ба ҷудошавии РНК таъсир расонад, бо таҳқиқоти қаблӣ мувофиқ аст, ки нишон доданд, ки H3K36me3 ва H3K79me1 дар экзонҳои дохилшуда ғанӣ шудаанд. H3K36me3 метавонад пайвастшавии алтернативии алтернативӣ тавассути ҳамкорӣ бо протеини ҳатмии полипиримидин (PTB) танзим кунад. Бо ҳамкорӣ бо домени Tudor аз TP53BP1, H3K79me1 инчунин гузориш дода шуд, ки бо он бо snRNP ҳамкорӣ мекунад.

Бо ором кардани сохтори хроматин, ацетилизатсияи H3 ва H4 инчунин барои танзими дохил кардан ё истисно кардани экзони гузариш гузориш дода шудааст. Ғайр аз тағиротҳои гистоне, ки дар минтақаҳои экзон ҷойгиранд, тағиротҳои гистоне, ки дар минтақаҳои интагенӣ ҷойгиранд, инчунин метавонанд ба ҷудошавии РНК тавассути танзими суръати дарозшавии RNAPII ё бевосита ҳатмӣ ба омилҳои пайвастшавӣ ва аз ин рӯ миёнаравии пайвастагии онҳо ба пеш аз мРНК таъсир расонанд. "

Шарҳи ман: Рамзи гистон як махзани мураккабест, ки қодир ба нигоҳ доштани маълумоти эпигенетикӣ мебошад, ки ба транскрипсияи ДНК, пайвастшавии пеш аз mRNA ва тағироти пас аз транскрипсияи mRNA таъсир мерасонад. Маълум аст, ки рамзи гистон хусусиятҳои организмро танзим мекунад. Бо истифода аз аломатҳои эпигенетикии гистон ҳуҷайраҳо метавонанд иттилооти рақамиро (маркер) ба маълумоти аналогӣ табдил диҳанд. Рамзи гистон нишондиҳандаи Кодекси интеллектуалии ҳаёт, иттилооти мураккаби биологист, ки аз ҷониби Офаридгори мо тарҳрезӣ шудааст. Рамзи гистонро нависандагон, хонандагон ва хаткӯркунакҳо нигоҳ медоранд, ки ба тарроҳии интеллектуалӣ ишора мекунанд. Аммо, механизми эволютсия вуҷуд надорад, зеро механизмҳои эпигенетикӣ танҳо иттилооти биологии қаблан мавҷудбударо танзим мекунанд. Гум нашавед.


Омӯзиши амиқи коди генетикии пайвастшавӣ (epi) механизми нави номзадро нишон медиҳад, ки тағироти гистонро бо қарори тақдири ESC пайваст мекунад

Пайвасткунии алтернативӣ (AS) як коркарди қабл аз mRNA аз ҷиҳати генетикӣ ва эпигенетикӣ танзимшаванда барои баланд бардоштани гуногунрангии транскриптом ва протеом мебошад. Рамзгузории ҳамаҷонибаи ин механизмҳои танзимкунанда ваъда медиҳад, ки дар бораи заминаҳои мухталифи биологии марбут ба AS, ба монанди рушд ва бемориҳо, амиқтар фаҳмед. Мо рамзи splicing (epi)-генетикӣ, DeepCode-ро барои дифференсиатсияи ҳуҷайраҳои ҷанинии инсон (hESC) бо роҳи ҳамгироии хусусиятҳои гетерогении пайдарпаии геномӣ, 16 модификацияи гистонӣ бо шабакаи амиқи нейронӣ ҷамъ овардем. Бо бартариҳои хусусиятҳои эпигенетикӣ, DeepCode иҷроишро дар пешгӯии намунаҳои пайвастшавӣ ва тағироти онҳо ҳангоми фарқияти hESC ба таври назаррас беҳтар мекунад. Дар ҳамин ҳол, DeepCode бартарияти хусусиятҳои эпигеномӣ ва нақшҳои бартаридоштаашонро дар рамзгузории намунаҳои AS нишон медиҳад ва зарурати ворид кардани хосиятҳои эпигенетикиро ҳангоми ҷамъоварии коди ҳамаҷонибаи васеътар нишон медиҳад. Гузашта аз ин, DeepCode имкон медиҳад, ки пешгӯиҳои боэътимодро дар байни наслҳои ҳуҷайра ва маҷмӯи додаҳо таъмин кунанд. Махсусан, мо як ҳодисаи тахминии AS-ро, ки бо H3K36me3 танзим мешавад, муайян кардем, ки боиси таназзули mRNA-и BARD1-и бемаънӣ мегардад. Коҳиш ёфтани ифодаи BARD1 боиси суст шудани фаъолияти сигнализатсияи ATM/ATR ва тафриқаи hESC мегардад. Ин натиҷаҳо механизми нави номзадро нишон медиҳанд, ки тағироти гистонро бо қарори тақдири HESC пайваст мекунанд. Илова бар ин, ҳангоми омӯзиш дар заминаҳои гуногун, DeepCode метавонад ба соҳаҳои мухталифи биологӣ ва биомедикӣ густариш ёбад.

© Муаллиф (ҳо) 2017. Нашр шудааст аз ҷониби Донишгоҳи Оксфорд Пресс аз номи тадқиқоти кислотаҳои нуклеинӣ.

Рақамҳо

Намоиши схемавии DeepCode. (…

Намоиши схемавии DeepCode. ( А ) Маълумоти сершумори баландсуръат ба…

DeepCode иҷрои корро дар…

DeepCode иҷрои корро дар рамзкушоии намунаҳои ҷуфтшавӣ беҳтар мекунад. ( А ) Хусусиятҳои эпигеномӣ…

DeepCode ҷанбаҳои гуногуни…

DeepCode ҷанбаҳои гуногуни саҳмҳои хусусиятҳои геномиро (epi) ифшо мекунад. ( А )…

Хусусиятҳои муҳимтарин ва DeepCode…

Хусусиятҳои муҳимтарин ва васлкунии DeepCode. ( А ) Намоишҳои пешгӯии…

DeepCode ҷамъшуда нишон медиҳад, ки…

DeepCode -и ҷамъшуда робитаи баландро бо коди генетикии қаблан ҷамъшуда нишон медиҳад ...

DeepCode имкон медиҳад, ки пешгӯии…

DeepCode имкон медиҳад, ки намунаҳои AS дар байни наслҳои рушд ва маҷмӯи додаҳо пешгӯӣ карда шаванд. (…

Баръакс BARD1 ба он пайваст карда шудааст ...

BARD1 ба таври алтернативӣ ба тафриқаи hESCs пайваст карда шудааст ва H3K36me3-ро бо сарнавишти ҳуҷайра мепайвандад ...


Имконоти дастрасӣ

Дастрасии пурраи маҷалларо дар тӯли 1 сол гиред

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.
ААИ баъдтар дар кассири илова карда мешавад.
Ҳисоби андоз ҳангоми пардохт анҷом меёбад.

Дастрасии вақти маҳдуд ё пурраи мақоларо дар ReadCube гиред.

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.


МУХОКИМА

AS ҳангоми рушди бофтаҳо ва тафриқаи ҳуҷайраҳо нақши муҳим мебозад [2, 38]. Таҳқиқоти қаблӣ якчанд механизмҳои танзимкунандаи AS -ро нишон медиҳанд, аз ҷумла ифода ва ҳадафи омилҳои пайвастшавӣ ва ғанисозии hPTM [38]. Дар ин таҳқиқот, мо кӯшиш кардем, ки мушоҳидаҳои қаблии робитаи байни hPTMs ва AS-ро ҳангоми рушди бофта тавассути ҳамгироии маълумоти ChIP-seq ва RNA-seq аз ҳафт бофтаи ҷанинии гуногуни муш дар шаш нуқтаи рушд ҳамаҷониба таҳқиқ кунем. Мо ду категорияи гуногуни экзонҳои AS-ро муайян кардем: экзонҳои марбут ба рушд ва гузарони экзонҳои марбут ба интихоби изоформ. Таҳлили онтологӣ нишон дод, ки генҳои ин ду категория дар вазифаҳои гуногун ғанӣ шудаанд. Генҳои AS, ки бо категорияи фоида/зиён дар мағзи пеш алоқаманданд, эҳтимолан дар категорияҳои функсионалии марбут ба нейронҳо, аз қабили проексияи нейрон, зичии постсинаптикӣ ва ситоскелет бой карда мешуданд. Ин бо таҳлили қаблии онтологии генҳо барои экзонҳои ба таври гуногун пайвастшуда дар таҳияи кортекси мағзи сар мувофиқ аст, ки нишон медиҳад, ки генҳои ситоскелетон дар муш ва инсон аз ҳад зиёд муаррифӣ шудаанд [41]. Аз тарафи дигар, генҳои AS, ки ба категорияи баланд/пасти изоформ тааллуқ доранд, дар категорияҳои алоҳидаи онтологӣ аз ҳад зиёд муаррифӣ карда мешаванд, ки барои нигоҳ доштани функсияи ҳуҷайра ё ҳувияти бофтаҳо муҳиманд, ба монанди сикли ҳуҷайра, интиқоли сафедаҳо ва пайвастагии РНК.

Моделҳои ҳисоббарорӣ, ки бар асоси сигнали ChIP-seq дар минтақаҳои канори экзонҳои гузаронидашуда сохта шудаанд, нишон доданд, ки hPTMҳо бо ҳарду категорияи экзони гузаронидашуда алоқаманданд. Мувофиқи таҳқиқоти қаблӣ, мо дарёфтем, ки H3K36me3 барои гурӯҳҳои экзони гузаронидашуда пешгӯӣ мешавад [37, 41]. Махсусан, ғанисозии H3K36me3 дар минтақаи паҳлӯи 5' макони пайвастшавӣ дар поёноб ва 3' макони пайвастшавӣ дар болооби экзони партофташуда пешгӯии боло дар ҳама бофтаҳо буд. Ин натиҷа инчунин дуруст буд, вақте ки мо экзонҳоро аз рӯи сатҳи ифодаи генҳо гурӯҳбандӣ кардем. Ҳангоме ки саҳмияҳои hPTM аз рӯи категорияи ифодаи генҳо гуногун буданд, H3K36me3 пайваста хусусиятҳои пешгӯии ҳама бофтаҳо ва нуқтаҳои вақт буд (Расми 5, Расми иловагии S68 -S71). Ин натиҷа қаблан дар дигар системаҳо гузориш дода шуда буд. Аввалан, таҳлили ҳисоббарории экзонҳои гузаронидашуда дар асоси 3 хатти ҳуҷайраҳои инсон нишон медиҳад, ки ғанисозии H3K36me3 дар экзон ва поёноби сайти 3 'пайвастшавӣ бо дохилкунии экзони гузаронидашуда робитаи назаррас дорад [43]. Дуюм, таҳлили эксонҳои инсон ва C. elegans exons H3K36me3 аз ҳама бештар дар 5 ′ охири экзон бой карда шудаанд (47). Ниҳоят, таҳлили қаблии мо дар аккументҳои ядроҳои муш нишон медиҳад, ки H3K36me3 дар изоформҳои алтернативӣ нисбат ба дигар hP TM -ҳо бузургтарин ғанисозӣ дорад [48]. Муносибати мо ин такмилдиҳӣ нисбат ба равишҳои қаблӣ дар асоси кластеркунӣ (49) бо роҳи миқёси ассотсиатсияҳои глобалӣ байни hPTM ва экзон сплинг ва саҳми онҳо мебошад. Дар якҷоягӣ бо бозёфтҳои мо, ин гузоришҳои қаблӣ як танзими имконпазирро нишон медиҳанд, ки тавассути он ғанисозии H3K36me3 ба интихоби алтернативии эксон дар AS мусоидат мекунад.

Бо истифода аз модели такрории тасодуфии ҷангал, мо минбаъд ҳамкориҳои байни якчанд hPTM -ро, ки бо интихоби экзони гузаронидашуда алоқаманданд, муайян кардем. Муносибати байни H3K36me3 ва H3K4me1 дар минтақаҳои паҳлӯи экзон хусусияти олӣ дар ҳам фоида/талафоти рушд ва ҳам изоформи интихобшудаи гурӯҳи баланд/паст буд. Ҳамкории дигар, ба монанди H3K27me3 ва H3K36me3, H3K27ac ва H3K36me3 ва H3K36me3 ва H3K9me3, нишон доданд, ки hPTM -ҳои нисбатан заифтари пешгӯишаванда танҳо дар якҷоягӣ бо хосиятҳои пешгӯишаванда метавонанд фаъол бошанд. Консепсияи ҳамкории hPTM нав нест. Якчанд тадқиқотҳо таъсири комбинатсияи тағирёбии гистонҳо ва робитаи онҳоро бо транскрипсия ва дифференсиатсияи генҳо муайян карданд. Масалан Хан ва дигарон. рамзкунонии муносибатҳои мутақобилаи тағирёбии гистон дар эксонҳо дар асоси шабакаи Bayesian [23]. Ҷолиб он аст, ки мо бисёр таъсироти мутақобилаеро пайдо кардем, ки дар байни минтақаҳои гуногуни паҳлӯи тағиротҳои якхела ё гуногуни гистон ба вуҷуд меоянд, ба монанди мутақобила байни H3K36me3 5′ болооб ва H3K36me3 3′ болооб ва байни H3K36me3 5′ поёноб ва H3K4me1 3′ болооб. Ин натиҷаҳо пешниҳод карданд, ки hPTM-ҳои дар мавқеъҳои мухталиф дар минтақаи канори экзон ҷойгиршуда метавонанд ба интихоби партофташудаи экзон ба таври гуногун саҳм гузоранд. Ин ба натиҷаи таҳқиқоти қаблӣ мувофиқ аст, ки нишон медиҳад, ки hPTM-ҳо бо ворид кардани экзонҳои партофташуда тавассути намунаҳои мушаххас дар баробари минтақаи паҳлӯи ин экзонҳо алоқаманданд (25). Аз ҷумла, H3K36me3 таносуби назарраси байни минтақаҳои болооб ва поёнии экзон барои сатҳи дохилшавии эксонро нишон медиҳад, ки бо бозёфтҳои мо мувофиқ аст.

Ғайр аз он, мо пайдоиши баъзе hPTM -ро дар якчанд экзонҳои гузаронидашуда дар бофтаҳои рушди нейронӣ аз як таҳқиқоти қаблӣ мушоҳида кардем [38], ки алоқаи потенсиалии механикии байни ин тағирот ва рушди бофтаҳои аз ҷониби AS (Ҷадвали иловагӣ S4) асосёфтаро нишон медиҳад. Таҳлили RNA-seq аз Чжан ва дигарон. нишон медиҳад, ки exonN ба кортекси мағзи сар ва мағзи сар дохил карда шудааст, аммо аз бофтаҳои асабӣ хориҷ карда шудааст. Ин ба хулосаи мо мувофиқ аст, ки сатҳи дохилшавии FLNA exonN дар тӯли давраи рушд дар майнаи пеш ба таври назаррас зиёд мешавад, аммо на дар ҷигар, дил ва дасту пой. Ҷолиб он аст, ки як тадқиқоти қаблӣ нишон медиҳад, ки мутатсияҳое, ки макони пайвастагии сафедаи ҳатмии полипиримидин (PTBP1) -и FLNA exonN-ро дар ҳуҷайраҳои насли нейрон вайрон мекунанд, боиси ихтилоли хоси майна дар инсон мегардад, ки нақши потенсиалии танзимкунандаи байни дохилшавии PTBP1 ва exonN-ро нишон медиҳад [41]. Дар ин тадқиқот мо мушоҳида кардем, ки сигнали H3K36me3 дар минтақаҳои канор бо воридшавии FLNA exonN дар мағзи пеш алоқаманд аст (Расми 7A, B), ки робитаи байни тағироти гистон, омилҳои ҷудошавӣ ва дохилшавии экзонро нишон медиҳад (Расми 7C). Ин мафҳумро бозёфтҳои қаблии Луко такмил медиҳанд ва дигарон., ки H3K36me3 метавонад мустақиман бо ҷузъҳои spliceosome барои танзими ифодаи алтернативии эксон дар хатҳои ҳуҷайраҳои инсон муошират кунад (50). Ниҳоят, таҳлили ғанисозии мотив дар минтақаҳои паҳлӯи экзонҳои фоида/зиён мотивҳоро муайян кард, ки дар экзонҳои алтернативии бофташуда дар байни бофтаҳои гуногун, аз ҷумла PTBP1 дар бофтаҳои марбут ба майна аз ҳад зиёд муаррифӣ карда шуда буданд, ки аломати эҳтимолии байни hPTM ва мотивҳои пайвасткуниро дар танзими экзони алтернативии пайвастшуда (Расми иловагӣ S72).

Алоқаи потенсиалии механикӣ байни тағирёбии гистон ва рушди бофта. (А) Намуди браузери Genome бойшавии H3K36me3 ва дохилшавии exonN -ро дар мағзи пеш, дил, ҷигар ва дасту пой нишон медиҳад. (Б.) Сатҳи дохилшавии exonN ба гени FLNA бо ғанисозии H3K36me3 ба таври назаррас алоқаманд буд. ($ C) Схема механизми потенсиалиро тасвир мекунад, ки тавассути он H3K36me3 дохилкунии exonN -ро танзим мекунад. H3K36me3 метавонад омили ҷудокунии PTBP1 -ро ҷалб кунад, ки минбаъд дохилшавии exonN -ро боздорад.

