Маълумот

4.4.1: Маҷмӯаи фарҳанги бактериофагҳо - Биология


Фарҳангҳои бактериофагҳо ҳуҷайраҳои мизбонро талаб мекунанд, ки дар онҳо вирус ё фаг афзоиш меёбад.

Ҳадафҳои таълимӣ

  • Сабабҳо ва усулҳои пайдоиши бактерияҳои культивацияро муайян кунед

Нуқтаҳои асосӣ

  • Бактериофаг як намуди вирусест, ки бактерияҳоро сироят мекунад. Он ин корро тавассути ворид кардани маводи генетикӣ - ё ДНК ё РНК - анҷом медиҳад, ки онро дар капсиди сафедаи беруна ҷойгир мекунад.
  • Барои ворид шудан ба як ҳуҷайраи мизбон, бактериофагҳо ба ретсепторҳои мушаххаси рӯи бактерияҳо, аз ҷумла липополисахаридҳо, кислотаҳои техой, сафедаҳо ё ҳатто флагелла пайваст мешаванд.
  • Вирионҳои фаг мустақилона ҳаракат намекунанд, онҳо бояд ҳангоми вохӯрӣ ба хунравии тасодуфӣ бо ретсепторҳои дуруст такя кунанд (хун, гардиши лимфа, обёрӣ, оби хок ва ғайра).

Шартҳои асосӣ

  • бактериофаг: Вирус, ки махсусан бактерияҳоро сироят мекунад.

Стратегияҳои такрорӣ

Фарҳангҳои вирус ё фагҳо ҳуҷайраҳои мизбонеро талаб мекунанд, ки дар онҳо афзоиш меёбад. Барои бактериофагҳо, фарҳангҳо тавассути сироят кардани ҳуҷайраҳои бактериявӣ парвариш карда мешаванд. Пас аз он фагро аз лавҳаҳои пайдошуда дар як газони бактерияҳо дар табақ ҷудо кардан мумкин аст.

Бактериофаг яке аз як қатор вирусҳоест, ки ба бактерияҳо сироят мекунанд. Онҳо ин корро тавассути ворид кардани маводи генетикӣ, ки дар капсиди сафедаи беруна ҷойгир шудаанд, ба як ҳуҷайраи бактериявии мизбон анҷом медиҳанд. Маводи генетикӣ метавонад ssRNA, dsRNA, ssDNA ё dsDNA бошад (префикси 'ss-' ё 'ds-' як ришта ё ду занҷирро ифода мекунад) дар якҷоягӣ бо тартиботи даврашакл ё хатӣ.

Барои ворид шудан ба ҳуҷайраи мизбон, бактериофагҳо ба ретсепторҳои мушаххаси рӯи бактерияҳо, аз ҷумла липополисахаридҳо, кислотаҳои тейхойӣ, сафедаҳо ва ҳатто флагела пайваст мешаванд. Ин хусусият маънои онро дорад, ки бактериофаг метавонад танҳо он бактерияҳоеро, ки ретсепторҳои дорои ретсепторҳо доранд, сироят кунанд, ки онҳо метавонанд ба онҳо пайваст шаванд ва ин дар навбати худ диапазони мизбони фагро муайян мекунад. Шароити афзоиши мизбон инчунин ба қобилияти фаг барои пайвастшавӣ ва ҳамла ба онҳо таъсир мерасонад. Азбаски вирионҳои фаг мустақилона ҳаракат намекунанд, онҳо бояд ҳангоми вохӯрӣ дар дохили хун, гардиши лимфа, обёрӣ, оби хок ё дигар муҳитҳо ба вохӯриҳои тасодуфӣ бо ретсепторҳои дуруст такя кунанд.

Фагҳо метавонанд тавассути лизиси ҳуҷайраҳо, бо экструзия ё дар баъзе ҳолатҳо тавассути шукуфтан озод карда шаванд. Лизро тавассути фагҳои думдор як фермент бо номи эндолизин ба даст меорад, ки ба пептидогликани девори ҳуҷайра ҳамла мекунад ва вайрон мекунад. Як навъи фагҳои тамоман гуногун, фагҳои риштадор, ҳуҷайраи мизбонро ба таври доимӣ зарраҳои нави вирус ҷудо мекунанд. Вирионҳои озодшуда ҳамчун озод тавсиф карда мешаванд ва агар ноқис набошанд, қобилияти сироят кардани бактерияи навро доранд. Шукуфтан бо фагҳои муайяни Mycoplasma алоқаманд аст. Баръакси баровардани вирион, фагҳое, ки сикли лизогениро нишон медиҳанд, мизбононро намесозанд, балки баръакс ҳамчун профагент ба сокинони дарозмуддат табдил меёбанд.


