Маълумот

8.10: Секвенсияи хатарноки ДНК - Биология

8.10: Секвенсияи хатарноки ДНК - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Қатъи занҷири радиоактивӣ

Полимеризатсияи кислотаҳои нуклеинӣ дар самти 5′ → 3′ ба амал меояд. Полимеризатсия аз ин 2 гурӯҳи функсионалӣ вобаста аст, то реаксияи синтези дегидратсионӣ ба амал ояд ва сутуни шакар-фосфати кислотаи нуклеинро васеъ кунад. Дар солҳои 1970-ум гурӯҳи Фред Сэнгер усули комилан нави "хондан"-и пайдарпаии хаттии ДНК-ро бо истифода аз асосҳои махсусе кашф кард. терминаторҳои занҷир ё дидеоксинуклеотидҳо. Набудани гурӯҳи гидроксил дар мавқеи 3 'полимеризатсияро бозмедорад ва дар натиҷа қатъ мешавад. Ин усул то ҳол истифода мешавад ва онро "Усули қатъкунии занҷири дидеоксинуклеотидҳои Сангер" меноманд. Ин усул дар ибтидо як праймери бо аломати радиоактивиро барои оғоз кардани реаксияи пайдарпай истифода мекард. Чор аксуламал ба амал меоянд, ки ҳар як реаксия қасдан бо терминатори занҷири дидеокси "заҳролуд" мешавад. Масалан, дар як реаксия ҳама 4 дНТП (дезоксинуклеотид трифосфатҳо) бо илова кардани миқдори ками ddATP (дидеоксиаденозин трифосфат) хоҳад буд. Ин реаксия ба як қатор қатъи пеш аз мӯҳлати полимеризатсия оварда мерасонад, алахусус дар ҷойҳои гуногун, ки дар онҳо аденин дохил карда мешавад.

dATP як мономери табиӣ мебошад, ки дар полимеризатсияи ДНК истифода мешавад. 3′-OH нуқтаи пайвастшавии нуклеотиди оянда мебошад.

Набудани 3'-OH дар ин молекулаи ddATP онро терминатори занҷир месозад, ки ба полимери ДНК илова кардани нуклеотиди дигарро манъ мекунад.

Маҳсулоти ин 4 аксуламали ҷудогонаи пайдарпайӣ дар гелҳои калони пайдарпайии полиакриламид иҷро карда мешавад. Қисмҳои хурдтарин аз гел зудтар мегузаранд ва намунаи ба зинапоя монандро эҷод мекунанд. Инро тавассути истифодаи филми рентгенӣ, ки ба радиоактивӣ ҳассос аст, тасаввур кардан мумкин аст. Ҳар як хати гел ба яке аз чор реаксияҳои қатъкунандаи занҷир мувофиқат мекунад. Асосҳо аз поён ба боло пайдарпай хонда мешаванд ва пайдарпаии ДНК -ро нишон медиҳанд.

Гели пайдарпайиро метавон ба таври дастӣ баҳо дод. Профилҳои ҳар як хат бо ёрии ImageJ барои тасвири шакли банд ва пайдарпаии минбаъда сохта шудаанд.

Кредит: Ҷон Шмидт & Ҷереми Сето (CC-BY-SA 3.0)

Қатъи занҷири флуоресцентӣ ва электрофорези капиллярӣ

Кредит: Эстевез (CC-BY-SA 3.0)

Кор бо радиоактивӣ хатарнок ва номатлуб аст, аз ин рӯ терминаторҳои занҷир бо тамғаҳои флуоресцентҳо таҳия карда шуданд. Ин усул як қатор риштаҳои ДНК-ро синтез мекунад, ки махсусан дар хотима флуоресцентӣ мебошанд, ки тавассути системаи электрофорези капиллярӣ мегузарад. Вақте ки порчаҳои ДНК аз лазер ва детектор мегузаранд, сигнали флюоресцентии гуногун, ки ба ҳар як ddNTP мансуб аст, муайян карда мешавад ва хроматограммаро барои ифода кардани пайдарпаӣ тавлид мекунад. Терминаторҳои занҷири флуоресцентҳо ҳоло дар реаксияҳо истифода мешаванд ва аз як капилляр хурд мегузаранд. Қисмҳои хурдтарин аз аввал мегузаранд ва барои ошкор кардани хроматограмма муайян карда мешаванд.

Хроматограммаҳои флуоресцент барои баҳодиҳии қатъи занҷири нуклеотидҳо истифода мешаванд. Амплитудаи ҳар як қулла ба қувват ё эътимоднокии занги нуклеотидҳо мувофиқат мекунад. Файлҳои хроматограмма одатан дар баробари файли пайдарпай бо васеъкунӣ таъмин карда мешаванд *.ab1 дар ҳоле ки файлҳои пайдарпай ҳамчун файли матнӣ дар рӯза формат Маълумоти бештарро дар бораи ин файлҳо пайдо кардан мумкин аст Ин ҷо. Ҳангоми мавҷуд будани хатогиҳои номуайянӣ ё пайдарпайӣ, таҳлили файлҳои ab1 ниҳоят муҳим аст. Ин файлҳои ab1 инчунин метавонанд барои гузоштани холҳои сифат дар занги асосӣ истифода шаванд.

Вақте ки дар сигнал аз сабаби қуллаҳои сершумор номуайянии аз ҳад зиёд вуҷуд дорад, шумо аксар вақт якеро пайдо мекунед Н ба ҷои яке аз 4 нуклеотидҳо (A, T, C ва G).

Ин видео (манбаъ: www.yourgenome.org CC-BY) механизми қатъи занҷири флуоресцент ва электрофорези капилляриро нишон медиҳад.

Пайдарпайкунии геномҳо

Кредит: Ҷереми Сето (CC-BY-NC-SA 3.0)

Секвенсияи анъанавии геномҳо як раванди тӯлонӣ ва дилгиркунанда буд, ки порчаҳои ДНК -и геномиро ба плазмидҳо клон карда, китобхонаи геномии ДНК -ро ба вуҷуд меовард (gDNA). Ин плазмидҳо бо истифода аз методологияи пайдарпайии Сэнгер ба таври инфиродӣ пайдарпай карда шуданд ва барои муайян кардани қисмҳои такрорӣ, ба монанди муаммои ҷигса, ҳисобкунӣ анҷом дода шуд. Ин маҷлис боиси таҳияи лоиња мегардад.

Видео дар зер оварда шудааст yourgenome.org (CC-BY) ва пайдарпайии геноми инсонро тавассути равиши пайдарпайии таппонча нишон медиҳад.


Видеоро тамошо кунед: От геномного редактирования к синтетической биологии (Ноябр 2022).