Алоқаи потенсиалии механикӣ байни тағирёбии гистон ва рушди бофта. (А) Намоиши браузери геном ғанисозии H3K36me3 ва дохилшавии exonN-ро дар майнаи пеш, дил, ҷигар ва дасту пой нишон медиҳад. (Б.) Сатҳи дохилшавии exonN ба гени FLNA бо ғанисозии H3K36me3 ба таври назаррас алоқаманд буд. ($ C) Схема механизми потенсиалиро тасвир мекунад, ки тавассути он H3K36me3 дохилкунии exonN -ро танзим мекунад. H3K36me3 метавонад омили ҷудокунии PTBP1 -ро ҷалб кунад, ки минбаъд дохилшавии exonN -ро боздорад.

Дар солҳои охир, моделҳои омӯзиши амиқ низ дар муайян кардани омилҳои эпигенетикӣ, ки бо ҷудошавии алтернативӣ ва ифодаи ген алоқаманданд, татбиқ карда мешаванд [51, 52]. Усулҳои омӯзиши амиқ махсусан бо шумораи зиёди хусусиятҳо ва мисолҳо муфид мебошанд ва методҳое, ки партурбация ё бозпас истифода бурданро (ақибгардонӣ) истифода мебаранд (53) метавонанд дар тафсири модел кумак кунанд. Равишҳои ба инертура асосёфта фазои воридотро, ки метавонанд натиҷаро тағйир диҳанд, аммо аз ҷиҳати ҳисоббарорӣ гаронтар бошанд, беҳтар мекунад, дар ҳоле ки усулҳои баргардонидани такрорӣ муассиранд, аммо эҳтимолан дар қобилияти муайян кардани маҷмӯи пурраи хусусиятҳои марбут ба натиҷа маҳдудтаранд (53). Хулоса, ин усулҳо пешгӯиҳои пурқувватанд, аммо шояд усулҳои мувофиқтарин набошанд, вақте ҳадаф фаҳмидани он аст, ки чаро вуруд бо натиҷа алоқаманд аст. Дар ин ҷо, мо хусусиятҳои нисбатан кам доштем, аз ин рӯ мо робитаи байни hPTM ва пайвастшавӣ бо, регрессияи логистикӣ ва моделҳои такрории тасодуфии ҷангалро, ки бо ҳадафҳои илмии мо мувофиқанд, омӯхтанд. Таҳқиқоти оянда, махсусан онҳое, ки асосан ба сохтани моделҳои пешгӯишаванда аз хусусиятҳои сатҳи пайдарпай нигаронида шудаанд, метавонанд аз омӯзиши амиқ манфиат гиранд.

Гарчанде ки модели мо робитаҳои эҳтимолиро байни hPTMs ва сплайсинги экзон муайян кардааст, он то ҳол маҳдудиятҳои муайян дорад. Аввалан, бидуни маълумоти вуруд, ба ҳисоби хониши ChIP на танҳо аз бойшавии hPTM дар маълумоти ChIP-seq, балки омилҳои дигар ба монанди контексти GC ва дастрасии хроматини минтақа таъсир расонида метавонанд. Бо вуҷуди ин, дар он ҷо тадқиқотҳои дигар қайд карданд, ки ислоҳ кардани таъсир бо истифодаи вуруди ChIP-seq ва ишғоли нуклеосомаҳо ба натиҷаи аввала чандон таъсире надорад ва бозёфтҳои асосӣ ҳоло ҳам нигоҳ дошта мешаванд [54]. Илова бар ин, дар айни замон, мо ба ғанисозии hPTM дар минтақаи паҳлӯи экзон тамаркуз мекунем, ки ин соҳа эҳтимолан ба модели ҷалби мустақим мувофиқ аст. Бо вуҷуди ин, ғанисозии hPTM минбаъд аз экзонҳо, дар промоутер, аз экзонҳои гуногун ё дар саросари ген, эҳтимол ба пайвастшавӣ низ мусоидат мекунад. Таҳлили минбаъда ин ассотсиатсияҳои дурро дар бар мегирад, ки барои назорат кардани садо ва номуайянии ба модел воридшуда параметрҳои иловагиро талаб мекунанд. Умуман, мо як таҳлили ҳамаҷониба анҷом додем, то ҳодисаҳои алтернативии ҷудошавии хроматинро ҳангоми рушди бофтаҳо таҳқиқ кунем. Бо истифода аз моделҳои ҳисоббарорӣ мо дарёфтем, ки тағироти мушаххаси гистон, H3K36me3 ва H3K4me1 дорои ассотсиатсияҳои мустаҳкамтарин дар интихоби экзони гузаронидашуда дар байни тамоми бофтаҳо ва нуқтаҳои вақти рушд мебошанд. Мо инчунин таъсири ду ё зиёда hPTM -ро муайян кардем, ки AS -ро хеле пешгӯӣ мекунанд. Масалан, таъсири мутақобилаи H3K36me3 ва H3K4me1 дар минтақаи канори экзон хусусияти олӣ дар ҳарду категорияи экзонҳои партофташуда буд. Ин бозёфтҳо мураккабии муайянкунии танзими AS -ро афзоиш доданд, ки он ба таҳқиқоти минбаъдаи таҷрибавӣ оид ба аҳамияти функсионалии ин тағирот ба пайвасткунии алтернативӣ хабар медиҳад.


Натиҷаҳо

Варианти пайвасткунии mUHRF1 локализатсияи тағирёфтаи зерядроӣ ва ҷалби H3K9me3 -ро нишон медиҳад

Таҳқиқоти қаблӣ дар бораи механизмҳои ҷалби UHRF1 ба хроматин ва талаботи доменҳои гуногуни UHRF1 барои метилизатсияи нигоҳдории ДНК натиҷаҳои мухолиф гузориш доданд. Масалан, дар ҳоле ки якчанд таҳқиқот нишон медиҳанд, ки ҳам доменҳои функсионалии TTD ва/ё PHD барои пайвастани хроматин, локализатсияи фокусии ядроӣ ва функсияи нигоҳдории метилизатсияи ДНК-и UHRF1 (7, 28, 30) заруранд, он то ҳол мавриди баҳс қарор дорад. кадом лиганд хроматин воқеан дар ҷалби UHRF1 иштирок мекунад: H3K9me2/3, TOP2A, LIG1 ё дигарон (7, 8, 31, 58). Ғайр аз он, натиҷаҳое, ки аз дигар тадқиқотҳо ба даст омадаанд, нишон медиҳанд, ки домени SRA ва ДНК -и гемиметилизатсияшуда муайянкунандаи асосии локализатсияи хроматини UHRF1 ва метилизатсияи нигоҳдории ДНК мебошанд (12, 20, 59-61). Гузориши дигар дар назар дорад, ки пайвасти ДНК аз ҷониби домени SRA барои локализатсияи хроматин муҳим аст, аммо қобилияти он барои мушаххасан эътироф кардани ДНК-и гемиметилизатсияшуда нест (22). Ду таҳқиқоти охирин нишон доданд, ки барои нигоҳдории метилизатсияи ДНК дар мушҳо (61) ё ҳуҷайраҳои саратони инсон (62) як TTD -и функсионалӣ лозим нест. Ин натиҷаҳои ба ҳам мухолиф метавонанд қисман аз сабаби мурғони UHRF1 (mUHRF1) ва сафедаҳои UHRF1 (hUHRF1) -и инсон ҳамчун ивазшаванда ҳисобида шаванд ва дар системаҳои гуногуни ҳуҷайра омӯхта шаванд, ки намудҳо на ҳама вақт мувофиқат мекарданд (7, 12, 20, 28, 30, 31, 59). Мо ошкор кардем, ки дар муш, пайванди алтернативии экзон ҳашт ду варианти гуногуни mUHRF1-ро ба вуҷуд меорад, ки танҳо дар минтақаи mLinker 2 байни доменҳои хонандаи mTTD ва mPHD тағирёбии гистон фарқ мекунанд. Мувофиқи номенклатураи NCBI, мо mUHRF1 V1 -ро ҳамчун варианте меномем, ки ба маълумоти мо аз ҷониби ҳама таҳқиқоти қаблӣ истифода шудааст. mLinker 2 V1 дар муқоиса бо варианти 2 (V2) дар маркази худ нӯҳ кислотаи аминокислота дорад. mLinker 2 V2, баръакс, ба hLinker 2 хеле монанд аст (Расми 1А).

Дар сурати мавҷуд набудани антителоҳое, ки ду сафедаи mUHRF1-ро фарқ карда метавонанд, мо маълумоти RNA-seq-ро аз марҳилаҳои гуногуни рушди муш ва бофтаҳои гуногуни калонсолон (мушҳои 8-сола) барои муайян кардани ифодаи чор намуди mRNA, ки ба ду варианти сафеда мувофиқанд, таҳлил кардем. Ҳарду вариант ҳамчун ду mRNA ифода карда мешаванд, ки ҳар кадоме аз 5′UTR-и худ фарқ мекунанд (mUHRF1 V1: Uhrf1–201 ва -204, mUHRF1 V2: Uhrf1–202 ва 203).Мо дарёфтем, ки mUHRF1 V1 изоформаи асосан ифодаёфта ҳам ҳангоми рушди ҷанин ва ҳам дар бофтаҳои калонсолон мебошад (Расми иловагӣ S1). Тавре ки аз нақши худ дар нигоҳдории метилизатсияи ДНК интизор аст, ифодаи mUHRF1 дар бофтаҳои дорои ҳуҷайраҳои фаъол ва зуд тақсимшаванда баландтар аст: рӯда, қисмҳои системаи масуният (тимус, мағзи устухон, испурч), инчунин гонадҳо ва узвҳои репродуктивӣ (ғадуди шир, пласента). Меъда ва рӯдаи дувоздаҳ ягона узвҳое мебошанд, ки дар муқоиса бо V1 ифодаи олии mUHRF1 V2 -ро нишон медиҳанд. Ҳуҷайраҳои ба таври ниҳоӣ фарқкунанда (мағзи сар, ҳуҷайраҳои мушакҳо, гурда, ҷигар) барои ҳарду варианти mUHRF1 сатҳи пасти то муайяннашавандаи mRNA нишон медиҳанд. Пайваста ҳама бофтаҳои инкишофёбандаи ҷанин (E11.5, E14) сатҳи баланди mUHRF1 -ро ифода мекунанд, ки бо камолоти ҷанин ва узвҳои он (E14, E14.5, E18) коҳиш меёбад (Расми иловагӣ S1).

Аз сабаби фарқиятҳои мушоҳидашуда дар профилҳои ифодаи вариантҳои пайвасткунии mUHRF1, мо фикр кардем, ки онҳо метавонанд хосиятҳои гуногуни биологӣ дошта бошанд. Мо аввал локализатсияи зерядроии ду варианти мури UHRF1 ва протеини инсонро таҳлил кардем ва фарзия кардем, ки ин метавонад функсияҳои мухталифро ошкор кунад. Мо ба таври муваққатӣ mCherry-ро дар баргҳои hUHRF1, mUHRF1 V1, V2 ё LacI дар хати ҳуҷайраҳои гуногуни инсон ва мурин ифода кардем. Ҳамоҳангсозии сафедаҳои mCherry-tagged бо минтақаҳои зичии DAPI ва H3K9me3 дар ядрои ин ҳуҷайраҳо бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ ва таҳлили минбаъда тавассути қитъаҳои шиддатнокии Фиджи тафтиш карда шуд (Расми 1В, Расми иловагии S2A). Барои истисно кардани таъсири ифодаҳои гуногун ба вариантҳои мушоҳидашуда дар тақсимоти зернуклеарӣ, мо консентратсияи муқоисашавандаи сафедаро дар сатҳи ансамблҳои фарҳанги ҳуҷайра тавассути блотинги ғарбӣ (Расми иловагӣ S2B) ва дар ҳуҷайраҳои инфиродӣ бо истифода аз таҳлили ситометрии ҷараён (Тасвирҳои иловагӣ S3 ва S4) тасдиқ кардем. Новобаста аз фарқиятҳо дар самаранокии трансфексия ва сатҳи глобалии ифодаи се сафеда дар системаҳои гуногуни ҳуҷайра, мо дар ҳама хатҳои ҳуҷайраҳои тафтишшуда намунаи такроршавандаро ёфтем (Расми 1B, C). Дар остеосаркоми одами U2OS, саратони сина инсон MCF7, ғадуди ширхори C127 ва ҳуҷайраҳои фибробласти муш NIH-3T3 мушакҳои хеле хурдтар ҳамоҳангсозии mCherry-hUHRF1 (мутаносибан 13%, 34%, 19%ва 13%) ва mCherry -ро нишон доданд. -mUHRF1 V2 (мутаносибан 10%, 21%, 23%ва 17%) бо H3K9me3 дар муқоиса бо mCherry-mUHRF1 V1 (мутаносибан 35%, 71%, 53%ва 36%). Дар асоси ин мушоҳидаҳо, мо ба хулосае омадем, ки ассотсиатсияи хроматинии ду сафедаи мурин ва муҷаррадони UHRF1 инсон фарқ мекунанд.

Таҳқиқоти қаблӣ пешниҳод карданд, ки TTD ва PHD (модули TTD-PHD) пайвастшуда локализатсияи зерядроӣ ва фаъолияти ubiquitylation UHRF1-ро танзим мекунанд. Аммо, аҳамияти домени TTD дар ҳадафгирии хроматинии UHRF1 ҳоло ҳам мавриди баҳс қарор дорад (7, 59, 61, 62). Азбаски мо дар муқоиса бо H3K9me3 фарқиятҳои назаррасро дар локализатсияи ядроӣ ёфтем, мо қафаси хушбӯйро дар домени mTTD (mTTD*: Y184A/Y187A) мутаносиб кардем ва EGFP-mUHRF1 V1 ва V2 WT ва TTD* -ро дар ҳуҷайраҳои C127 ва NIH-3T3 ( Расми 1D, Расми иловагӣ S5A). Бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ, мо ҳамоҳангсозии маҳаллии EGFP-ро бо H3K9me3 таҳлил кардем ва дарёфтем, ки мутацияи mTTD ҳамоҳангсозии mUHRF1 V1 бо H3K9me3 то сатҳи mUHRF1 V2 коҳиш ёфтааст (Расми 1E, Расми иловагии S5B). mUHRF1 V2 TTD* дар ҳарду хати ячейка ҳамоҳангсозии пасттарро бо H3K9me3 нишон дод. Ин натиҷаҳо нишон доданд, ки домени функсионалии mTTD барои локализатсияи mUHRF1 муҳим аст.

Шинохти H3K9me3 вариантҳои mUHRF1 аз рафтори фарқкунандаи mTTD вобаста аст

Барои гирифтани фаҳмиши минбаъда дар бораи механизми фарқиятҳои функсионалии байни mUHRF1 V1, V2 ва hUHRF1, мо таҷрибаҳои гистон-пептидро бо истифода аз лизатҳои ҳуҷайра аз mCherry-mUHRF1 V1, V2 ва -hUHRF1 ифодакунандаи ҳуҷайраҳо (U2OS ва MCF7) анҷом додем. Мо барқароршавии сафедаҳои UHRF1-ро дар се пептиди тағирёфтаи мувофиқ ба пасмондаҳои 1-20 аз думи H3 муқоиса кардем. Дар асоси дигар (6, 7, 9, 61, 63-66) ва (28) мушоҳидаҳои қаблии мо, мо оқилона кардем, ки пептиди тағирнаёфтаи H3 танҳо таъсири мутақобилаи аз PHD вобастаро барқарор мекунад, H3K9me3 ба TTD ва PHD мустақилона ё ду валентӣ бо ё бе синергизм, ва H3R2me2sK9me3 монеъ мешавад, аммо ба пуррагӣ монеъ намешавад, PHD-ҳатмӣ, дар ҳоле ки имкон медиҳад, ки ба эътирофи пептидҳои хоси метилатсия аз TTD вобаста бошад. Мо hUHRF1 ва mUHRF1 V1 -ро дар пептиди H3K9me3 афзалиятноктар ёфтем. Баръакси ин, mUHRF1 V2 нисбат ба ин пептид нисбат ба H3 бетағйир ва H3R2me2sK9me3 афзалияти камтар нишон дод (Расми 2A, B).

Шинохти H3K9me3 аз мавҷудияти TTD вобаста аст. (А) Озмоиши намояндагии гистон-пептид бо истифода аз иқтибосҳо аз mCherry-hUHRF1 ё -mUHRF1 ифодакунандаи ҳуҷайраҳои U2OS ва MCF7. Маводҳое, ки дар пептидҳои ғайримобилизатсияшуда ба даст омадаанд, бо блоки ғарбӣ таҳлил карда шуданд. HP1β ҳамчун назорат барои a хизмат мекунад воқеӣ H3K9me3-протеини ҳатмӣ. (Б.) Миқдори сигналҳои ғарқшавии зидди mCherry ғарбие, ки ба таҷрибаҳои дар (A) нишон додашуда нисбат ба пептиди ношоиста мувофиқанд. Маълумот ҳамчун миёна ва sd пешниҳод карда мешаванд. аз ду (H3R2me2sK9me3) ё се (H3 бетағйир, H3K9me3) таҷрибаҳои мустақил. ($ C) Силсилаи титркунии пептидҳои гуногуни H3 бо сафедаҳои флюоресцентӣ, рекомбинати UHRF1 бо термофорези микроскопӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна ба ҳисоби се таҷрибаи мустақил тартиб дода шудааст, ки хатҳои хато ба sd мувофиқанд. (Д) Протеинҳои рекомбинати UHRF1 бо истифода аз мононуклеосомаҳои рекомбинантии тағирнаёфта ё H3K9me3 ба таҳлилҳои E3 ubiquitin ligase дучор шуданд. Реаксияҳо тавассути blotting western таҳлил карда шуданд (боло). Сигналҳо барои UHRF1 ва сафедаҳои гистон дар мембранаи доғи ғарбӣ барои назорати боркунӣ (поён) нишон дода шудаанд. Мавқеъҳои иҷрокунандаи аломатҳои вазни молекулавӣ (аз чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (аз рост) нишон дода шудаанд. (Э) Миқдори сигналҳои зидди FLAG blot western, ки барои таҳлилҳои ubiquitination ба даст оварда шудаанд, тавре ки дар (D) нишон дода шудааст. Қиматҳои мутлақ бо истифода аз ImageJ чен карда шуданд ва ба сигнали нуклеосомаи H3unmod муқаррарӣ карда шуданд. Маълумот ҳамчун миёна ва ғайра пешниҳод карда мешаванд. аз чор (mUHRF1 V1, hUHRF1) ва ду (mUHRF1 V2) таҷрибаҳои мустақил. Донишҷӯён т-санҷиш (ҷуфт карда нашуда, ду думдор) барои муқоисаи намунаҳо гузаронида шуд (**) П & lt 0.01, (***) П & lt 0.001.