Истеҳсоли антибиотикҳо | Микробиологияи саноатӣ

Дар мақолаи дар поён овардашуда шарҳи тавлидоти антибиотикҳо оварда шудааст:- 1. Муқаддима ба антибиотикҳо 2. Истифодаи инокулум дар истеҳсоли антибиотикҳо 3. Истифодаи ферментор 4. Миёнаи истифода 5. Биотрансформация.

Муқаддима ба антибиотикҳо:

Антибиотикҳо метаболитҳо мебошанд, ки дорои фаъолияти афзалиятноки зиддимикробӣ мебошанд. Аз ин рӯ, онҳо барои табобати бемориҳои одам, ки аз микроорганизмҳо ба вуҷуд омадаанд, васеъ истифода мешаванд. Аммо баъзе антибиотикҳо инчунин фаъолияти зидди варам доранд (Ҷадвали 40.1). Антибиотик пенициллинро Флеминг соли 1929 кашф карда буд, аммо истеҳсоли тиҷоратии он метавонад танҳо дар аввали солҳои 1940 оғоз шавад.

Ҳарчанд зиёда аз 7000 пайвастагиҳои антибиотикӣ ҷудо карда шудаанд, танҳо 100 ё зиёда аз он барои табобати бемориҳои одамон, ҳайвонот ва растаниҳо истифода мешаванд.

Пайвастҳои антибиотикҳо ё дар шакли табиии худ ё ҳамчун ҳосилаҳои нимсинтетикӣ истифода мешаванд, камони охирин одатан тавассути ҷудо кардани ядрои антибиотик ва дучори тағирёбии кимиёвӣ ба вуҷуд меоянд. Антибиотикҳоро ҳам занбӯруғҳо ва ҳам бактерияҳо тавлид мекунанд, аммо зиёда аз 50% -и онҳо камон танҳо аз Стрептомицес гирифта шудаанд.

Истифодаи инокулум дар истеҳсоли антибиотикҳо:

Штамми ҳосили баланд шарти ҳатмӣ барои истеҳсоли антибиотик мебошад. Аз ин рӯ, такмили доимии шиддат қисми таркибии фаъолияти истеҳсолии тиҷоратӣ мебошад. Штамм/штаммҳои мукаммалшуда дар нигоҳдории дарозмуддат нигоҳ дошта мешаванд, ки миқдори камтарини онҳо барои оғози рушди эмкунӣ гирифта мешавад.

Рушди эмкунӣ дар муҳити сахт оғоз мешавад ва баъдан васоити моеъ истифода мешаванд, ки васоити махсус барои рушди эмкунӣ истифода мешаванд. Инокулум одатан дар шакли суспензияи спора омода карда мешавад, ки онро тавассути гузоштани он дар зарфи металлии ба ферментор пайвастшуда ба ферментор интиқол медиҳанд.

Суспензияи спора метавонад бо истифода аз ҳавои хушкида ба ферментор партофта шавад ё ба он дар зери вазнинӣ иҷозат дода шавад. Одатан, барои кам кардани хавфи аз даст додани иқтидори ҳосили баланди организм шумораи марҳилаҳои байни маводи нигоҳ дошташуда ва марҳилаи ниҳоии эмкунӣ то ҳадди ақал нигоҳ дошта мешавад.

Истифодаи ферментор дар истеҳсоли антибиотикҳо:

Антибиотикҳо одатан дар ферментаторҳои аз пӯлоди зангногир истеҳсол карда мешаванд (ҳаҷми миёна 30,000-200,000 1), ки дар режими партия ё фед-партия истифода мешаванд. Агитация асосан тавассути импеллерҳо сурат мегирад, аммо системаи лифт низ истифода мешавад. Барои аксари истеҳсолкунандагони антибиотикҳо хунуккунии об одатан барои нигоҳ доштани ҳарорати байни 24-26 ° C истифода мешавад.

Умуман, ферментатор дар фишори болоии атмосфера нигоҳ дошта мешавад, ки ин хатари ифлосшавиро коҳиш медиҳад ва О.2 таъминот дар миёна. Ҳавои стерилизатсия мувофиқи талабот таъмин карда мешавад ва барои баъзе равандҳо, масалан, истеҳсоли пенициллин, дар давоми тамоми раванд бояд мавод илова карда шавад. Дар аксари мавридҳо, пешгирии ифлосшавӣ муҳим аст ва тартиботи мувофиқи тозакунӣ байни ҷараёни ферментаторҳо бояд риоя карда шаванд.

Ферментори марҳилаи ниҳоӣ беҳтараш барои истеҳсоли антибиотикҳо дар тӯли дарозтарин имконпазир истифода мешавад. Аммо марҳилаҳои ибтидоии ферментатсия барои афзоиши назарраси микробҳо пешбинӣ шудаанд, одатан онҳо дар ферментаторҳои марҳилаи тухмии андозаи хурдтар гузаронида мешаванд.

Вобаста аз раванд ва штамм як ё якчанд марҳилаи тухмиро метавон истифода бурд, то миқдори максималии биомасса дар ҳолати дурусти физиологӣ барои истеҳсоли баланди антибиотик ҳангоми ворид кардани ферментатор дар марҳилаи ниҳоӣ истифода шавад.

Миёнае, ки барои истеҳсоли антибиотикҳо истифода мешавад:

Истеҳсоли антибиотикҳо васоити мухталиферо истифода мебарад, ки барои ҳар як марҳилаи амалиёт як навъи гуногун дорад (Ҷадвали 40.2). Саъю кӯшиши зиёди тадқиқотӣ ба таҳияи тухмипарварӣ ва васоити истеҳсолот барои кам кардани хароҷот ва баланд бардоштани ҳосил равона карда шудааст. Миёнаи маъмулии истеҳсолӣ тақрибан 10% (w/v) моддаҳои сахт дорад.

Умуман, дар васоити мураккаб ҳосилнокӣ хеле баланд аст. Дар баъзе ҳолатҳо, прекурсор барои антибиотик низ пешбинӣ шудааст, масалан, барои тавлиди пенициллин G, кислотаи фенилацетик ё кислотаи феноксиацетикӣ ҳамчун прекурсор истифода мешавад.

Азбаски антибиотикҳо метаболитҳои дуюмдараҷа мебошанд, муҳити истеҳсолӣ чунон тарҳрезӣ шудааст, ки як маводи ғизоӣ дар марҳилаи муҳим барои оғоз кардани мубодилаи дуюмдараҷа дар организм маҳдуд мешавад. Маҳдуд кардани маводи ғизоӣ аз раванд вобаста аст, масалан, глюкоза барои истеҳсоли пенициллин ва фосфат барои якчанд антибиотикҳое, ки Streptomyces истеҳсол мекунанд.

Баръакси ин, воситаи тухмипарварӣ барои афзоиши босуръат ва пешгирии тавлиди антибиотик ва спорулятсия пешбинӣ шудааст. Вақте ки фарҳанги тухмӣ ба марҳилаи дуруст мерасад, яъне марҳилаи барои истеҳсоли оптималӣ дар марҳилаи ниҳоии истеҳсолот мувофиқ (дар бисёр ҳолатҳо, он марҳилаи лог аст), тақрибан 0.1-20% ҳаҷми марҳилаи ниҳоӣ ба ферментори истеҳсолӣ интиқол дода мешавад. . Дар ин марҳила назорати қатъии ифлосшавӣ муҳим аст.

Дар аксари равандҳои истеҳсолӣ, ферментатори истеҳсолӣ дар ҳолати серғизо кор мекунад, ки дар он дар давоми тамоми ферментатсия пайваста маводи ғизоӣ, масалан, глюкоза илова карда мешавад, то давомнокии истеҳсоли антибиотикҳо зиёд карда шавад. Дар ин ҳолат, одатан миқдори ками шўрборо барои тафтиши афзоиши ҳаҷми шўрбо дар ферментатор гирифта мешаванд.

Дар марҳилаи мувофиқи ферментатсия агентҳои зидди кафккунӣ илова карда мешаванд, то ҳадди ақал кремнийҳои кафккунон, равғанҳои растанӣ ва ғайра истифода бурда шаванд. Хусусиятҳои интихобшудаи микробиологӣ, физикӣ ва химиявӣ ҳангоми ферментатсия бо мақсади ба даст овардани назорати дурусти раванд назорат карда мешаванд.