Шинохти H3K9me3 аз мавҷудияти TTD вобаста аст. (А) Озмоиши намояндагии гистон-пептид бо истифода аз иқтибосҳо аз mCherry-hUHRF1 ё -mUHRF1 ифодакунандаи ҳуҷайраҳои U2OS ва MCF7. Маводе, ки дар пептидҳои иммобилизатсияшуда барқарор карда шудааст, бо усули western blot таҳлил карда шуд. HP1β ҳамчун назорат барои a воқеӣ Протеини пайвасткунандаи H3K9me3. (Б.) Миқдори сигналҳои зидди mCherry blot western, ки ба таҷрибаҳое, ки дар (A) нишон дода шудаанд, нисбат ба пептиди иммобилизатсияшуда. Маълумот ҳамчун миёна ва ғайра пешниҳод карда мешаванд. аз ду (H3R2me2sK9me3) ё се (H3 бетағйир, H3K9me3) таҷрибаҳои мустақил. ($ C) Силсилаи титрии пептидҳои гуногуни H3 бо сафедаҳои флюоресценторшудаи UHRF1 бо термофорези микроскалалӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Д) Протеинҳои рекомбинати UHRF1 бо истифода аз мононуклеосомаҳои рекомбинантии тағирнаёфта ё H3K9me3 ба таҳлилҳои E3 ubiquitin ligase дучор шуданд. Реаксияҳо тавассути блоттинги ғарбӣ (боло) таҳлил карда шуданд. Сигналҳо барои UHRF1 ва сафедаҳои гистон дар мембранаи доғи ғарбӣ барои назорати боркунӣ (поён) нишон дода шудаанд. Мавқеи иҷрокунандаи нишондиҳандаҳои вазни молекулавӣ (чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (рост) нишон дода шудаанд. (Э) Миқдори сигналҳои блоки ғарбии зидди FLAG, ки барои таҳлили ҳамаҷониба ба даст оварда шудаанд, тавре ки дар (D) нишон дода шудааст. Арзишҳои мутлақ бо ёрии ImageJ чен карда шуда, ба сигнали нуклеосомаи H3unmod муқаррар карда шуданд. Маълумот ҳамчун миёна ва ғайра пешниҳод карда мешаванд. аз чор (mUHRF1 V1, hUHRF1) ва ду (mUHRF1 V2) таҷрибаҳои мустақил. Донишҷӯён т-санҷиш (ҷуфт карда нашуда, ду думдор) барои муқоисаи намунаҳо гузаронида шуд (**) П & lt 0.01, (***) П & lt 0.001.

Мо қаблан нишон дода будем, ки hUHRF1 дар ҳолатҳои гуногуни ҳатмии H3K9me3 дар ватанӣ (яъне лизати ҳуҷайра) бар зидди системаҳои рекомбинантӣ мавҷуд аст (28). Барои арзёбӣ кардан, ки оё тафовутҳои шабеҳ барои вариантҳои мурина вуҷуд доранд, мо рафтори ҳатмии пептидҳои сафедаҳои рекомбинантиро дар таҷрибаҳои термофорезии микроклассалӣ (MST) муқоиса кардем. Баръакси hUHRF1, протеинҳои рекомбинатии mUHRF1 V1 ва V2 дар муқоиса бо сафедаҳои ҳуҷайра як шакли пайвастшавии пептидро нишон доданд. Mouse V1 афзалияти ҳатмии ҳатмии H3K9me3 -ро нисбат ба ҳамтоёни тағирнашуда нишон дод (Расми 2C), ки эътирофи mTTD -ро пешниҳод мекунад (нигаред ба ҷадвали иловагии S1 барои рӯйхати ҳама К.Д арзишҳое, ки дар ин тадқиқот чен карда шудаанд). Ғайр аз он, он 20 маротиба кам шудани пайвастшавиро ба пептиди H3R2me2sK9me3 нишон дод, ки mUHRF1 V1 режими ҳатмии дувалентӣ ва синергетикиро муқаррар мекунад, ки дар он ҳам доменҳои mTTD ва mPHD бо ҳадаф алоқаманданд. Баръакси ин, mUHRF1 V2 барои H3K9me3 нисбат ба пептиди бетағйир афзалияти ҳатмӣ надошт. Он инчунин дар муқоиса бо пептиди H3K9me3 (Тасвири 2C) коҳиши хеле камтари мутақобила бо H3R2me2sK9me3 нишон дод. Ин пешниҳод кард, ки доменҳои mTTD ва mPHD дар mUHRF1 V2 новобаста аз ҳамдигар фаъолият мекунанд. Дар ин озмоишҳо, hUHRF1 нисбат ба H3K9me3 нисбат ба пептиди дучандон тағирёфта (H3R2me2sK9me3) нисбат ба тағирнашуда ва наздикии 10-маротиба заифтар ба тамғаи H3K9me3 нишон надод, ки ҳолати ҳатмии бартаридоштаи hPHD-ро тасдиқ мекунад.

Намунаҳои мушаххаси ҳатмии се сафедаи рекомбинантӣ дар системаи мустақили таҳлил бо истифода аз пептидҳои флуоресцентии N- ва C-терминалӣ нишондодашуда тасдиқ карда шуданд (поляризатсияи флуоресцентӣ, FP расми иловагии S6A). Илова бар ин, мо фаъолияти E3 ligase-и мурин ва UHRF1-и инсонро муқоиса кардем in vitro таҳлили ubiquitylation бо истифода аз субстратҳои нуклеосомӣ, ки дорои тағирнаёфта ё K9me3 H3 мебошанд. mUHRF1 V1 дар ubiquitylating H3 дар заминаи нуклеосомаҳои тағйирнашуда дар муқоиса бо V2 ва hUHRF1 фаъолтар буд (Расми 2D). Ин фаъолияти V1 дар нуклеосомаҳои H3K9me3 боз ҳам такмил дода шуд, дар ҳоле ки V2 ва hUHRF1 чунин ҳавасмандкуниро нишон надоданд (Расми 2D, E). Умуман, натиҷаҳои мо аз таҷрибаҳои ҳатмӣ бо сафедаҳои мобилӣ ва рекомбинантӣ, инчунин таҳлили ҳамаҷониба нишон медиҳанд, ки бинобар ҳолати гуногуни функсионалии доменҳои TTD, ду сафедаи варианти mUHRF1 V1 ва V2 аз ҳам фарқ мекунанд, инчунин аз hUHRF1 нисбат ба эътирофи H3K9me3 онхо.

Механизмҳои гуногуни молекулавӣ ҳолати функсионалии TTD-ро дар муринҳо ва UHRF1 инсон муайян мекунанд

Дар hUHRF1, як минтақаи полибазивӣ (hPBR) аз hLinker 4 ҳолати функсионалии hTTD-ро тавассути бастани чуқури рӯи пептид-ҳатмии он танзим мекунад (28, 67). Муқоисаи пайдарпайӣ нигоҳ доштани як ямоқи асосиро дар PBR сафедаҳои инсон ва мурин UHRF1 нишон дод (Расми иловагӣ S6B). Мо H3K9me3-пайвастшавии доменҳои mTTD ва hTTD-ро дар набудани ва мавҷудияти пептидҳои мувофиқи PBR муқоиса кардем. TTDҳои ҷудогона аз ҳарду намуд пайвастагии шабеҳро ба пептиди H3K9me3 нишон доданд (Расми 3А, Расми иловагии S6C). Тавре ки қаблан тавсиф шудааст, hPBR пайвастшавии hTTD-ро ба H3K9me3 манъ кард. Баръакс, mPBR ба таъсири мутақобилаи mTTD/H3K9me3 ягон таъсире надошт (Расми 3А, Расми иловагии S6D).

mTTD аз ҷониби mLinker 4/ mPBR танзим карда намешавад. (А) Силсилаи титратсияи рекомбинантӣ mTTD ва hTTD бо пептиди FAM-H3 (1–15) K9me3 бо ва аз ҳад зиёд молярии олигопептидҳои мувофиқ ба mPBR ё hPBR бо поляризатсияи флуоресценсионӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна ба ҳисоби се таҷрибаи мустақил тартиб дода шудааст, ки хатҳои хато ба sd мувофиқанд. (Б.) Протеинҳои рекомбинантӣ mPBR-RING ва hPBR-RING дар ҳалқаҳои магнитӣ беҳаракат карда шуда, бо mTTD-PHD V1, V2 ё hTTD-PHD инкубатсия карда шуданд. Воридоти сафедаҳо ва маводи ситонидашуда аз ҷониби ғарби блот таҳлил карда шуданд. Мавқеъҳои иҷрокунандаи аломатҳои вазни молекулавӣ (аз чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (аз рост) нишон дода шудаанд. ($ C) Силсилаи титркунии PI5P бо флюоресцентӣ нишондодашуда, рекомбинати mLinker 4 ё hLinker 4 тавассути термофорези микрошкала таҳлил карда шуд. Маълумот ба ҳисоби миёна ба ҳисоби се таҷрибаи мустақил тартиб дода шудааст, ки хатҳои хато ба sd мувофиқанд. (Д) Константаҳои диссоциатсия (К.Д) барои пайвастшавии пептидҳои H3K9me3 дар сурати мавҷуд набудани молярии 100-каратаи 16:0 PI5P нисбат ба сафедаҳои мурин ва сафедаҳои UHRF1-и инсон, ки бо термофорези микромикралӣ муайян карда мешавад. Натиҷаҳо ба ҳисоби миёна ҳадди аққал се озмоиши мустақилро нишон медиҳанд, ки ба хатҳои хатогӣ мувофиқанд.

mTTD аз ҷониби mLinker 4/ mPBR танзим карда намешавад. (А) Силсилаи титркунии рекомбинати mTTD ва hTTD бо пептиди FAM-H3(1-15)K9me3 бо ва бидуни молярии дукаратаи олигопептидҳои мувофиқ ба mPBR ё hPBR бо роҳи поляризатсияи флуоресцентӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Б.) Протеинҳои рекомбинатии mPBR-RING ва hPBR-RING дар маҳтобҳои магнитӣ immobilized ва бо mTTD-PHD V1, V2 ё hTTD-PHD инкубатсия карда шуданд. Воридоти сафедаҳо ва маводи ситонидашуда аз ҷониби ғарби блот таҳлил карда шуданд. Мавқеъҳои иҷрокунандаи аломатҳои вазни молекулавӣ (аз чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (аз рост) нишон дода шудаанд. ($ C) Силсилаи титркунии PI5P бо флуоресцент нишонгузоршуда, рекомбинант mLinker 4 ё hLinker 4 бо термофорези микроскалалӣ таҳлил карда шуд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Д) Константаҳои диссоциатсия (К.Д) барои пайвастшавии пептидҳои H3K9me3 дар сурати мавҷуд набудани молярии 100-каратаи 16:0 PI5P нисбат ба сафедаҳои мурин ва сафедаҳои UHRF1-и инсон, ки бо термофорези микромикралӣ муайян карда мешавад. Натиҷаҳо нишондиҳандаҳои миёнаи ҳадди аққал се таҷрибаҳои мустақилро нишон медиҳанд, ки сатри хатогиҳо ба s.d мувофиқат мекунанд.

Барои арзёбии ҳамкориҳои мустақим байни TTD-PHDs ва минтақаҳои C-терминали сафедаҳои гуногуни UHRF1, мо таҷрибаҳои иммунопреципитацияро анҷом додем. Мо дарёфтем, ки новобаста аз шабоҳатҳои пайдарпай, ҳамкории қавии PBR-RING бо TTD-PHD танҳо дар hUHRF1 мавҷуд аст, аммо на дар mUHRF1 V1 ва V2 (Расми 3B). Ин натиҷаҳо бо бақияи R649 одам мувофиқат мекунанд, ки нишон дода шудааст, ки ҷайби R-ро дар чуқури сатҳи hTTD ишғол мекунад (67), ки дар пайдарпаии mPBR нигоҳ дошта нашудааст (Расми иловагӣ S6B).

Мо қаблан нишон дода будем, ки фосфатидилинозитол 5-фосфат (PI5P) тавассути ҳамкорӣ бо hPBR hTTD-ро боз мекунад. Ин имкон медиҳад H3K9me3 эътирофи hUHRF1 (28). Барои санҷидани он, ки оё механизми танзимкунандаи шабеҳ дар mUHRF1 V1 ва V2 вуҷуд дорад, мо пайвастшавии PI5P-ро ба Linker 4-и PBR-и сафедаҳои гуногун бо истифода аз MST чен кардем. hLinker 4 пайваст PI5P бо a К.Д аз 1.4 μM (Расми 3C). Иловаи PI5P H3K9me3-пайвастагии hUHRF1-ро ба таври назаррас такмил дод, ки нишон медиҳад, ки бастани hTTD бо синергизми модули hTTD-PHD (расми 3D). Дар муқоиса бо протеини инсон, mLinker 4 танҳо ба PI5P наздикии заиф нишон дод.К.Д > 80 μM, Расми 3C). Инчунин, фосфолипид ба эътирофи тамғаи H3K9me3 аз ҷониби mUHRF1 V1 ва V2 ягон таъсире надошт (Расми 3D). Ғайр аз он ва дар муқоиса бо hUHRF1 (22, 60), мо пайвастшавии пептидҳои H3-и mUHRF1-ро ёфтем, ки на (V1) ё танҳо каме (V2) аз ДНК-и гемиметилшуда таъсир кардааст (маълумот нишон дода нашудааст). Дар асоси ин бозёфтҳо мо ба хулосае омадем, ки эътирофи тамғаи H3K9me3, ки ба TTD асос ёфтааст, дар вариантҳои mUHRF1 дар муқоиса бо hUHRF1 ба таври дигар муқаррар карда шудааст.

Пайвасткунии алтернативии mLinker 2 блокҳои mTTD H3K9me3-binding дар mUHRF1 V1

Азбаски ду варианти mUHRF1 танҳо дар ворид кардани нӯҳ кислотаи аминокислотаҳо дар mLinker 2 аз ҳамдигар фарқ мекунанд (Расми 1А), ин бояд сабаби рафтори гуногуни пайвастшавии H3-думи онҳо бошад. Барои муайян кардани таъсири mLinker 2 ба таъсири мутақобилаи mTTD ва mPHD бо пептидҳои H3, мо андозагирии миқдории FP-ро бо истифода аз пептидҳои C-or N-terminally fluorophore (FAM) бо тамғаи H3-trimethylated танзим кардем. Ҳангоме ки пептиди C-терминали H3 (H3unmod/K9me3-FAM) имкон медиҳад ҳатмии ҳам PHD ва ҳам TTD (вобаста ба ҳолати три-метилизатсияи K9), пептиди N-терминали H3K9me3 (FAM-H3K9me3) имкон медиҳад Ҳатмии вобаста ба TTD новобаста аз саҳми PHD (7, 28). Азбаски mLinker 4 дар танзими ҳолати функсионалии mTTD иштирок намекунад, мо ба модули ҷудогонаи mTTD-PHD тамаркуз кардем, то рафтори мухталифи H3K9me3-ҳатмии mUHRF1 V1 ва V2-ро таҳқиқ кунем. Тавре ки интизор мерафт, mTTD-PHD V1 пептидҳои бо C-терминал нишондодашударо бо бартарии H3K9me3 нисбат ба тағирнаёфта (К.Дs дар 4,9 ва 14,3 μM мутаносибан). Баръакси ин, mTTD-PHD V2 ҳарду пептидҳои бо C-терминал нишондодашуда бо наздикии шабеҳ мепайвандад (Расми 4А). Ҳангоме ки mTTD-PHD V2 ва hTTD-PHD бо пептиди N-мавзӯъи тамғаи FAM-H3K9me3 бо қувваи шабеҳ (К.Дs дар 12.3 ва 16.2 μM, мутаносибан), mTTD-PHD V1 танҳо пайвастагии хеле заифро нишон дод (К.Д & gt 300 μM, Расми 4B). Эҳтимол, воридкунӣ ба mLinker 2 V1 барои бастани пайвастагии ҷудошудаи mTTD-вобаста/ mPHD-мустақили H3K9me3 кифоя аст.

Пайвасткунии алтернативии mLinker 2 блокҳои mTTD H3K9me3-binding дар mUHRF1 V1. (А) Силсилаи титратсияи рекомбинантӣ mTTD-PHD V1 (чап) ва mTTD-PHD V2 (рост) бо пептидҳои H3 (1-15) -FAM ё H3 (1-15) K9me3-FAM бо поляризатсияи флуоресценция таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Б.) Таҷрибаҳои ҳатмии флуоресценсияи поляризатсия дар (A) -и сафедаҳои рекомбинантӣ бо пептиди FAM-H3 (1-15) K9me3. ($ C) Таҷрибаҳои ҳатмии поляризатсияи флуоресцентӣ ба монанди (A) аз mTTD-PHD V1 TTD* бо H3(1–15) тағйирнаёфта-FAM, H3(1-15)K9me3-FAM ё FAM-H3(1-15)K9me3 пептидҳо.

Пайвасткунии алтернативии mLinker 2 блокҳои mTTD H3K9me3-binding дар mUHRF1 V1. (А) Силсилаи титркунии рекомбинати mTTD-PHD V1 (чап) ва mTTD-PHD V2 (рост) бо пептидҳои H3(1–15) тағирнаёфта-FAM ё H3(1–15)K9me3-FAM тавассути поляризатсияи флуоресцентӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Б.) Таҷрибаҳои ҳатмии поляризатсияи флуоресцентӣ ба монанди (A) сафедаҳои рекомбинатии зикршуда бо пептиди FAM-H3(1-15)K9me3. ($ C) Таҷрибаҳои ҳатмии поляризатсияи флуоресцентӣ ба монанди (A) аз mTTD-PHD V1 TTD* бо H3(1–15) тағйирнаёфта-FAM, H3(1-15)K9me3-FAM ё FAM-H3(1-15)K9me3 пептидҳо.

Барои санҷиши минбаъдаи ин, мо нӯҳ кислотаи аминокислотаҳои mLinker 2 V1-ро ба модули hTTD-PHD (hTTD-PHD, mLinker2 V1*) ворид кардем. Дар муқоиса бо намуди hTTD-PHD, сафедаи гибридӣ дар пайвастагии пептидҳои FAM-H3K9me3 (К.Д > 100 мкм, Расми 4B). Баръакси ин, таъсири мутақобила бо пептидҳои C-терминалӣ нишондодашудаи H3 таъсир нарасонд (Расми иловагӣ S7A, B).

Барои тасдиқи он, ки mTTD-и функсионалӣ дар пайвастагии пептиди mTTD-PHD V1 мушоҳида мешавад, мо мутанти қафаси хушбӯйи онро (Y184A/Y187A) таҳлил кардем. Тавре ки интизор мерафт mTTD-PHD V1 TTD* бо H3K9me3-FAM нисбат ба H3unmod-FAM пайванди мустаҳкамтар нишон дода натавонист.Ҳамчунин, ҳамкории кам бо пептиди FAM-H3K9me3, ки наметавонад mPHD-ро пайваст кунад, пурра аз даст рафт (Расми 4C). Дар маҷмӯъ, ин бозёфтҳо нишон доданд, ки воридкунии mLinker 2 ба mUHRF1 V1 эътирофи мустақили mPHD пептиди H3K9me3 аз ҷониби mTTD-ро манъ мекунад, аммо ҳамзамон ҳолати мутобиқати модули mTTD-PHD-ро муқаррар мекунад, ки имкон медиҳад пайванди синергетикӣ ба пептиди H3K9me3 имконпазир гардад. .

Модулҳои mTTD-PHD V1 ва V2 сохторҳои гуногуни домен ва рафтори динамикиро намоиш медиҳанд

Барои гирифтани маълумоти бештар дар бораи тартиботи мухталифи мутобиқати модулҳои mTTD-PHD V1 ва V2, ки аз in vitro таҷрибаҳои ҳатмӣ, мо ба анҷом додани таҳқиқоти сохторӣ бо истифода аз парокандагии кунҷи рентгении хурд (SAXS) ва спектроскопияи NMR равона шудем. Мо қаблан мушоҳида карда будем, ки модули ҷудошудаи hTTD-PHD дорои ҳаракати ҷудонашавандаи динамикӣ мебошад, ки бо миёнаравии hLinker 2 ва ҳамкории муваққатии он бо чуқури сатҳи hTTD ва R-pocket (68) амал мекунад. Вобаста аз гирифтани бақияи R296 пасмондаи hLinker 2 дар ҷайби R, ё синергетикӣ (R296 ба R-кисагӣ пайваст) ё режими пептидҳои H3 мустақил (R296 ройгон) H3 мушоҳида шудааст (7, 65, 68) .

Бо назардошти фарқиятҳои асосӣ дар пайдарпаӣ ва дарозии Linker 2 дар сафедаҳои гуногуни мурин ва UHRF1 инсон, мо баррасӣ кардем, ки оё ин хосиятҳои гуногуни сохторӣ ва динамикии модулҳои дахлдори TTD-PHD-ро ба вуҷуд меорад. Мо таҳлили SAXS-и mTTD-PHD V1 ва V2 (Расми иловагӣ S7C, D, Ҷадвали S2) анҷом додем ва профилҳои парокандаи онҳоро бо профили hTTD-PHD муқоиса кардем (68). Мо як равиши ансамблро истифода бурдем, ки дар он каҷҳои SAXS бар зидди сохторҳое, ки аз моделсозии молекулавӣ гирифта шудаанд, барои муайян кардани як зермаҷмӯи конформатсияҳои TTD-PHD, ки бо маълумоти таҷрибавӣ мувофиқанд, насб карда шудаанд. Якчанд ҳазор конформерҳои модулҳо бо истифода аз моделиронии динамикаи молекулавӣ ва моделсозии ҷисми сахт барои тахмин кардани фазои конформатсияи онҳо тавлид карда шуданд. Сипас усули SES (55) барои ёфтани ансамбли оптималии конформаторҳо, ки бо профилҳои пароканда мувофиқ буданд, истифода шуд. Дар мавриди mTTD-PHD V1, ансамбли оптималӣ комилан аз конформатсияҳои паймон иборат буд, ки дар он ҷо mLinker 2 ба чуқури сатҳи mTTD пайваст мешавад (расми 5А). Барои mTTD-PHD V2 ва hTTD-PHD, баръакс, ансамблҳои оптималии онҳо боиси бимодал шуданд Рg тақсимот, бо далели ҳамоҳангсозии паймон ва васеъ, ки дар он пайвандак аз чуқури mTTD ҷойгир карда шудааст.

Таҳлили сохтории модулҳои mTTD-PHD V1 ва V2. (А) Тақсимоти Рg бо моделсозии молекулавӣ дар якҷоягӣ бо профилҳои SAXS -и mTTD-PHD V1 (чап), mTTD-PHD V2 (миёна) ва hTTD-PHD (рост) муайян карда мешавад. Хати рахна ҳавзи ибтидоии сохторҳоро, ки аз моделсозии молекулавӣ ба даст омадаанд, нишон медиҳад хати сахт ансамблҳои бо SAXS муҷаҳҳазшудаи конформерҳои TTD-PHD-ро нишон медиҳад. (Б.) Қабати спектрҳои (1 H– 15 N) HSQC (дар масофаи марказ) -и mTTD-Linker 2 V1 (сурх) ва V2 (сабз). Резонансҳо барои сафедаи V1 таъин карда шуданд (85% пурра ва дар BMRB гузошта мешаванд (ID 30704)). Як қабати пурраи спектралӣ дар расми иловагии S8B оварда шудааст. ($ C) Муқоисаи тағироти кимиёвии амид дар спектрҳои (1 H– 15 N) HSQC аз mTTD-Linker 2 V1 ва mTTD-Linker 2 V2. Резонансҳои такрорӣ (кабуди ранга) ба сохтори mTTD-Linker 2 V1 харит карда мешаванд. Инҳо берун аз интерфейси linker-groove ва TTD локализатсия карда шудаандН.-ТТД$ C узв. (Д) Ансамблҳои сохтории NMR аз mTTD-Linker 2 V1 (чап, PDBID: 6VEE) ва hTTD-Linker 2 (рост, PDBID: 6VED), ки мавқеи нисбии минтақаҳои Linker 2-ро нисбат ба TTD нишон медиҳанд. (Э) Сохтори аз NMR гирифташудаи mTTD-Linker 2 V1 бо тасвири сатҳи mTTD дар хокистарӣ ва mLinker 2 V1 дар сабз. R298 (қаҳваранг-муаррифии чӯб) -и mLinker 2 V1 ба ҷайби R пайваст карда шудааст (кабуд). P-patch (яъне P293, P294 ва P295) бо сурх ранг карда шудааст. mLinker 2 V2 (гулобӣ) нисбат ба сатҳи mTTD дар ҷараён қарор дорад, ки тасвири аксбардории аз моделсозии молекулавӣ гирифташуда нишон дода шудааст, ки дар болои R-кисса R293 (афлесун-чӯб) нишон дода шудааст. (Ф) Сохтори NMR таъсири мутақобила байни mLinker 2 V1 (сабз, боқимондаҳо бо сиёҳ нишон дода шудаанд) ва mTTD (хокистарӣ, боқимондаҳо бо кабуд нишон дода шудаанд). Намоиши рӯизаминӣ бо пасмондаҳои гидрофобӣ (кабуд) ва кислотаӣ (гулобӣ), ки R-кисаи ишғолкардаи R298-ро ишора мекунад, дар тарафи чап нишон дода шудааст. Пайвастҳои гидрогенӣ (хатҳои сиёҳи рахна), ки таъсири мутақобилаи mLinker 2 V1-mTTD-ро мӯътадил мегардонанд (болотар аз P-патч: NA288- ОN134, НY136— ОL286, НQ292— ОS289 ва дар поёноби P-patch: NH2R298- ОД1D138, NH2R298- ОД2D138, Н.R298- ОЕ2E149, NH1R298- ОW147, НT300- ОЕ2E186) дар тасвири чӯб дар миёна ва рост нишон дода шудаанд. (Г.) (1 H– 15 N) титркунии HSQC аз mTTD-Linker 2 V1 (чап) ва V2 (рост) бо 4-бензилпиперидин-1-карбоксимамид (BPC) дар таносубҳои гуногуни молярӣ.

Таҳлили сохтории модулҳои mTTD-PHD V1 ва V2. (А) Тақсимоти Рg бо моделсозии молекулавӣ дар якҷоягӣ бо профилҳои SAXS аз mTTD-PHD V1 (аз чап), mTTD-PHD V2 (миёна) ва hTTD-PHD (рост) муайян карда мешавад. Хати рахна ҳавзи ибтидоии сохторҳоро, ки аз моделсозии молекулавӣ ба даст омадаанд, нишон медиҳад хати сахт ансамблҳои бо SAXS муҷаҳҳазшудаи конформерҳои TTD-PHD-ро нишон медиҳад. (Б.) Қабати спектрҳои (1 H– 15 N) HSQC (дар масофаи марказ) -и mTTD-Linker 2 V1 (сурх) ва V2 (сабз). Резонансҳо барои сафедаи V1 таъин карда шуданд (85% пурра ва дар BMRB гузошта мешаванд (ID 30704)). Қабати пурраи спектралӣ дар расми иловагии S8B оварда шудааст. ($ C) Муқоисаи тағирёбии амидҳои кимиёвӣ дар (1 H– 15 N) HSQC спектрҳои mTTD-Linker 2 V1 ва mTTD-Linker 2 V2. Резонансҳои такрорӣ (кабуди ранга) ба сохтори mTTD-Linker 2 V1 харит карда мешаванд. Инҳо берун аз интерфейси linker-groove ва TTD локализатсия карда шудаандН.-ТТД$ C пайванд (Д) Ансамблҳои сохтории NMR mTTD-Linker 2 V1 (чап, PDBID: 6VEE) ва hTTD-Linker 2 (рост, PDBID: 6VED), ки мавқеи нисбии минтақаҳои Linker 2-ро нисбат ба TTD нишон медиҳанд. (Э) Сохтори аз NMR гирифташудаи mTTD-Linker 2 V1 бо тасвири рӯизаминии mTTD бо ранги хокистарӣ ва mLinker 2 V1 бо ранги сабз. R298 (қаҳваранг-муаррифии чӯб) -и mLinker 2 V1 ба ҷайби R пайваст карда шудааст (кабуд). P-patch (яъне P293, P294 ва P295) бо сурх ранг карда шудааст. mLinker 2 V2 (гулобӣ) нисбат ба сатҳи mTTD дар ҷараён қарор дорад, ки тасвири аксбардории аз моделсозии молекулавӣ гирифташуда нишон дода шудааст, ки дар болои R-кисса R293 (афлесун-чӯб) нишон дода шудааст. (Ф) Сохтори NMR таъсири мутақобила байни mLinker 2 V1 (сабз, боқимондаҳо бо сиёҳ нишон дода шудаанд) ва mTTD (хокистарӣ, боқимондаҳо бо кабуд нишон дода шудаанд). Намоиши рӯизаминӣ бо пасмондаҳои гидрофобӣ (кабуд) ва кислотаӣ (гулобӣ), ки R-кисаи ишғолкардаи R298-ро ишора мекунад, дар тарафи чап нишон дода шудааст. Вомбаргҳои гидроген (хатҳои сиёҳшуда), ки таъсири мутақобилаи mLinker 2 V1-mTTD-ро устувор мекунанд (дар болооби P-patch: NА288— ОN134, Н.Y136- ОL286, Н.Q292— ОS289 ва дар поёноби P-patch: NH2R298- ОД1D138, NH2R298- ОД2D138, Н.R298-OE2E149, NH1R298- ОW147, НT300- ОЕ2E186) дар тасвири чӯб дар миёна ва рост нишон дода шудаанд. (Г.) (1 H– 15 N) титркунии HSQC аз mTTD-Linker 2 V1 (чап) ва V2 (рост) бо 4-бензилпиперидин-1-карбоксимамид (BPC) дар таносубҳои гуногуни молярӣ.

(1 H– 15 N) спектрҳои TROSY NMR аз 15 N нишонгузоршудаи mTTD-PHD V1 ва V2 дар ҷойҳои куллии куллӣ фарқияти назаррасро нишон доданд (Расми иловагӣ S8A). Спектрҳои фарқкунандаи TROSY-ро ба эффектҳои сохтории маҳаллӣ, ки дар натиҷаи ворид кардан ба mLinker 2 V1 ба вуҷуд омадаанд, мансуб донистан мумкин набуд, аммо нишон дод, ки дар ҳамоҳангсозии mTTD-PHD V1 ва V2 фарқиятҳои глобалӣ вуҷуд доранд. Андозаи калони модулҳои mTTD-PHD ва майлияти онҳо ба консентратсияҳо барои таҷрибаҳои NMR (200 μM) ба сифати нисбатан пасти спектр оварда расонданд ва онҳо барои супоришҳои пурраи резонанс мувофиқ набуданд. Бо мақсади такмил додани спектрҳои mTTD-PHD, мо 15 N-тамғаи mTTD-Linker 2 -и V1 ва V2 (Расми 5B, Расми иловагии S8B, C) ва инчунин mPHD (Расми иловагии S8D, E) омода кардем. . Муқоисаи спектрҳои mTTD-PHD, mTTD-Linker 2 ва mPHD (Расми иловагӣ S8D, E, G, H) ду тамоюл мушоҳида карда шуданд: (i) профилҳои қуллаи mPHD дар mTTD-PHD нисбат ба mPHD ва (ii) mTTD- Профилҳои қуллаи Linker 2 дар доираи mTTD-PHD нисбат ба mTTD-Linker 2 каме тағйир ёфтанд. Ин мушоҳидаҳо нишон доданд, ки mPHD бо mTTD ё mLinker 2 дар модулҳои mTTD-PHD мутақобила намекунад ва ҳамкории Linker 2 бо mTTD дар нигоҳдорӣ нигоҳ дошта мешавад. ҳам контексти mTTD-Linker 2 ва mTTD-PHD. Ҳангоми муқоисаи спектрҳои hTTD-Linker 2, hPHD ва hTTD-PHD (мо барои он қаблан таъиноти сутунмӯҳра муайян карда шуда будем, (68)) мо ҳамин гуна тамоюлро мушоҳида кардем (Расми иловагии S8I). Муқоисаи 1 H-15 N HSQC спектрҳои mTTD-Linker 2 V1 ва V2 фарқияти назаррасро бо & lt50% қуллаҳо дар ҷойҳои такрорӣ нишон дод (Расми 5В, Расми иловагии S8B, C). Резонансҳое, ки якдигарро мепайванданд, танҳо берун аз интерфейси linker-groove ва TTD ҷойгир карда шудаандН.- ТТД$ C пайвандак (расми 5С). Бори дигар, ин нишон дод, ки mLinker 2 V1 ва V2 намудҳои гуногуни ҳамкориро бо mTTD нишон медиҳанд, ки ба хусусиятҳои гуногуни сохторӣ ва динамикии модулҳои дахлдори mTTD -PHD оварда мерасонад.