Ҳолати ғизоии шӯрбо мунтазам танзим карда мешавад, то ғизои ғизоӣ ва прекурсорҳо (агар бошад) дар системаҳои сершумори ғизоӣ танзим карда шавад. Микропроцессорҳо ва компютерҳо одатан барои сабт кардани ҳама параметрҳо ва тағироти раванд ва назорати амалиётҳои гуногун ба монанди стерилизатсия ва ғайра истифода мешаванд.

Дар охири инкубатсияи марҳилаи ниҳоии истеҳсолот, шўрбои дорои консентратсияи пасти (3-35% ҳаҷми умумии маҳлулҳои шўрбои) антибиотик мебошад.

Қадами ибтидоӣ дар барқарорсозии антибиотикҳо ҷудо кардани ҳуҷайраҳо аз шўрбост, ки одатан тавассути филтратсия ё центрифугализатсия ба даст меояд. Аммо дар баъзе мавридҳо, шўрбои пурра барои истихроҷ истифода мешавад. Ҷудокунӣ ва тозакунии антибиотикҳо истихроҷи ҳалкунанда, мубодилаи ионҳо, ултрафилтратсия, осмос баръакс, бориш ва кристаллизатсияро истифода мебаранд.


Муқаддима

Маълум аст, ки вирусҳо ба фавти прокариотҳо ва давраҳои биогеохимиявӣ таъсир мерасонанд ва дар экосистемаҳои баҳрӣ гуногунии калони генетикӣ доранд (Фухрман, 1999 Саттл, 2005). Онҳо аз ҳама агентҳои биологӣ дар рӯи замин мебошанд, бинобар ин ба экологияи микробҳо дар ҳама муҳитҳо вирусҳо таъсири калон мерасонанд. Оби амиқи зеризаминии ҷинсҳои гранитӣ дар Лабораторияи Хард Рок (HRL) дорои 10 4 -10 6 ҳуҷайра мл -1 буд (Pedersen, 2001) ва дар асл, массаи прокариотҳои зеризаминӣ эҳтимолан аз массаи ҳаёти растанӣ ва прокариотҳои дар муҳитҳои рӯизаминӣ (Whitman et al., 1998). Кайл ва дигарон. (2008) ҳисоботи микроскопии флюоресцентҳои зарраҳои ба вирус монандро дар ҳудуди 10 5–10 7 мл-1 оби зеризаминӣ дар Äspö HRL аз умқи 69-455 м ва аҳолии гуногуни вирусии морфологии гуногун ҳангоми таҳти микроскопи электронии интиқол гузориш доданд (TEM). Миқдори вирусҳо дар обҳои зеризаминии Äspö аз шумораи ҳуҷайраҳо ба як дараҷа зиёд буд, ки ин таносуб аксар вақт дар муҳити фаъоли рӯизаминӣ пайдо мешавад (Куттер ва Сулаквелидзе, 2005, Suttle, 2005).

Набудани консентратсияи бузурги биомассаи микробҳо дар муҳити дохилизаминӣ одатан ҳамчун далели он гирифта шудааст, ки микроорганизмҳои мавҷуда ғайрифаъоланд ё хеле суст метаболизм мекунанд (Керр, 2002). Мавҷудияти вирусҳо шарҳи алтернативӣ пешниҳод мекунад, ки мувофиқи он вирусҳо популяцияи микробҳои фаъолро дар муҳити амиқи дохили замин назорат мекунанд. Лизиси вирусии ҳуҷайраҳои бактерияҳо маводи ғизоӣ ҷудо мекунад ва дар мубодилаи микробҳо дар экосистемаҳои амиқи баҳри амиқ саҳми муҳим мегузорад (Дановаро ва дигарон, 2008). Аммо, фаъолияти чунин вирусҳои литикӣ дар обҳои зеризаминии гранитии зеризаминӣ то ҳол тавассути парвариш ва ҷудокунӣ тасдиқ нашудааст.

Обҳои амиқи зеризаминӣ дар ҷинсҳои гранитӣ анаэробӣ буда, дорои якчанд гурӯҳи метаболикии микроорганизмҳо, аз ҷумла бактерияҳои сульфатро коҳиш медиҳанд (Ҳолбек ва Педерсен, 2008). Вирусҳо, ки дар муҳити табиӣ пайдо мешаванд, аксар вақт ба намудҳои мушаххас хос буданд (Suttle, 2005) ва онҳоро аз муҳитҳое, ки мизбон дар он ҷо буд, ҷудо кардан мумкин буд. Бактериофагҳо (фагҳо) ба се намуди сулфат коҳишдиҳанда сироят мекунанд Десулфовибрио қаблан гузориш дода шуда буд: Рапп ва Уолл (1987) фагҳоеро ёфтанд, ки метавонанд дар интиқоли онҳо миёнаравӣ кунанд. Desulfovibrio desulfuricans фагҳои лизогении аз ҷониби митомицин С ангезишуда ҷудо карда шудаанд Desulfovibrio vulgaris аз ҷониби Handley ва дигарон. (1973) ва Уокер ва дигарон. (2006) ва Камимура ва Араки (1989) як фаги литикии сирояткунандаро ҷудо карданд. Десульфовибрио салксигенҳо.