Мо тавонистем сутунмӯҳра ва резонансҳои паҳлӯии mTTD-Linker 2 V1-ро пурра таъин кунем ва сохтори ҳолати ҳалли онро муайян кунем (PDBID: 6VEE, Расми 5D– F, Расми иловагии S8L, Ҷадвали S3). Сохтори mTTD ба сохторҳои қаблан гузоришшуда аз NMR ва кристаллии hTTD хеле монанд аст ((6) PDBID: 2L3R). Боқимондаҳои калидии хушбӯйро, ки қафаси ҳатмии K9me3-ро ташкил медиҳанд, нигоҳ дошта мешаванд, инчунин ҷайби амиқи кислотаи R, ки дар чуқури рӯи дар ҳамбастагии ду домени тудор мавҷуданд (расми 5F). Ҷолиб он аст, ки мо якчанд NOE-ҳои дарозмуддатро дар спектрҳои NOESY байни резонансҳои mLinker 2 V1 ва mTTD мушоҳида кардем (Расми иловагӣ S8J, K). Ансамбли сохтории натиҷавӣ як мутақобилаи хуб муайяншудаи байни mLinker 2 V1 ва mTTD махсусан нишон медиҳад, R298 дар кисаи R ҷойгир аст (Расми 5D- F). Аз сабаби мушкилоти ҷамъоварӣ, мо натавонистем резонанси mTTD-Linker 2 V2-ро пурра таъин кунем ва сохтори онро муайян кунем. Аммо, ҳамчун нуқтаи иловагии муқоиса, мо hTTD-Linker 2-ро пурра таъин кардем ва сохтори ҳалли онро ҳисоб кардем (PDBID: 6VED, панели рости тасвири 5D, Расми иловагӣ S8L, Ҷадвали S3). Дар муқоиса бо mTTD-Linker 2 V1, мо хеле ками NOE-ҳои дарозмуддатро байни hLinker 2 ва hTTD мушоҳида кардем (Расми иловагӣ S8J). Ансамбли сохторӣ дар муқоиса бо чуқури сатҳи hTTD, ки бо таҳқиқоти қаблии hTTD-PHD [68] мувофиқ аст, hLinker 2-и вайроншуда ва бетартибро нишон дод.

Барои тасдиқи минбаъдаи динамикаи дифференсиалии Linker 2 дар mUHRF1 V1 ва V2, мо титркунии HSQC сафедаҳои mTTD-Linker 2 бо 4-бензилпиперидин-1-карбоксимамид (BPC) гузаронидем. BPC дар экрани мураккаби hUHRF1 муайян карда шуд ва бо ҷайби R муошират карда шуд [68]. Маълумоти титркунӣ сатҳҳои гуногуни ҳамкориҳои сатҳи чуқури mTTD-Linker 2-ро барои V1 ва V2 ба таври возеҳ нишон додааст. Резонансҳои mTTD-Linker 2 V1 ҳангоми илова кардани BPC ҳеҷ гуна изтироби сменавии кимиёвӣ (CSPs) нишон надоданд ва тасдиқ мекунанд, ки R298 дар ҷайби R мавқеи устуворро қабул мекунад, ки пайвастшавии пайвастагиро пешгирӣ мекунад (Расми 5G). Баръакси ин, CSP-ҳо бо сабаби ҳатмии BPC ба mTTD-Linker 2 V2 мушоҳида карда шуданд, ки маънои ҷамъшавии конформатсияҳоро дорад, ки дар он чуқури сатҳи ва R-кисаи он кушода мешавад.

PHDs дар муш ва UHRF1 инсон сохторҳои ба ҳам монандро қабул мекунанд. Мо сохтори ҳалли mPHD (PDBID: 6VFO, Тасвири иловагии S8F, Ҷадвали S3) муайян кардем ва онро бо сохтори қаблан гузоришшудаи NMR-и apo-hPHD муқоиса кардем (64). Ҳарду муш ва PHD-и инсон бо минтақаи паймонаи каноникии ҳатмии гистонии C-терминал тавсиф карда мешаванд, ки ду иони руҳро ҳамоҳанг мекунанд (Расми иловагӣ S8F) RMSD шоҳроҳи hPHD ва mPHD дар ин минтақа ∼1.3 Å аст. PHDҳо дар ҳарду организм инчунин як минтақаи ҳалқаи N-терминали чандир доранд, ки "пеш аз PHD" номида мешавад, ки барои пайваст кардани гистон муҳим ба назар намерасад ва иони сеюми руҳро ҳамоҳанг мекунад (Расми иловагӣ S8F).

Дар охири таҳлили сохтории худ, мо нишон додем, ки R298 аз mLinker 2 V1 ба кисаи mTTD R зич пайваст мешавад. Ғайр аз он, сохтори mTTD-Linker 2 V1 нишон дод, ки се пролини (P-патч: P293, P294 ва P295) воридкунии mLinker 2 як кандаро ташкил медиҳанд, ки бо чуқури сатҳи mTTD тамосҳои иловагӣ эҷод мекунанд (Расми 5E, F). Баръакси ин, mLinker 2 V2 танҳо ба таври муваққатӣ бо чуқури сатҳи mTTD муошират мекунад, ки дар натиҷа озодии конформатсионии модули mTTD-PHD хеле зиёд мешавад. Мисли R296 дар hUHRF1, R293-и мувофиқи mLinker 2 кисаи R-ро устувор ишғол намекунад (Расми 5E).

P-patch ва R298 дар mLinker 2 V1 барои бастани TTD вобаста ба H3K9me3 муҳиманд

Мо қаблан муайян карда будем, ки пайвасти H3 ба hTTD дар алоҳидагӣ табиати таркибӣ дорад ва (i) қафаси хушбӯйи hTTD ба K9me3 ва (ii) пайванди чуқури сатҳи hTTD/R-киса ба K4 (6). Агар ҷайби R баста ё ишғол карда шавад, ҳамкории hTTD бо пептиди H3K9me3 ба таври назаррас суст мешавад (6, 28). Барои тасдиқи он, ки рафтори динамикии mLinker 2 V1 ва V2 барои рафтори дифференсиалии mTTD H3-ҳатмӣ масъул аст, мо таҳлили NMR гузарондем. Титркунии mTTD-Linker 2 V1 бо пептиди H3K9me3 ягон CSP-и назаррасро нишон надод (Расми 6A). Ин бо робитаи зичи mLinker 2 V1 бо чуқури рӯизаминии mTTD ва ҷойгиршавии устувори R298 дар кисаи R мувофиқ буд ва ба ин васила дастрасии H3K4-ро бозмедорад ва потенсиали ҳамкории композитиро аз байн бурд (Расми 6B). Аммо, вақте ки mTTD-Linker 2 V2 бо пептити H3K9me3 титр карда мешуд, CSPҳои намоён мушоҳида карда шуданд (Расми 6A). Натиҷаҳо боз тасдиқ карданд, ки дар ин замина ҷайби mTTD R барои пайвастани пептидҳои таркибӣ муваққатан дастрас аст.

mLinker 2 V1 чуқури рӯи ва R-кисаи mTTD-ро блок мекунад. (А) (1 H– 15 N) HSQC титрҳои mTTD-Linker 2 V1 (чап) ва V2 (рост) дар ҳузури пептиди H3 (1-15) K9me3 бо таносубҳои гуногуни молярӣ ба даст оварда шудаанд. (Б.) Сохтори аз NMR гирифташудаи mTTD-Linker 2 V1 бо тасвири сатҳи mTTD дар хокистарӣ ва mLinker 2 V1 дар сабз. P-patch (яъне P293, P294 ва P295) mLinker 2 V1 бо сурх ранг карда шудааст. R-кисса (кабуд) -ро R298 ишғол мекунад (магина-намояндагии чӯб). Модел мавқеи тахминии H3K9me3-дум (зард) -ро дар сатҳи mTTD нишон медиҳад, ки аз таҳлили маҷмӯи hTTD/H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R) гирифта шудааст. Боқимондаи K9me3 аз H3-дум қафаси хушбӯй ва H3K4 кисаи R-ро ишғол мекунад. Аммо, азбаски R298 аз mLinker 2 V1 (сабз) ба ҷайби R устувор пайвастааст ва чуқури сатҳи он ишғол шудааст, H3K9me3 бо mTTD ҷудошуда дар mUHRF1 V1 баста мешавад. ($ C) Силсилаи титратсияи рекомбинантҳои mTTD-PHD V1 WT ва R298A (R298*), P293A/P294A/P295A (P-patch*) ва K302A/S303A (K302/S303*) мутант бо FAM-H3 (1–15) )К9ме3 пептид бо рохи поляризацияи флуоресцентй тахлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Д) Таҷрибаҳои ҳатмии поляризатсияи флуоресцентӣ тавре ки дар (C), вале бо истифода аз рекомбинати mUHRF1 V1 WT, R298*, P-patch*, K302/S303* ё P293A/P294A/P295A/L297A/R298A (P-patch/R8/) N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (RS*), P293A/P294A/P295A/R298A/N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (P-патч/RS*A9A9/R229A/P229A/P229A/P229A/P29A/P294A/P295A/R298A/ Протеинҳои N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (mLinker 2 V1*).

mLinker 2 V1 чуқури рӯизаминӣ ва R-кисаи mTTD-ро маҳкам мекунад. (А) (1 H– 15 N) Титратсияҳои HSQC-и mTTD-Linker 2 V1 (чап) ва V2 (рост) дар ҳузури пептидҳои номбарнашудаи H3(1-15)K9me3 дар таносуби молярии гуногун ба даст оварда шудаанд. (Б.) Сохтори аз NMR гирифташудаи mTTD-Linker 2 V1 бо тасвири сатҳи mTTD дар хокистарӣ ва mLinker 2 V1 дар сабз. P-patch (яъне P293, P294 ва P295) -и mLinker 2 V1 бо сурх ранг карда шудааст. Дар ҷайби R (кабуд) R298 (магента - намояндагии чӯб) ишғол мекунад. Модел мавқеи тахминии H3K9me3-дум (зард) -ро дар сатҳи mTTD нишон медиҳад, ки аз таҳлили маҷмӯи hTTD/H3K9me3 ((6) PDBID: 2L3R) гирифта шудааст. Боқимондаи K9me3 аз H3-дум қафаси хушбӯй ва H3K4 кисаи R-ро ишғол мекунад. Аммо, азбаски R298 аз mLinker 2 V1 (сабз) ба ҷайби R устувор пайвастааст ва чуқури сатҳи он ишғол шудааст, H3K9me3 бо mTTD ҷудошуда дар mUHRF1 V1 баста мешавад. ($ C) Силсилаи титратсияи рекомбинантҳои mTTD-PHD V1 WT ва R298A (R298*), P293A/P294A/P295A (P-patch*) ва K302A/S303A (K302/S303*) мутант бо FAM-H3 (1–15) ) Пептиди K9me3 бо поляризатсияи флуоресценция таҳлил карда шуд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Д) Таҷрибаҳои ҳатмии поляризатсияи флуоресцентӣ тавре ки дар (C), вале бо истифода аз рекомбинати mUHRF1 V1 WT, R298*, P-patch*, K302/S303* ё P293A/P294A/P295A/L297A/R298A (P-patch/R8/) N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (RS*), P293A/P294A/P295A/R298A/N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (P-patch/RS*) ва P293A/P2A/P29A/P29AA N299A/T300A/G301A/K302A/S303A (mLinker 2 V1*).

Тавре ки аз тадқиқоти сохторӣ пешгӯӣ карда шуд, мутацияи R298 (R298*: R298A) ва P-patch (P-patch*: P293A/P294A/P295A) боиси афзоиши назарраси пайвастагии mTTD-PHD V1 ба пептиди FAM-H3K9me3 гардид дар муқоиса бо сафедаи навъи ваҳшӣ, ки аз ҷониби FP чен карда шудааст (Расми 6C) ва пешниҳоди дастрасии баландтари чуқури сатҳи пептидии mTTD/R-pocket. Баръакси ин, мутатсияи пасмондаҳои K302/S303 (K302/S303*: K302A/S303A), ки дар Linker 2-и mUHRF1 V1, V2 ва hUHRF1 (Расми 1А) ҳифз шудаанд, ягон таъсире надошт. Ҳангоми озмоиши ҳамон мутатсияҳо дар заминаи mUHRF1 V1, ин таъсирҳо камтар возеҳтар буданд (Расми 6D). Бо вуҷуди ин, мутатсияҳои пасмондаҳои иловагӣ дар mUHRF1 V1 Linker 2 пайвастшавии FAM-H3K9me3-ро фаъол карданд. Ин на танҳо тавассути мутацияи воридкунии мукаммал (mLinker 2 V1*: P293A/P294A/P295A/L297A/R298A/N299A/T300A/G301A/K302A/S303A), балки бо тағироти на он қадар вазнин ба монанди RS* ( R298A/N299A/T300A/G301A/K302A/S303A), P-patch/R* (P293A/P294A/P295A/L297A/R298A) ва P-patch/RS* (P293A/P294A/P295A/R295A/R295A/R29A G301A/K302A/S303A) (Расми 6D). Мо аз ин мушоҳидаҳо хулоса кардем, ки P-patch ва R298 барои ҳарчанд устувор ҷойгир кардани mLinker 2 дар сатҳи mTTD ва барои бастани пайвастагии H3K9me3 кифоя нестанд.

Вуруди Linker 2 аз ҷониби модули mTTD-PHD шинохти синергетикии H3K9me3 -ро осон мекунад

Барои муайян кардани он, ки оё ассотсиатсияи устувори mLinker 2 V1 бо mTTD воқеан ҳолати синергистии пептидҳои H3K9me3-ро ба вуҷуд меорад, мо таъсири пептидҳои C-терминали FAM-H3-ро бо тағирнашудаи H3K9me3 бо дарозии пурраи mUHRF1 V1, V2 ва V1 Linker 2 чен кардем мутантҳо. Мо пешгӯӣ карда будем, ки мутацияи воридкунии Linker 2, ки онро аз сатҳи mTTD иваз мекунад, хусусияти ҳатмии H3K9me3 -и mUHRF1 V1-ро бекор мекунад. Дар ҳақиқат, мутатсияҳои R298*, P-patch/R* ва R-S* нисбат ба сафедаи WT пайванди заифтар ба пептиди H3K9me3-FAM нишон доданд. Ҳамзамон, ҳамкорӣ бо пептити H3unmod-FAM таъсир нарасонд (Расми 7A). Ҳамзамон бо кам шудани пайвастшавӣ ба K9me3 H3-tail, фаъолияти ҳамаҷонибаи сафедаҳои мутантии mUHRF1 V1 низ то сатҳи mUHRF1 V2 коҳиш ёфт (Расми 7B). Натиҷаҳо ақидаеро дастгирӣ карданд, ки воридкунӣ ба mLinker 2 V1 ҳамоҳангии байни mTTD ва mPHD -ро роҳбарӣ мекунад. Вайрон кардани ассотсиатсияи mTTD-Linker 2 mTTD-ро аз mPHD ҷудо мекунад, ки ба усулҳои мустақили шинохти пептидҳо оварда мерасонад (тавре ки дар mUHRF1 V2 дида мешавад).

Ворид кардани mLinker 2 V1 ба шинохти синергетикии H3K9me3 аз ҷониби модули mTTD-PHD V1 мусоидат мекунад. (А) Силсилаи титратсияи рекомбинантӣ mUHRF1 V1 WT, R298A (R298*), P293A/P294A/P295A (P-patch*), P293A/P294A/P295A/L297A/R298A (P-patch/R*/3/R293A) /G301A/K302A/S303A (RS*) ва mUHRF1 V2 WT бо пептидҳои H3 тағир наёфта- (чап) ва H3K9me3-FAM (рост) бо термофорези микроскалалӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Б.) Протеинҳои рекомбинантии (A) ба таҳлили лигазаҳои E3 ubiquitin ligase бо истифода аз мононуклеосомаҳои H3K9me3 гузаронида шуданд. Реаксияҳо тавассути блоттинги ғарбӣ (боло) таҳлил карда шуданд. Сигналҳо барои UHRF1 ва сафедаҳои гистон дар мембранаи доғи ғарбӣ барои назорати боркунӣ (поён) нишон дода шудаанд. Мавқеъҳои иҷрокунандаи аломатҳои вазни молекулавӣ (аз чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (аз рост) нишон дода шудаанд. ($ C) Тасвирҳои конфокалии намояндагии ҳуҷайраҳои мурғи NIH-3T3, ки ифодаҳои гуногуни MUHRF1 V1 ва V2 WT ва сафедаҳои мутантиро (EGFP, канали сабз) ифода мекунанд. Барои H3K9me3 (канали сурх) рангкунии иммунофлуоресцентӣ анҷом дода шуд. Рангкунии DAPI ба ДНК (канали кабуд) ишора мекунад. Тасвирҳои якҷояшуда ҳар се каналро ҳамзамон нишон медиҳанд. Сатҳи миқёс: 10 мкм. (Д) Ҳамоҳангсозии сафедаҳои EGFP-tagged тавре, ки дар (C) бо минтақаҳои H3K9me3 ва DAPI зич нишон дода шудааст, ба таври визуалӣ арзёбӣ карда шуд ва нисбат ба шумораи умумии ҳуҷайраҳои мусбати EGFP мусбат ҳисоб карда мешавад (н > 70).