Дар ин чо фаъолияти фагхо дар обхои зеризаминии Äspö HRL санчида шуд Desulfovibrio aespoeensis ҳамчун мизбон. Ин бактерия аз Äspö HRL ҷудо карда шуда, 10 сол пеш тавсиф шудааст (Motamedi and Pedersen, 1998). Он борҳо аз обҳои зеризаминии Äspö HRL ғанӣ карда шуда, бо пайдарпаии генҳои 16S rRNA -и он муайян карда шудааст (Pedersen et al., 1996 Fru and Athar, 2008). Дар натиҷа далели қавӣ мавҷуд буд D. aespoeensis як намуди бумӣ дар обҳои зеризаминии Äspö HRL мебошад. Дар ин ҷо мо дар бораи сирояти фагҳо гузориш медиҳем D. aespoeensis дар Äspö HRL, бо техникаи эҳтимолии эҳтимолӣ (MPN) таҳлил карда шудааст. Даҳ чоҳи чуқурии аз 183 то 455 м таҳқиқ карда шуданд. Фагҳо аз фарҳангҳои MPN ҷудо карда шуданд ва аз рӯи морфология ва диапазони мизбон бо истифода аз шаш намуди гуногуни Десулфовибрио, инчунин даҳ изолятҳои гуногуни SRB аз обҳои зеризаминии Äspö HRL. Афзоиши фарҳангҳои SRB ва партияҳои фаг пайгирӣ карда шуд ва иммунитети ҳуҷайраҳо ба изолятҳои фагӣ таҳлил карда шуд.


Тавлиди ҳуҷайраҳои Т-хоси мултивирусӣ тавассути як ҳавасмандкунии як ҳуҷайраҳои мононуклеарии периферии хун бо омехтаи пептид бо истифода аз муҳити бе хуноба

Замина: Барқарорсозии иммунитети хоси вирус аз ҷониби ҳуҷайраҳои Т-вируси мушаххас (VSTs) алтернативаи ҷолибро ба доруҳои анъанавӣ пешкаш мекунад ва метавонад дар беморони масунияти заиф, аз ҷумла гирандагони трансплантатсияи ҳуҷайраҳои гематопоэтикӣ (HSCT) хеле самаранок бошад. Бо вуҷуди ин, истеҳсоли анъанавии VSTs омодасозии ҳуҷайраҳои махсуси муаррифии антигенҳо (APCs), фарҳанги тӯлонии ex vivo дар муҳити дорои хуноба ва дубора стимулясияи антигенро бо вирусҳо ё векторҳои вирусиро талаб мекунад, то антигенҳои вирусиро барои муаррифӣ дар APCs таъмин кунанд.

Усулҳо: Барои содда кардани ин раванди мураккаб, мо усули тавлиди VST-ҳои сершумор тавассути ҳавасмандкунии мустақими ҳуҷайраҳои мононуклеарии хуни периферӣ (PBMCs) бо китобхонаҳои пептидӣ дар муҳити бе зардобро таҳия кардем.

Натиҷаҳо: Мо VST-ҳоро тавлид кардем, ки ҳафт вирусро (цитомегаловирус [CMV], вируси Эпштейн-Барр [EBV], аденовирус [AdV], герпесвируси одам 6 [HHV-6], вируси BK [BKV], вируси JC [JCV] ва вируси Varicella Zoster равона карда буданд. [VZV]) дар як сатр. Фенотип, афзоиш ва вижагии якчанд VST-ҳои дар муҳити бе хуноба истеҳсолшуда ба онҳое, ки дар муҳити муқаррарии дорои хуноба тавлид шудаанд, баробар буданд.

Муҳокима: Истифодаи василаи бе хуноба имкон медиҳад, ки ин равиш ба амалияи клиникӣ бо арзиши камтар ва дубора тавлидшаванда бинобар мавҷуд набудани тағирёбии партия ба партия дар хуноба ва бидуни нигаронӣ барои агентҳои сироятӣ дар хуноба истифодашаванда ҷорӣ карда шавад. Ин равиши соддакардашуда ҳоло дар гирандагони HSCT-и бародари лейкоцитҳои антиген (HLA) озмоиш карда мешавад.

Калидвожаҳо: Т-лимфоцитҳои трансплантатсияи ҳуҷайраҳои гематопоэтикии бунёдӣ бидуни хуноба, антигенҳои вирусии бемориҳои вирусӣ.


Усулҳои стерилизатсияи ВАО ва ҳаво (бо диаграмма)

Биореакторро бо роҳи нест кардани организмҳо тавассути гармӣ/кимиёвӣ/радиатсия ё баъзан бо тартиби физикӣ ба монанди филтратсия стерилизатсия кардан мумкин аст.

Стерилизатсияи васоити ахбори омма ва ҳаво дар зер баррасӣ мешаванд:

1. Стерилизатсияи воситаҳои фарҳангӣ:

Қисмҳои васоити ахбори омма, об ва зарфҳо ба олуда шудани ҳуҷайраҳои растанӣ ва спораҳо мусоидат мекунанд. Пеш аз истифода дар ферментатсия, васоити ахбори омма бояд аз ифлосшавӣ озод бошад. Стерилизатсияи васоити ахбори умум бештар бо истифода аз гармӣ ва то андозае бо дигар усулҳо (усулҳои физикӣ, коркарди кимиёвӣ ва радиатсия) ба даст меояд.

Стерилизатсияи гармӣ:

Гармӣ усули маъмултарини стерилизатсия мебошад. Сифат ва миқдори ифлосшавӣ (яъне намуд ва бори микроорганизмҳо), таркиби муҳити зист ва рН ва андозаи зарраҳои боздошташуда омилҳои муҳиме мебошанд, ки ба муваффақияти стерилизатсияи гармӣ таъсир мерасонанд.

Умуман, ҳуҷайраҳои растанӣ дар ҳарорати паст дар як муддати кӯтоҳ нобуд мешаванд (тақрибан 60 ° C дар 5-10 дақиқа). Аммо, нобуд кардани қаламчаҳо ҳарорати баландтар ва вақти нисбатан дарозтарро талаб мекунад (тақрибан 80 ° C барои 15-20 дақиқа). Спораҳои стеартермофилҳои Bacillus аз ҳама тобовар ба гармӣ мебошанд. Дар асл, ин организм барои озмоиши безурётии таҷҳизоти ферментатсия истифода мешавад.

Усулҳои физикӣ:

Усулҳои физикӣ ба монанди филтратсия, центрифугализатсия ва адсорбсия (ба ивазкунандаи ионҳо ё карбон фаъол) истифода мешаванд. Дар байни инҳо филтратсия бештар истифода мешавад. Баъзе ҷузъҳои (витаминҳо, ҷузъҳои хун, антибиотикҳо) -и васоити фарҳангӣ ба гармӣ тобоваранд ва аз ин рӯ бо стерилизатсияи гармӣ нобуд карда мешаванд. Чунин ҷузъҳои муҳит комилан пароканда мешаванд (комилан муҳим ё вагарна онҳо ҳамроҳ бо микроорганизмҳо хориҷ карда мешаванд) ва сипас ба стерилизатсияи филтр дучор мешаванд.

Якчанд маҳдудиятҳои техникаи филтратсия вуҷуд доранд:

1. Истифодаи фишори баланд дар филтратсия барои соҳаҳо номувофиқ аст.

2. Баъзе ҷузъҳои васоити ахбори омма ҳангоми филтратсия метавонанд аз ВАО гум шаванд.

Баъзан, маҷмӯи филтратсия ва стерилизатсияи гармӣ истифода мешаванд. Масалан, обе, ки барои тайёр кардани васоити ахбори омма истифода мешавад, филтр карда мешавад, дар ҳоле ки маҳлули консентратсияи ғизоӣ ба стерилизатсияи гармӣ дучор мешавад. Ҳоло оби филтршуда барои пароканда кардани васоити ахбори омма илова карда мешавад. Усулҳои кимиёвӣ (бо истифода аз дезинфексияҳо) ва расмиёти радиатсионӣ (бо истифода аз рентгенҳои ултрабунафш, у-рентгенҳо) барои стерилизатсияи воситаҳои ахбори омма одатан истифода намешаванд.