Ворид кардани mLinker 2 V1 ба шинохти H3K9me3 аз ҷониби модули mTTD-PHD V1 мусоидат мекунад. (А) Силсилаи титркунии рекомбинати mUHRF1 V1 WT, R298A (R298*), P293A/P294A/P295A (P-патч*), P293A/P294A/P295A/L297A/R298A (P-патч/RA809/R29/), /G301A/K302A/S303A (RS*) ва mUHRF1 V2 WT бо пептидҳои H3 тағир наёфта- (чап) ва H3K9me3-FAM (рост) бо термофорези микроскалалӣ таҳлил карда шуданд. Маълумот ба ҳисоби миёна аз се таҷрибаҳои мустақили панҷараҳои хатогӣ ба s.d мувофиқат мекунанд. (Б.) Протеинҳои рекомбинатии (A) бо истифода аз мононуклеосомаҳои рекомбинатии H3K9me3 ба таҳлилҳои E3 ubiquitin ligase дучор шуданд. Реаксияҳо тавассути блоттинги ғарбӣ (боло) таҳлил карда шуданд. Сигналҳо барои UHRF1 ва сафедаҳои гистон дар мембранаи доғи ғарбӣ барои назорати боркунӣ (поён) нишон дода шудаанд. Мавқеъҳои иҷрокунандаи аломатҳои вазни молекулавӣ (аз чап) ва сафедаҳои гуногуни муайяншуда (аз рост) нишон дода шудаанд. ($ C) Тасвирҳои конфокалии намояндагии ҳуҷайраҳои мурғи NIH-3T3, ки ифодаҳои гуногуни MUHRF1 V1 ва V2 WT ва сафедаҳои мутантиро (EGFP, канали сабз) ифода мекунанд. Рангкунии иммунофлуоресценсия барои H3K9me3 (канали сурх) гузаронида шуд. Рангкунии DAPI ба ДНК (канали кабуд) ишора мекунад. Тасвирҳои якҷояшуда ҳар се каналро дар як вақт нишон медиҳанд. Сатҳи миқёс: 10 мкм. (Д) Якҷоякунии сафедаҳои бо нишони EGFP, ки дар (C) нишон дода шудааст, бо минтақаҳои зичии H3K9me3 ва DAPI ба таври визуалӣ арзёбӣ карда шуд ва нисбат ба шумораи умумии ҳуҷайраҳои EGFP-мусбат графикӣ карда шудааст (н > 70).

Дар ниҳоят, мо пурсидем, ки оё вайрон кардани синергетика байни mTTD ва mPHD аз ҷониби мутатсияи mLinker 2 V1 барои таъсир расонидан ба ҳадафи ҳуҷайравии mUHRF1 V1 ба H3K9me3 кифоя аст. Мо EGFP-mUHRF1 V1 WT, R298*, P-patch/R* ва R-S*, инчунин EGFP-mUHRF1 V2 WT-ро дар ҳуҷайраҳои C127 ва NIH-3T3 муваққатан аз ҳад зиёд ифода кардем. Бо истифода аз микроскопияи конфокалӣ, мо дарёфтем, ки дар ҳарду хати ҳуҷайра ҳама се мутация дар mLinker 2 V1 боиси камшавии маҳаллисозии mUHRF1 V1 ба фокусҳои H3K9me3 шуда, ба маҳаллисозии mUHRF1 V2 тақлид мекунанд (Расми 7C, D, Расми иловагии S9 -S11). Мо ба хулосае омадем, ки пайвасти синергетикии гистон аз ҷониби mTTD ва mPHD, ки тавассути воридкунии mUHRF1 V1 Linker 2 муқаррар шудааст, барои пешбурди локализатсияи мушаххаси зерядроии mUHRF1 V1 зарур аст. Набудани синергия ё тавассути набудани воридкунӣ (mUHRF1 V2) ё мутацияи R298 боиси маҳаллисозии нисбатан паҳншудаи mUHRF1 шуд, ки ба H3K9me3 нигаронида нашудааст. Ҷолиб ва баръакси P-patch/R* ва R-S*, R298* синергияи байни mTTD ва mPHD-ро вайрон кард, аммо чуқури сатҳи mTTD-ро барои пайвасткунии H3 озод накард (Расмҳои 6D ва 7A). Ин нишон дод, ки фарқиятҳо дар локализатсияи зерядроӣ воқеан аз пайвастагии синергистии mTTD ва mPHD дар mUHRF1 V1 ба вуҷуд меоянд, аммо на V2.


Реферат

Соатҳои сиркадианӣ механизмҳои эндогенӣ мебошанд, ки сигналҳои муҳити зистро ба иттилооти муваққатӣ барои тавлиди ритми 24-соата дар метаболизм ва физиология тарҷума мекунанд. Функсияи сиркадианӣ ба танзими дақиқи ифодаи генҳои ритмикӣ дар маркази осциллятор такя мекунад, ки фаъолияти транскрипсияи геномро дар амалан дар ҳама организмҳои бисёрҳуҷайраи то имрӯз тафтишшуда муваққатан модул мекунад. Далелҳои пайдошуда дар растаниҳо як мутақобилаи хеле мураккаби байни шаклҳои сиркадии ифодаи генҳо ва тағироти ритмикӣ дар ремоделизатсияи хроматин ва тағирёбии гистонро нишон медиҳанд. Пайвасткунии алтернативии прекурсорҳои RNA (pre-mRNA) низ ба наздикӣ ҳамчун сутуни бунёдӣ дар системаи циркадӣ муайян карда шудааст, ки пластикӣ ва мушаххасоти заруриро барои танзими дақиқи соати сиркадианӣ таъмин мекунад. Ин бознигарӣ муносибати байни соати сиркадиании растаниро бо ҳам азнавсозии хроматин ва ҳам пайвасткунии алтернативӣ нишон медиҳад ва шабоҳатҳо ва фарқиятҳоро бо таҳқиқоти шабеҳ дар системаҳои циркадиании ҳайвонот муқоиса мекунад.

Нишондиҳандаҳо

► Алоқаи байни ифодаи генҳои циркадӣ ва тағироти ритмикӣ дар азнавсозии хроматин. ► Пайвасткунии алтернативӣ барои танзими дақиқи соати сиркадӣ пластикӣ ва мушаххасотро таъмин мекунад. ► Далелҳои пайдошуда механизмҳои наверо, ки барои танзими пеш аз, ҳамоҳангӣ ва пас аз транскрипсияи ифодаи генҳои циркадӣ масъуланд, нишон медиҳанд.


Тағиротҳои гистоне, ки аз фаъолият ба вуҷуд омадаанд, пайвастшавии Neurexin-1 mRNA ва нигоҳдории хотираро идора мекунанд

Механизмҳои эпигенетикӣ ташаккул, муттаҳидсозӣ ва азнавсозии хотираҳоро танзим мекунанд. Аммо, роҳи сигнализатсия аз фаъолсозии нейронҳо то тағироти эпигенетикӣ дар доираи гардиши мағзи марбут ба хотира номаълум боқӣ мемонад. Мо гузориш медиҳем, ки омӯзиш тағироти дарозмуддати гистонро дар нейронҳои фаъолкунандаи хотираи гиппокампалӣ барои танзими устувории хотира водор мекунад. Фаъолияти нейронӣ тағироти дер-зуд дар интихоби изофформаи Nrxn1 дар сайти пайвандкунӣ 4 тавассути ҷамъ кардани як нишондиҳандаи репрессивии гистон H3K9me3, барои танзими раванди пайвастшавӣ ба вуҷуд меорад. Фосфоризатсияи вобаста ба фаъолии p66α тавассути киназаи протеини AMP-фаъолшуда HDAC2 ва Suv39h1-ро барои таъсиси нишондиҳандаҳои репрессивии гистон ҷалб мекунад ва пайвастагии нейронҳои фаъолшударо тағйир медиҳад. Хориҷ кардани Suv39h1 гузариш вобаста ба фаъолиятро дар интихоби изоформаи Nrxn1 бекор кард ва устувории хотираҳои муқарраршударо коҳиш дод. Мо як раванди мустақили ҳуҷайраҳоро барои ҳифзи хотира кашф мекунем, ки дар он нейронҳои марбут ба хотира тавассути тағирёбии гистоне, ки аз фаъолият ба вуҷуд омадаанд, қобилияти дубора пайваст кардани онҳоро оғоз мекунанд.


Нақши динамикӣ барои тамғаҳои гистон дар пайвасткунии алтернативии вобаста ба EMT

(Александр Сегелле ва Жан-Филипп Вилемин)

Ҳангоми EMT, тағироти маъруф дар пайвасткунии алтернативӣ мавҷуданд, ки метавонанд дар аввали EMT ё дертар дар марҳилаҳои охирини раванди дубора барномасозӣ рух диҳанд. Ғайр аз он, мо бисёре аз ин генҳои алтернативии ҷудошударо пайдо кардем, ки бо тағирёбии хроматин танзим карда мешаванд ва саволеро ба миён меоранд, ки робитаи динамикии байни ду қабати танзимкунанда чист. Дар ин лоиҳа, мо маълумоти эпигеномика ва транскриптомияи умуми геномро бо методологияҳои классикии биологияи молекулавӣ муттаҳид хоҳем кард, то тағирот дар хроматин ва lncRNA-ҳоро бо тағирот дар пайвастшавӣ ҳангоми EMT муайян ва мутақобила кунем. Ҳамчун далели ниҳоии нақши ин аломатҳои гистонӣ дар сплайсинги аз EMT вобаста, мо системаи CRISPR/dCas9-ро барои таҳрир кардани экзони эпигеном ба таври мушаххас мутобиқ месозем ва таъсирро ба пайванди алтернативӣ месанҷем.

Бо мурури замон (T0, T1, T6, T21 рӯзҳо) тағироти куллии геномӣ дар пайвасткунии алтернативӣ, сатҳҳои ифодаи lncRNAs ва сатҳи ғанисозии тағирёбии гистон ҳангоми таъсис ва нигоҳдории як барномаи нави пайвасткунии махсуси EMT, мо танзимгарони навро муайян хоҳем кард Пайвастшавӣ, ки минбаъд бо равишҳои механикии бештар омӯхта мешаванд.


Мундариҷа

Пайвастшавии алтернативӣ бори аввал соли 1977 мушоҳида шуда буд. [9] [10] Аденовирус панҷ транскрипти ибтидоиро дар аввали давраи сироятии худ, пеш аз репликатсияи вируси ДНК ва як нусхаи дигарро баъд аз оғоз шудани репликатсияи ДНК мебарорад. Транскриптҳои ибтидоии ибтидоӣ пас аз оғози репликатсияи ДНК истеҳсол карда мешаванд. Транскрипти иловагии ибтидоӣ, ки дер вақти сироят тавлид шудааст, калон аст ва аз 5/6 геноми 32 кб аденовирус меояд. Ин аз ҳама гуна mRNA-ҳои инфиродии аденовирус дар ҳуҷайраҳои сироятшуда хеле калонтар аст. Муҳаққиқон дарёфтанд, ки транскрипти ибтидоии РНК, ки аз ҷониби аденовируси 2 дар марҳилаи охир тавлид шудааст, бо роҳҳои гуногун паҳн карда шудааст, ки дар натиҷа mRNA -ҳо сафедаҳои гуногуни вирусиро рамз мекунанд. Илова бар ин, стенограммаи ибтидоӣ сайтҳои сершумори полиаденилизатсияро дар бар мегирад, ки барои mRNA-ҳои коркардшуда 3' нуқтаҳои гуногун медиҳанд. [11] [12] [13]

Дар соли 1981, намунаи аввалини пайванди алтернативӣ дар транскрипт аз гени муқаррарӣ ва эндогенӣ тавсиф карда шуд. [11] Гене, ки калситонин гормони сипаршаклро рамзгузорӣ мекунад, ба таври алтернативӣ дар ҳуҷайраҳои ширхӯрон пайваст карда шудааст. Транскрипти ибтидоӣ аз ин ген дорои 6 экзони кальцитонин mRNA дорои экзонҳои 1-4 мебошад ва пас аз макони полиаденилизатсия дар экзони 4 ба охир мерасад. Аз ин пеш аз мРНК як гузариши экзони 4 мРНК-и дигар ҳосил мешавад ва экзонҳои 1-3, 5-ро дар бар мегирад , ва 6. Он сафедаеро, ки бо номи CGRP маълум аст, рамзгузорӣ мекунад (пептид бо генҳои калситонин). [14] [15] Намунаҳои пайванди алтернативӣ дар транскриптҳои генҳои иммуноглобин дар ширхӯрон дар аввали солҳои 1980 низ мушоҳида шуда буданд. [11] [16]

Аз он вақт инҷониб, пайвастагии алтернативӣ дар эукариотҳо дар ҳама ҷо пайдо шудааст. [1] "Рекорддор" барои пайванди алтернативӣ а D. меланогастер ген бо номи Dscam, ки эҳтимолан метавонад 38,016 варианти ҷудошавӣ дошта бошад. [17]

Дар соли 2021, маълум шуд, ки геноми аденовируси навъи 2, аденовирусе, ки дар он бори аввал сплайсинги алтернативӣ муайян карда шудааст, қодир буд, ки нисбат ба пештар гумоншуда навъҳои бештари mRNA-ро тавлид кунад. [18] Бо истифода аз технологияи пайдарпаии наслҳои оянда, муҳаққиқон тавонистанд транскриптоми аденовируси одами 2-ро навсозӣ кунанд ва як мРНК-и аҷиби 904-ро, ки вирус тавассути намунаи мураккаби пайвасткунии алтернативӣ тавлид кардааст, муаррифӣ кунанд.

Панҷ намуди асосии пайвасткунии алтернативӣ умуман эътироф шудаанд. [1] [2] [3] [19]

  • Гузаронидани экзон ё кассетаи эксон: дар ин ҳолат, экзон метавонад аз транскрипти ибтидоӣ ҷудо карда шавад ё нигоҳ дошта шавад. Ин усули маъмултарин дар mRNA-ҳои ширхӯрон аст. [19]
  • Экзонҳои ба ҳам истисноӣ: Яке аз ду экзон дар mRNAs пас аз пайвастшавӣ нигоҳ дошта мешавад, аммо на ҳарду.
  • Сайти алтернативии донорҳо: Ҷойгоҳи алтернативии 5 '(сайти донорҳо) истифода мешавад, ки сарҳади 3' -и экзони болообро тағир медиҳад.
  • Сайти алтернативии қабулкунанда: Пайванди алтернативии 3' пайвастшавӣ (макони қабулкунанда) истифода мешавад, ки сарҳади 5'-и экзони поёнобро тағир медиҳад.
  • Нигоҳдории интрон: Силсиларо метавон ҳамчун интрон ҷудо кард ё танҳо нигоҳ дошт. Ин аз гузариши эксон фарқ мекунад, зеро пайдарпаии нигоҳдошта бо интронҳо пӯшида нест. Агар интрони нигоҳ дошташуда дар минтақаи рамзгузорӣ қарор дошта бошад, интрон бояд аминокислотаҳои аминокислотаро дар чаҳорчӯба бо экзонҳои ҳамсоя рамзгузорӣ кунад, ё кодон қатъ ё тағир дар чаҳорчӯбаи хондан боиси ғайрифаъол шудани сафеда мегардад. Ин намуди нодиртарин дар ширхӯрон аст. [19]

Илова ба ин усулҳои ибтидоии пайвасткунии алтернативӣ, боз ду механизми асосии дигар вуҷуд доранд, ки тавассути онҳо mRNA-ҳои гуногун метавонанд аз як ген промоутерҳои сершумор ва сайтҳои полиаденилизатсия тавлид шаванд. Истифодаи промоутерҳои сершумор ҳамчун механизми танзими транскриптӣ ба ҷои дуруст пайваст кардани алтернативӣ тавассути оғоз кардани транскрипция дар нуқтаҳои гуногун тавсиф карда мешавад, транскриптҳо бо экзонҳои гуногуни 5'-бештар тавлид кардан мумкин аст. Дар охири дигар, сайтҳои сершумори полиаденилизатсия барои транскрипт нуқтаҳои гуногуни охири 3' -ро таъмин мекунанд. Ҳардуи ин механизмҳо дар якҷоягӣ бо пайвасткунии алтернативӣ мавҷуданд ва гуногунии иловагии mRNA -ҳои аз як ген ҳосилшударо таъмин мекунанд. [1] [3]

Ин усулҳо механизмҳои асосии пайвасткуниро тавсиф мекунанд, аммо метавонанд барои тавсифи ҳодисаҳои мураккаби пайвастшавӣ нокофӣ бошанд. Масалан, дар расми рост 3 ҷудошавӣ аз гени гиалуронидаз 3 муш нишон дода шудааст. Муқоисаи сохтори экзоникии дар сатри якум (сабз) бо сохтори дар хати дуюм нишондодашуда (зард) нигоҳ доштани интронро нишон медиҳад, дар ҳоле ки муқоисаи байни сплайсформаи дуюм ва сеюм (зард ва кабуд) гузаштани экзонро нишон медиҳад. Ба наздикӣ як номенклатураи намунавӣ барои ба таври беназир таъин кардани ҳама намунаҳои имконпазири пайвасткунӣ пешниҳод карда шуд. [19]

Механизми пайвасткунии умумӣ Таҳрир

Вақте ки пре-mRNA аз ДНК транскрипт карда шуд, он якчанд интрон ва экзонҳоро дар бар мегирад. (Дар нематодҳо, миёна 4-5 экзон ва интрон дар пашшаҳои меваҷот мебошанд Дрозофила дар як пре-мРНК-и транскрипсияшуда метавонад зиёда аз 100 интрон ва экзон бошад.) Эксонҳое, ки дар мРНК нигоҳ дошта мешаванд, дар ҷараёни сплайсинг муайян карда мешаванд. Танзим ва интихоби маконҳои ҷудокунӣ аз ҷониби фаъолкунандаи сперлинги трансплантатсия ва сафедаҳои репрессор, инчунин унсурҳои сис-амалкунанда дар дохили худи mRNA, ба монанди тақвиятдиҳандагони экзоникӣ ва хомӯшкунакҳои экзоникӣ анҷом дода мешавад.