Воситаҳои фарҳангӣ дар ҳаҷмҳои партия, дар биореактор дар ҳарорати 121 ° C стерилизатсия карда мешаванд. Стерилизатсияи партияро метавон тавассути ворид кардани буғ ба миёна (усули мустақим) ё ворид кардани буғ ба каторҳои дохилӣ (усули бавосита) анҷом дод. Барои стерилизатсияи партияи мустақим буғ бояд пок ва аз ҳама иловаҳои кимиёвӣ холӣ бошад (ки одатан аз раванди истеҳсоли буғ ба вуҷуд меояд).

Ду камбудиҳои стерилизатсияи партия мавҷуданд:

1. Зарар ба воситаҳои фарҳангӣ:

Тағйирёбии моддаҳои ғизоӣ, тағирёбии рН ва ранг кардани васоити фарҳанг маъмуланд.

2. истеъмоли энергия баланд:

Барои ба даст овардани ҳарорати лозимии биореактор чанд соат (2-4 соат) лозим мешавад (яъне 120 ° C). 20-60 дақиқаи дигар барои раванди воқеии стерилизатсия, пас аз хунуккунӣ барои 1-2 соат. Ҳамаи ин раванд сарфи беҳудаи энергияро дар бар мегирад ва аз ин рӯ стерилизатсияи партия хеле гарон аст.

Стерилизатсияи доимӣ:

Стерилизатсияи муттасил дар 140 ° C дар як муддати хеле кӯтоҳ аз 30 то 120 сония гузаронида мешавад. (Ин дар муқоиса бо ферментатсияи партия дар ҳарорати 121 ° C дар давоми 20-60 дақиқа анҷом дода мешавад). Ин ба принсип асос ёфтааст, ки вақти барои куштани микроорганизмҳо дар ҳарорати баланд хеле кӯтоҳтар аст. Стерилизатсияи доимӣ тавассути ворид кардани буғ ё тавассути гармкунакҳо сурат мегирад.

Дар ҳар ду ҳолат, ҳарорат хеле зуд ба 140 ° C боло бурда мешавад ва дар давоми 30-120 сония нигоҳ дошта мешавад. Марҳилаҳои раванди безараргардонии пайваста ва ҳарорати мувофиқ дар расми 19.7 тасвир шудааст. Марҳилаҳои гуногун инҳоянд: ивазкунанда, гармкунак, агрегати нигоҳдории гармӣ, барқароркунии гармии боқимонда, хунуккунӣ ва ферментатор.

Дар раванди стерилизатсияи доимӣ 3 намуди гармидиҳанда истифода мешавад. Аввалин гармкунак дар давоми 20—30 сония хароратро ба 90—1 20°С мерасонад. Мубодилаи дуюм ҳароратро то 140 ° C баланд мекунад ва дар давоми 30-120 сония нигоҳ медорад. Гарм ивазкунандаи сеюм дар давоми 20-30 сония хунук карда, ҳароратро паст мекунад. Вақти воқеӣ барои стерилизатсия аз андозаи зарраҳои овезон вобаста аст. Андоза калонтар аст, ҳамон қадар вақти лозимӣ зиёдтар аст.

Бартарии асосии стерилизатсияи пайваста дар он аст, ки тақрибан 80-90% энергия сарфа карда мешавад. Аммо маҳдудият дар он аст, ки пайвастагиҳои муайян дар миёна (масалан, фосфати калсий, оксалати калсий) аз сабаби фарқияти ҳарорати хеле баланд, ки дар як муддати хеле кӯтоҳ байни стерилизатсия ва хунуккунӣ ба вуҷуд меоянд. Воситаҳои фарҳангии дорои крахмал ҳангоми стерилизатсияи пайваста часпак мешаванд ва аз ин рӯ истифода намешаванд.

2. Стерилизатсияи ҳаво:

Умуман, ферментатсияҳои саноатӣ дар зери аэрацияи қавӣ ва пайваста гузаронида мешаванд. Барои ферментатсияи самаранок, ҳаво бояд комилан безарар бошад ва аз ҳама микро & шорганизмҳо ва зарраҳои боздошташуда озод бошад. Дар миқдори зарраҳо ва микробҳои боздошташуда дар ҳавои берунии атмосфера фарқияти васеъ вуҷуд дорад.