Интрони маъмулии эукариотҳои ҳастаӣ пайдарпаии консенсус дорад, ки минтақаҳои муҳимро муайян мекунанд. Ҳар як интрон дар охири 5' пайдарпаии GU дорад. Дар наздикии охири 3' участкаи филиал вокеъ аст. Нуклеотид дар нуқтаи филиал ҳамеша як А аст, ки ризоияти ин пайдарпаӣ то андозае фарқ мекунад. Дар одамон пайдарпайии ризоияти макони филиал yUnAy аст. [20] Пас аз макони филиал як силсила пиримидинҳо - трактори полипиримидин - пас аз тарафи AG дар охири 3 'пайравӣ мекунанд. [3]

Пайвасткунии mRNA аз ҷониби як РНК ва комплекси сафедаҳо, ки бо номи сплисеосома маъруфанд, анҷом дода мешавад, ки дорои snRNP -ҳои U1, U2, U4, U5 ва U6 мебошанд (U3 дар пайвасткунии mRNA иштирок намекунад). [21] U1 ба 5 'GU ва U2 пайваст мешавад, бо ёрии омилҳои сафедаи U2AF, ба шохаи А дар дохили макони филиал пайваст мешавад. Комплекс дар ин марҳила ҳамчун комплекси сплицеосомаи А маълум аст. Ташаккули комплекси А одатан қадами калидӣ дар муайян кардани ақсоҳои интрон, ки бояд ҷудо карда шаванд ва муайян кардани нугҳои экзон, ки нигоҳ дошта мешаванд, мебошад. [3] (Номенклатураи U аз миқдори баланди уридини онҳо бармеояд).

Маҷмӯи U4, U5, U6 мепайвандад ва U6 мавқеи U1 -ро иваз мекунад. U1 ва U4 тарк мекунанд. Пас аз он комплекси боқимонда ду реаксияи трансестерификатсияро иҷро мекунад. Дар трансэтерификатсияи аввал 5' нуги интрон аз экзони болооб ҷудо мешавад ва бо пайванди 2',5'-фосфодиэстер ба макони шохаи А пайваст мешавад. Дар трансэтерификатсияи дуюм нӯги 3'-и интрон аз экзони поёноб ҷудо мешавад ва ду экзон бо пайванди фосфодиэстер пайваст мешаванд. Баъд интрон дар шакли лариат бароварда мешавад ва таназзул мешавад. [1]

Унсурҳои танзимкунанда ва сафедаҳо Таҳрир

Ҷойгиршавӣ аз ҷониби сафедаҳои транс-амалкунанда (репрессорҳо ва активаторҳо) ва сайтҳои танзимкунандаи мувофиқи cis-амалкунанда (хомӯшкунандаҳо ва тақвиятдиҳандагон) дар пеш аз mRNA танзим карда мешавад. Аммо, ҳамчун як ҷузъи мураккабии пайвасткунии алтернативӣ, қайд карда мешавад, ки таъсири як омили ҷуфткунӣ аксар вақт аз мавқеъ вобаста аст. Яъне, омили пайвасткунӣ, ки ҳангоми пайваст шудан ба унсури тақвиятдиҳандаи дохилӣ метавонад ҳамчун фаъолкунандаи ҷуфткунӣ хизмат кунад, метавонад ҳангоми пайваст шудан ба унсури пайвасткунии он дар заминаи эксон ҳамчун репрессор хизмат кунад ва баръакс. [22] Сохтори дуввуми транскрипти қабл аз mRNA инчунин дар танзими ҷудокунӣ нақш мебозад, масалан тавассути ҷамъ овардани унсурҳои ҷудокунӣ ё пинҳон кардани пайдарпаӣ, ки дар акси ҳол ҳамчун унсури ҳатмӣ барои омили ҷуфткунӣ хизмат мекунад. [23] [24] Дар якҷоягӣ, ин унсурҳо "коди ҷудошавӣ" -ро ташкил медиҳанд, ки тарзи пайвастшавӣ дар шароити мухталифи ҳуҷайраҳоро танзим мекунад. [25] [26]

Ду намуди асосии унсурҳои пайдарпайии РНК-и cis-амалкунанда дар mRNAs мавҷуданд ва онҳо дорои сафедаҳои мувофиқи транс-амалкунандаи РНК мебошанд. Пайвастшавӣ хомӯшкунакҳо сайтҳое мебошанд, ки сафедаҳои репрессорҳои пайвасткунандаро ба ҳам мепайвандад ва эҳтимолияти истифодаи макони наздик ба сифати пайванди ҷудошавиро коҳиш медиҳад. Инҳо метавонанд дар худи интрон (хомушкунакҳои дохилӣ, ISS) ё дар экзони ҳамсоя (хомушкунакҳои экзоникӣ, ESS) ҷойгир шаванд. Онҳо бо пайдарпайӣ ва инчунин аз рӯи сафедаҳое, ки ба онҳо пайваст мешаванд, фарқ мекунанд. Аксарияти репрессорҳои пайвасткунанда рибонуклеопротеинҳои ҳетерогении ҳастаӣ (hnRNPs) ба монанди hnRNPA1 ва протеини ҳатмии рӯдаи полипиримидин (PTB) мебошанд. [3] [25] Пайвастшавӣ тақвиятдиҳандагон сайтҳое мебошанд, ки сафедаҳои фаъолкунандаи пайвастшавӣ ба онҳо мепайванданд ва эҳтимолияти истифодаи макони наздикро ҳамчун пайванди пайвастшавӣ зиёд мекунанд. Инҳо инчунин метавонанд дар интрон (таҳмилдиҳандаҳои пайвасткунии интронӣ, ISE) ё экзон (такмилдиҳандаҳои экзоникӣ, ESE) пайдо шаванд. Аксарияти протеинҳои фаъолкунанда, ки бо ISEs ва ESEs пайваст мешаванд, аъзои оилаи сафедаҳои SR мебошанд. Чунин сафедаҳо дорои мотивҳои шинохти РНК ва доменҳои аргинин ва серин бой (RS) мебошанд. [3] [25]

Дар маҷмӯъ, муайянкунандаҳои пайвасткунӣ ба таври ба ҳам вобаста кор мекунанд, ки аз контекст вобаста аст, то қоидаҳое, ки чӣ тавр пайвастшавӣ аз коди пайвасткунӣ танзим карда мешаванд. [26] Мавҷудияти як унсури пайдарпайии пайдарпайии РНК метавонад эҳтимолияти пайдошавии сайти наздикро дар баъзе ҳолатҳо афзоиш диҳад, аммо дар ҳолатҳои дигар, вобаста ба контекст, эҳтимолиятро коҳиш диҳад. Контексте, ки дар он унсурҳои танзимкунанда амал мекунанд, контексти амалкунандаи cis-амалкунанда, ки бо мавҷудияти дигар хусусиятҳои пайдарпаии РНК муқаррар карда мешавад ва контексти амалкунанда, ки бо шароити мобилӣ муқаррар шудааст, дар бар мегирад. Масалан, баъзе унсурҳои пайдарпайии РНК-и амалкунанда танҳо ба пайвастшавӣ таъсир мерасонанд, агар дар як минтақа якчанд элемент мавҷуд бошад, то контекст муқаррар карда шавад. Ҳамчун намунаи дигар, як унсури амалкунандаи cis метавонад ба пайвастшавӣ таъсири муқобил дошта бошад, вобаста аз он, ки кадом сафедаҳо дар ҳуҷайра ифода карда мешаванд (масалан, нейрон ва ПТБ-нейронӣ).Аҳамияти мутобиқгардонии хомӯшкунакҳо ва тақвиятдиҳандаҳо аз ҷониби тадқиқотҳо тасдиқ карда мешавад, ки интихоби қавӣ дар генҳои инсон бар зидди мутатсияҳо мавҷуд аст, ки хомӯшкунакҳои нав истеҳсол мекунанд ё такмилдиҳандаҳои мавҷударо вайрон мекунанд. [27] [28]

Метилизатсияи ДНК ва пайванди алтернативӣ дар ҳашароти иҷтимоӣ Таҳрир

Метилизатсияи ДНК CpG барои танзими алтернативии алтернативӣ дар ҳашароти иҷтимоӣ нақш нишон дод. [29] [30] Дар занбӯри асал (Apis mellifera), Метилизатсияи ДНК CpG ба назар мерасад, ки дар асоси чанд таҳқиқоти аввалини геномӣ [31] [32] пас аз дастрас шудани геноми занбӯри асал гузаришро дар экзон танзим мекунад. [33] Метилизатсияи CpG ДНК алтернативаи васеъшавандаро танзим мекунад, на танҳо ба гузариши эксон, балки ба нигоҳдории интрон ва дигар ҳодисаҳои пайвастшавӣ таъсир мерасонад. [34]

Намунаҳо Таҳрир

Гузаронидани экзон: Дрозофила dsx Таҳрир кардан

Pre-mRNAs аз D. меланогастер ген dsx 6 экзон дорад. Дар мардон экзонҳои 1,2,3,5 ва 6 бо ҳам пайваст мешаванд, ки mRNA -ро ташкил медиҳанд, ки протеини танзимкунандаи транскрипсиониро, ки барои рушди мард зарур аст, рамзгузорӣ мекунад. Дар духтарон, экзонҳои 1,2,3 ва 4 пайваст мешаванд ва сигнали полиаденилятсия дар экзони 4 боиси шикастани mRNA дар он лаҳза мегардад. Дар натиҷа mRNA як протеини танзимкунандаи транскрипсия барои рушди зан мебошад. [35]

Ин як мисоли гузариш аз экзон аст. Интрони болооб аз exon 4 дорои риштаи полипиримидин аст, ки ба пайдарпайии консенсус мувофиқат намекунад, аз ин рӯ сафедаҳои U2AF бе кӯмаки фаъолкунандагони пайвасткунӣ ба он суст пайваст мешаванд. Аз ин рӯ, ин макони қабулкунандаи 3' барои мардон истифода намешавад. Аммо, духтарон як трансформатори ҷудошаванда (Тра) истеҳсол мекунанд (ба поён нигаред). Протеини SR Tra2 дар ҳарду ҷинс тавлид мешавад ва ба ESE дар экзон 4 мепайвандад, агар Tra мавҷуд бошад, он ба Tra2 мепайвандад ва дар якҷоягӣ бо протеини дигари SR маҷмааеро ташкил медиҳад, ки ба сафедаҳои U2AF дар пайвастшавӣ ба рӯдаи полипиримидинии заиф кумак мекунад. U2 ба шохаи алоқаманд ҷалб карда мешавад ва ин боиси дохил шудани экзон 4 ба mRNA мегардад. [35] [36]

Сомонаҳои алтернативии қабулкунанда: Дрозофила Трансформатор Таҳрир кардан

Pre-mRNAs аз Трансформатор (Tra) ген Дрозофила меланогастер тавассути режими алтернативии сайти акцептор аз пайвасткунии алтернативӣ гузаред. Генаи Tra протеинро рамзгузорӣ мекунад, ки танҳо дар духтарон ифода карда мешавад. Транскрипти ибтидоии ин ген дорои интрон бо ду макони имконпазири аксептор мебошад. Дар мардон, сайти аксепторҳои болооб истифода мешавад. Ин боиси ба транскрипти коркардшуда ворид шудани версияи дарозтари exon 2 мегардад, аз ҷумла кодони барвақт. Дар натиҷа mRNA маҳсулоти сафедаи буридашударо рамзгузорӣ мекунад, ки ғайрифаъол аст. Духтарон протеини муайянкунандаи ҷинсро ба вуҷуд меоранд. Протеини Sxl як репрессори пайвасткунанда аст, ки ба ISS дар RNA транскрипти транскрипт дар наздикии макони акцептори боло мепайвандад ва аз пайвастшавии сафедаи U2AF ба рӯдаи полипиримидин пешгирӣ мекунад. Ин истифодаи ин пайвандро пешгирӣ мекунад ва пайвастшавии сплайсеосомаро ба макони аксептори поёноб интиқол медиҳад. Пайвастшавӣ дар ин лаҳза кодони таваққуфро, ки ҳамчун як қисми интрон хориҷ карда мешавад, аз байн мебарад. mRNA-и ҳосилшуда протеини фаъоли Tra-ро рамзгузорӣ мекунад, ки худ танзимгари пайвастшавии алтернативии генҳои дигари марбут ба ҷинс мебошад (ниг. dsx боло). [1]

Таърифи Exon: Таҳрири ресепторҳои Fas

Якчанд изоформҳои сафедаи ретсепторҳои Fas тавассути пайвасткунии алтернативӣ истеҳсол карда мешаванд. Ду изоформаи маъмулан дар одамон пайдошуда тавассути механизми гузариш ба экзон тавлид мешаванд. Як mRNA, аз ҷумла exon 6, шакли мембранаи ресепторҳои Фасро рамзгузорӣ мекунад, ки ба апоптоз ё марги барномарезишудаи ҳуҷайра мусоидат мекунад. Афзоиши ифодаи ретсепторҳои Fas дар ҳуҷайраҳои пӯсти ба таври доимӣ зери офтоб дучоршуда ва набудани экспрессия дар ҳуҷайраҳои саратони пӯст аз он шаҳодат медиҳад, ки ин механизм метавонад дар нест кардани ҳуҷайраҳои пеш аз саратон дар одамон муҳим бошад. [37] Агар exon 6 гузаронида шавад, mRNA натиҷа протеини ҳалшавандаи Фасро рамз мекунад, ки ба апоптоз мусоидат намекунад. Воридшавӣ ё гузариши экзон аз ду сафедаи антагонистӣ, TIA-1 ва протеини пайвасткунандаи рӯдаи полипиримидин (PTB) вобаста аст.

  • Сайти донорҳои 5 'дар интрон дар поён аз экзон 6 дар пеш аз mRNA бо пайдарпаии консенсус созишномаи заиф дорад ва одатан бо U1 snRNP баста намешавад. Агар U1 пайваст нашавад, экзон гузаронида мешавад (нигаред ба "а" дар расми ҳамроҳӣ).
  • Пайвастагии протеини TIA-1 ба макони тақвиятдиҳандаи интронӣ пайвастшавии U1 snRNP-ро мӯътадил мегардонад. [3] Комплекси 5 -сомонаи донорҳо, ки дар натиҷа ба вуҷуд меоянд, ба пайвастани омили ҷудокунии U2AF ба макони ҷудошавии 3 'дар боло аз эксон тавассути механизме, ки ҳоло маълум нест, нигаред (нигаред ба б). [38]
  • Exon 6 дорои хомӯшкунандаи экзоникии аз пиримидин бой мебошад, ур6, ки дар он PTB метавонад пайваст. Агар PTB пайваст шавад, он таъсири комплекси донории 5'-ро ба пайвастшавии U2AF ба макони акцептор бозмедорад, ки боиси гузаштани экзон мегардад (ниг. в).

Ин механизм намунаи таърифи экзон дар якҷоягӣ мебошад. Spliceosome дар интрон ҷамъ мешавад ва зербахшҳои snRNP РНК -ро мепечонанд, то ки ақсои 5 'ва 3' -и интрон пайваст шаванд. Бо вуҷуди ин, мисолҳои ба наздикӣ омӯхташуда, ба монанди ин нишон медиҳанд, ки байни ақсои экзон низ таъсири мутақобила вуҷуд дорад. Дар ин ҳолати мушаххас, ин таъсироти мутақобилаи таърифи экзон заруранд, то имкон диҳанд, ки омилҳои асосии пайвастшавӣ пеш аз васл кардани спликосомаҳо дар ду интронҳои паҳлӯӣ пайваст карда шаванд. [38]

Рақобати репрессор-фаъолкунанда: ВИЧ-1 тат exon 2 Таҳрир

ВНМО, ретровирус, ки боиси СПИД дар одамон мешавад, як транскрипти ягонаи ибтидоии РНК -ро тавлид мекунад, ки ба таври алтернативӣ бо роҳҳои гуногун барои тавлиди беш аз 40 мРНКҳои гуногун пайваст карда мешавад. [39] Мувозинат дар байни транскриптҳои ба таври гуногун ҷудошуда таъмин мРНКҳои сершумореро, ки маҳсулоти гуногунро, ки барои зарб задани вирус заруранд, таъмин мекунад. [40] Яке аз стенограммаҳои ба таври гуногун ҷудошуда дорои тат ген, ки дар он экзон 2 як экзони кассета аст, ки онро гузаронидан ё дохил кардан мумкин аст. Дохил кардани tat exon 2 ба RNA бо рақобат байни репрессорҳои пайвасткунандаи hnRNP A1 ва сафедаи SR SC35 танзим карда мешавад. Дар доираи экзон 2 пайдарпаии хомӯшкунандаи экзоникӣ (ESS) ва пайдарпаии тақвиятдиҳандаи экзоникӣ (ESE) ба ҳам мепайвандад. Агар протеини репрессории А1 ба ESS пайваст шавад, он пайвастшавии муштараки молекулаҳои сершумори А1 -ро оғоз мекунад, ки ба сайти донории 5 'болооби экзон 2 паҳн мешавад ва пайвастшавии омили асосии пайвасткунандаи U2AF35 ба рӯдаи полипиримидинро пешгирӣ мекунад. Агар SC35 ба ESE пайваст шавад, он пайвастшавии A1 -ро пешгирӣ мекунад ва макони донорҳои 5 '-ро дар ҳолати дастрас барои васл кардани сплитососома нигоҳ медорад. Рақобат байни фаъолкунанда ва репрессор кафолат медиҳад, ки ҳарду намуди mRNA (бо ва экзони 2) истеҳсол карда мешаванд. [39]

Пайвасткунии алтернативӣ яке аз якчанд истисноҳо ба идеяи аслӣ мебошад, ки як пайдарпаии ДНК барои як полипептид рамзгузорӣ мекунад (гипотезаи як ген-як фермент). "Як ген - бисёр полипептидҳо" гуфтан дурусттар аст. [41] Барои муайян кардани кадом полипептид бо назардошти пайдарпаии ДНК ва пеш аз мРНК маълумоти беруна лозим аст. Азбаски усулҳои танзим меросӣ мебошанд, ин усулҳои нави таъсиррасонии мутатсия ба ифодаи генҳоро фароҳам меорад. [7]

Пешниҳод карда шуд, ки барои эукариотҳо ҷудошавии алтернативӣ як қадами муҳим дар самти самаранокии баландтар буд, зеро иттилоот метавонад хеле сарфакорона нигоҳ дошта шавад. Якчанд сафедаҳоро метавон бо як ген рамзгузорӣ кард, на ба ҷои он ки барои ҳар як ген алоҳида ҷудо карда шавад ва ба ин васила имкон медиҳад протеоми гуногунтар аз як геноми андозаи маҳдуд дошта бошад. [1] Он инчунин чандирии эволютсиониро таъмин мекунад. Мутацияи як нуқта метавонад боиси он шавад, ки экзони додашуда баъзан ҳангоми трансляция хориҷ карда шавад ё аз транскрипт дохил карда шавад, ки ин имкон медиҳад истеҳсоли изоформ протеини нав бе талафи сафедаи аслӣ имконпазир гардад. [1] Таҳқиқот минтақаҳои аз ҷиҳати бетартибӣ (ниг. Протеинҳои табиатан сохташуда) -ро, ки дар экзонҳои ғайри конститутсионӣ ғанӣ карда шудаанд, муайян кардаанд [42], ки нишон медиҳанд, ки изоформҳои сафеда бо сабаби тағир додани модулҳои функсионалӣ дар ин минтақаҳо метавонанд гуногунии функсионалиро нишон диҳанд. Чунин гуногунрангии функсионалӣ, ки тавассути изоформҳо ба даст омадаанд, дар шакли ифодаи онҳо инъикос ёфтаанд ва онҳоро метавон бо равишҳои омӯзиши мошин пешгӯӣ кард. [43] [44] Таҳқиқоти муқоисавӣ нишон медиҳанд, ки ҷудошавии алтернативӣ дар эволютсия чандҳуҷайрагӣ буд ва пешниҳод мекунад, ки ин механизм шояд барои мусоидат ба рушди организмҳои бисёрҳуҷайраӣ интихоб шуда бошад. [45]

Тадқиқоте, ки ба лоиҳаи геномҳои инсон ва дигар пайдарпаии геномҳо асос ёфтааст, нишон дод, ки одамон назар ба кирми мудаввар тақрибан 30% зиёд ген доранд Caenorhabditis elegans, ва танҳо тақрибан ду баробар бештар аз пашша Дрозофила меланогастер. Ин бозёфт боиси тахминҳо гардид, ки мураккабии бештари даркшудаи одамон ё умуман устухонҳои устухон, метавонад аз сабаби баланд будани суръати пайвастшавии алтернативӣ дар одамон нисбат ба ҳайвоноти бесутунмӯҳра бошад. [46] [47] Бо вуҷуди ин, тадқиқот оид ба намунаҳои 100,000 EST ҳар кадоме аз одамон, муш, каламуш, гов, пашша (D. меланогастер), кирм (C. elegans), ва завод Arabidopsis thaliana дар байни басомади генҳои ба таври алтернативӣ пайвастшуда дар байни одамон ва дигар ҳайвоноти озмоишшуда фарқияти калон пайдо накард. [48] ​​Аммо тадқиқоти дигар пешниҳод кард, ки ин натиҷаҳо як артефакти шумораи гуногуни ESTs барои организмҳои гуногун мавҷуданд. Вақте ки онҳо басомадҳои алтернативии пайвастшавӣ дар зергурӯҳҳои тасодуфии генҳои ҳар як организмро муқоиса карданд, муаллифон ба хулосае омаданд, ки сутунмӯҳрагон нисбат ба устухонҳои алтернативӣ сатҳи баландтари пайвастшавии алтернативӣ доранд. [49]

Тағйирот дар дастгоҳи коркарди РНК метавонад боиси нодуруст ҷойгиркунии транскриптҳои сершумор гардад, дар ҳоле ки тағироти якнуклеотидӣ дар маконҳои пайвастшавӣ ё сайтҳои танзимкунандаи пайвасткунии cis метавонад боиси фарқияти пайвастшавии як ген гардад ва аз ин рӯ дар mRNA, ки аз як ген тавлид мешавад. транскриптҳои генҳои мутант. Тадқиқот дар соли 2005 бо таҳлили эҳтимолӣ нишон дод, ки зиёда аз 60% мутатсияҳое, ки боиси бемориҳои одам мешаванд, на ба пайдарпаии рамзгузорӣ таъсир мерасонанд. [50] Тадқиқоти навтарин нишон медиҳад, ки аз се як ҳиссаи ҳамаи бемориҳои ирсӣ эҳтимолан ҷузъи пайвастшавӣ доранд. [22] Новобаста аз фоизи дақиқ, як қатор бемориҳои марбут ба ҷуфтшавӣ вуҷуд доранд. [51] Тавре ки дар зер тавсиф шудааст, намунаи барҷастаи бемориҳои вобаста ба пайвастшавӣ саратон мебошад.

mRNA-ҳои ғайримуқаррарӣ пайвастшуда инчунин дар миқдори зиёди ҳуҷайраҳои саратон пайдо мешаванд. [5] [6] [8] Таҳлилҳои якҷояи RNA-Seq ва протеомикӣ ифодаи дифференсиалии изофӣ дар сафедаҳои калидӣ дар роҳҳои муҳими саратонро ошкор карданд. [52] Ҳама вақт возеҳ нест, ки оё чунин шеваҳои ғайримаъмулии пайвастшавӣ ба афзоиши саратон мусоидат мекунанд ё танҳо натиҷаи аномалияҳои ҳуҷайраҳои марбут ба саратон мебошанд. Барои намудҳои муайяни саратон, ба монанди дар колоректал ва простата, шумораи хатогиҳои пайвасткунӣ дар як саратон нишон дода шудааст, ки дар байни саратони инфиродӣ хеле фарқ мекунанд, ки ин падида ноустувории транскриптом номида мешавад. [53] [54] Ноустувории транскриптом боз нишон дод, ки ришвахорӣ бо сатҳи пасти ифодаи генҳои омили ҷуфткунанда алоқаманд аст. Мутация аз DNMT3A исбот шудааст, ки ба бадшавии гематологӣ мусоидат мекунад ва ин DNMT3A-хатҳои ҳуҷайраҳои мутатсия дар муқоиса бо ҳамтоёни типи ваҳшии изогении онҳо ноустувории транскриптомро нишон медиҳанд. [55]

Дар асл, дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои саратонӣ ҷудошавии алтернативӣ дар ҳуҷайраҳои саратон ба назар мерасад ва намудҳои ҷудошавӣ фарқ мекунанд, масалан, ҳуҷайраҳои саратонӣ нисбат ба ҳуҷайраҳои муқаррарӣ нигоҳдории интронро баландтар нишон медиҳанд, аммо сатҳи пастшавии экзон. [56] Баъзе фарқиятҳо дар пайвастшавӣ дар ҳуҷайраҳои саратонӣ метавонанд аз басомади баланди мутацияҳои соматикӣ дар генҳои омезиши омилҳо вобаста бошанд, [8] ва баъзеҳо метавонанд аз тағирёбии фосфоризатсияи омилҳои пайвасткунандаи транс-амалкунанда ба вуҷуд оянд. [7] Дигарон метавонанд бо тағирёбии миқдори нисбии омилҳои пайвастшавӣ тавлидшуда ба вуҷуд оянд, масалан, нишон дода шудааст, ки ҳуҷайраҳои саратони сина сатҳи омили пайвасткунандаи SF2/ASF зиёданд. [57] Як тадқиқот нишон дод, ки фоизи нисбатан кам (383 аз зиёда аз 26000) вариантҳои алтернативии пайвастшавӣ дар ҳуҷайраҳои варамҳо нисбат ба ҳуҷайраҳои муқаррарӣ ба таври назаррас баландтар буданд ва аз он шаҳодат медиҳад, ки маҷмӯи маҳдуди генҳо вуҷуд доранд, ки ҳангоми нодуруст пайваст кардан мусоидат ба рушди варамҳо. [58] Бо вуҷуди ин, чунин мешуморанд, ки таъсири зараровари транскриптҳои нодуруст ҷойгиршуда одатан тавассути механизми назорати сифат пас аз транскрипсияи ҳуҷайравӣ, ки mRNA-и бесамар (NMD) ном дорад, ҳифз ва бартараф карда мешавад. [59]

Як намунаи як варианти мушаххаси пайвастшавӣ, ки бо саратон алоқаманд аст, дар яке аз генҳои DNMT инсон аст. Се гени DNMT ферментҳоро рамзгузорӣ мекунанд, ки ба ДНК гурӯҳҳои метил илова мекунанд, тағирот аксар вақт таъсири танзимкунанда дорад. Якчанд mRNA-ҳои ғайримуқаррарӣ пайвастшудаи DNMT3B дар варамҳо ва хатҳои ҳуҷайраҳои саратон пайдо мешаванд. Дар ду таҳқиқоти алоҳида, ифодаи ду аз ин mRNA-ҳои ғайримуқаррарӣ дар ҳуҷайраҳои ширхӯрон боиси тағирот дар шакли метилизатсияи ДНК дар ин ҳуҷайраҳо гардид. Ҳуҷайраҳо бо яке аз mRNA -ҳои ғайримуқаррарӣ низ нисбат ба ҳуҷайраҳои назоратӣ ду маротиба тезтар афзоиш ёфтанд, ки ин саҳми бевоситаи рушди варамҳои ин маҳсулотро нишон медиҳад. [7]

Мисоли дигар ин аст Рон (MST1R) прото-онкоген. Хусусияти муҳими ҳуҷайраҳои саратон қобилияти ҳаракат кардан ва ворид шудан ба бофтаи муқаррарӣ мебошад. Истеҳсоли стенограммаи ба таври ғайримуқаррарӣ пайвастшуда Рон Маълум шуд, ки он бо афзоиши сатҳи SF2/ASF дар ҳуҷайраҳои саратони сина алоқаманд аст. Изоформаи ғайримуқаррарии сафедаи Рон, ки бо ин mRNA рамзгузорӣ шудааст, ба ҳаракати ҳуҷайра оварда мерасонад. [57]

Аз ҳад зиёд ифода кардани як варианти буридаи ҷудошудаи генҳои FOSB - ΔFosB - дар як гурӯҳи муайяни нейронҳо дар аккументҳои ядро ​​ҳамчун механизми сабабӣ, ки дар индуксия ва нигоҳдории нашъамандӣ ба маводи мухаддир ва мукофотҳои табиӣ иштирок мекунад, муайян карда шудааст. [60] [61] [62] [63]

Тадқиқотҳои иғвоангези охирин ба як вазифаи асосии сохтори хроматин ва тағирёбии гистон дар танзими алтернативии пайвастшавӣ ишора мекунанд. Ин фаҳмишҳо нишон медиҳанд, ки танзими эпигенетикӣ на танҳо муайян мекунад, ки кадом қисмҳои геном ифода карда мешаванд, балки тарзи пайвастани онҳо. [64]

Таҳлили геномии васлкунии алтернативӣ вазифаи душвор аст. Одатан, транскриптҳои алтернативии ҷудошуда тавассути муқоисаи пайдарпаии EST пайдо шуданд, аммо ин барои пайдарпайии шумораи хеле зиёди EST талаб мекунад. Аксари китобхонаҳои EST аз шумораи хеле ками бофтаҳо ба вуҷуд меоянд, бинобар ин, дар ҳама ҳолатҳо вариантҳои ҷудошавии бофтаҳо аз даст дода мешаванд. Бо вуҷуди ин, равишҳои баландсуръат барои таҳқиқи пайвастшавӣ таҳия карда шудаанд, масалан: таҳлили бар микрооррагҳои ДНК, таҳлили ҳатмии РНК ва пайдарпаии амиқ. Ин усулҳоро барои муоина кардани полиморфизмҳо ё мутатсияҳо дар ва ё дар атрофи унсурҳои пайвасткунӣ, ки ба пайвастшавии сафедаҳо таъсир мерасонанд, истифода бурдан мумкин аст. Ҳангоми якҷоя бо таҳлилҳои сплайсинг, аз ҷумла дар зинда таҳлили генҳои хабарнигор, таъсири функсионалии полиморфизмҳо ё мутацияҳо дар пайвасткунии транскриптҳои пеш аз мРНК таҳлил карда мешаванд. [22] [25] [65]

Дар таҳлили микроаррей массивҳои порчаҳои ДНК, ки экзонҳои инфиродӣ доранд (масалан. Микроарраи афсиметрикӣ) ё ҳудуди эксон/эксон (масалан. массивҳо аз ExonHit ё Jivan) истифода шудаанд. Сипас массив бо cDNA бо тамғаҳои мавриди таваҷҷӯҳ тафтиш карда мешавад. CDNA -ҳои санҷишӣ ба ДНК аз экзонҳое, ки ба матрини пайдоиши худ ба mRNA -ҳо дохил мешаванд ё ба ДНК аз сарҳаде пайваст мешаванд, ки ду экзон пайваст шудаанд. Ин метавонад мавҷудияти mRNA-ҳои алтернативии алоҳидаро ошкор кунад. [66]

CLIP (Cross-linking and immunoprecipitation) радиатсияи ултрабунафшро барои пайваст кардани сафедаҳо ба молекулаҳои РНК дар бофта ҳангоми пайвастшавӣ истифода мебарад. Пас аз он як протеини танзимкунандаи ҷудошавандаи трансплантатсионӣ, ки мавриди таваҷҷӯҳ аст, бо истифода аз антителаҳои мушаххас ҷудо карда мешавад. Вақте ки РНК ба он сафеда пайваст карда мешавад, ҷудо ва клон карда мешавад, он пайдарпайии ҳадафро барои он сафеда ошкор мекунад. [4] Усули дигари муайян кардани сафедаҳои пайвасткунандаи РНК ва харитасозии ҳатмии онҳо ба транскриптҳои қабл аз mRNA ин "Арзёбии микроамараи аптамерҳои геномӣ аз рӯи баст (MEGAshift)" аст. [67] Ин усул мутобиқсозии "Эволютсияи систематикии Лигандҳоро дар бар мегирад" бо усули ғанигардонии экспоненсиалӣ (SELEX) "[68] дар якҷоягӣ бо хониши ба микроарра асосёфта. Истифодаи усули MEGAshift дар бораи танзими пайванди алтернативӣ тавассути имкон додани муайян кардани пайдарпайҳо дар транскриптҳои пеш аз mRNA дар атрофи экзонҳои алтернативии пайвастшуда, ки ба омилҳои гуногуни пайвастшавӣ миёнаравӣ мекунанд, ба монанди ASF/SF2 ва PTB. [69] Ин равиш инчунин барои кӯмак расонидан дар муайян кардани робитаи байни сохтори дуюмдараҷаи РНК ва пайванди омилҳои пайвастшавӣ истифода шудааст. [24]

Технологияҳои пайдарпайии амиқ барои гузаронидани таҳлили геномии mRNAs - коркарднашуда ва коркардшуда - ба ин васила таъмин намудани фаҳмишҳо дар бораи пайванди алтернативӣ истифода шудаанд. Масалан, натиҷаҳои истифодаи пайдарпайии амиқ нишон медиҳанд, ки дар одамон тахминан 95% транскриптҳо аз генҳои мултиэксонӣ бо як қатор транскриптҳои пеш аз mRNA бо усули хоси бофта пайваст карда мешаванд. [2] Геномикаи функсионалӣ ва равишҳои ҳисоббарорӣ дар асоси омӯзиши сершумор низ барои ҳамгиро кардани маълумоти RNA-seq барои пешгӯии функсияҳо барои изоформҳои алтернативии пайвастшуда таҳия карда шудаанд. [44] пайдарпайии амиқ низ дар кӯмак кардааст дар зинда ошкор кардани лариатҳои муваққатӣ, ки ҳангоми часпидан ҷудо мешаванд, муайян кардани пайдарпаии маконҳои шохаҳо ва харитасозии миқёси нуқтаҳои филиалҳо дар транскриптҳои пеш аз mRNA-и инсон. [70]

Истифодаи таҳлили репортерҳо тавассути сохтани генҳои репортерҳо, ки вобаста ба аксуламали ҷудошавии рухдода яке аз ду сафедаҳои гуногуни флюоресцентиро ифода мекунанд, имкон медиҳад сафедаҳои ҷудокунандаро, ки дар як чорабинии алтернативии ҷудошавӣ иштирок мекунанд, пайдо кунанд. Ин усул барои ҷудо кардани мутантҳое, ки ба сплайсинг таъсир мерасонанд ва ба ин васила барои муайян кардани сафедаҳои танзимкунандаи нав, ки дар ин мутантҳо ғайрифаъол шудаанд, истифода шудааст. [4]

Маҷмӯаи пойгоҳи додаҳои алтернативии пайвастшавӣ мавҷуд аст. [71] [72] [73] Ин пойгоҳи додаҳо барои дарёфти генҳое, ки пеш аз мРНК-ҳои дучоршавии алтернативӣ ва алтернативии ҷуфтшавӣ доранд ё омӯхтани таъсири функсионалии пайвасткунии алтернативӣ муфид аст.


Видеоро тамошо кунед: Механизм с гибкой шестерней (Феврал 2023).