Микроорганизмҳо метавонанд аз 10-2,000/ м 3 дар ҳоле ки зарраҳои боздошташуда метавонанд 20-100,00/ м 3 бошанд. Дар байни микроорганизмҳои дар ҳаво мавҷудбуда спораҳои занбӯруғҳо (50%) ва бактерияҳои грамм-манфӣ (40%) бартарӣ доранд. Ҳаво ё дигар газҳоро тавассути филтратсия, гармӣ, радиатсияи ултрабунафш ва тозакунии газ стерилизатсия кардан мумкин аст. Дар байни онҳо, гармӣ ва филтратсия бештар истифода мешаванд.

а) стерилизатсияи ҳаво бо гармӣ:

Дар солҳои аввал, ҳаво аз болои унсурҳои гармидиҳӣ гузаронида шуда, стерилизатсия карда мешуд. Аммо ин хеле харочот аст, бинобар ин имрузхо истифода намешаванд.

(б) стерилизатсияи ҳаво тавассути филтратсия:

Филтркунии ҳаво стерилизатсияи маъмултарин дар соҳаи ферментатсия мебошад.

Ҳангоме ки ҳаво аз пашми шишагини дорои филтрҳои чуқур мегузарад, зарраҳо ба дом афтода мешаванд ва хориҷ карда мешаванд (расми 19.8). Ин техникаи филтратсия пеш аз ҳама таъсироти ҷисмониро ба монанди инерсия, басташавӣ, ҷозиба, ҷалби электростатикӣ ва диффузия дар бар мегирад. Филтрҳои пашми шишагиро ба стерилизатсияи буғ гирифтан ва аз нав истифода бурдан мумкин аст. Аммо дар истифодаи такрории онҳо маҳдудият вуҷуд дорад, зеро пашми шиша ҳангоми стерилизатсияи буғ коҳиш меёбад ва мустаҳкам мешавад. Дар солҳои охир, картриджҳои филтрии нахи шишагӣ (ки маҳдудияти филтри пашми шишаро надоранд) истифода мешаванд.


Генерал

Ҳуҷайраҳои микроглиалии одами табдилёфта хусусиятҳои ҳуҷайраҳои ибтидоии микроглиалиро нигоҳ медоранд. Онҳо популясияҳои якхелаи ҳуҷайраҳоро ифода мекунанд, ки онҳоро номуайян парвариш кардан мумкин аст ва метавонад як системаи муносиб барои таҳлили биохимиявии вазифаҳои ҳуҷайраҳои микроглиал бошад. Тавре ки дар таҷрибаҳои пешакӣ нишон дода шудааст, онҳо инчунин метавонанд трансфексияҳои минбаъдаро дастгирӣ кунанд, ки барои омӯзиши танзими ифодаи генҳои гуногуни трансфексияшуда дар ҳуҷайраҳои микроглиалӣ имкон медиҳанд.

Хусусиятҳо

Муомилоти иттилоот

  1. Ҳама контейнерҳоро барои шоридан ё шикастан санҷед.
  2. Ҳуҷайраҳои яхкардашударо аз бастаи яхбандии хушк хориҷ кунед ва фавран ҳуҷайраҳоро дар ҳарорати зери -130 ° C ва беҳтараш дар буғи нитрогени моеъ то истифода омода кунед.

Барои таъмини сатҳи баландтарини қобилиятнокӣ, шишаро гудохта ва фарҳангро ҳарчи зудтар пас аз гирифтани он оғоз кунед. Агар ҳангоми расидан нигаҳдории идомаи фарҳанги яхкардашуда лозим ояд, он бояд дар марҳилаи буғи нитрогени моеъ нигоҳ дошта шавад, на дар -70 ° C. Нигоҳдорӣ дар -70°C боиси аз даст додани қобилияти зиндагӣ мегардад.

  1. Флаконро бо нарм омехта дар ваннаи обии 37°C об кунед. Барои кам кардани эҳтимолияти олудашавӣ, ҳалқаи O ва сарпӯшро аз об нигоҳ доред. Обшавии об бояд зуд бошад (тақрибан 2 дақиқа).
  2. Ҳангоме ки мундариҷа об мешавад, шишаро аз ваннаи об хориҷ кунед ва бо тар кардан ё пошидани 70% этанол безарар гардонед. Ҳама амалиётҳо аз ин лаҳза бояд дар шароити сахти асептикӣ анҷом дода шаванд.
  3. Мундариҷаи шишаро ба найчаи центрифуга, ки дорои муҳити пурраи фарҳанги 9.0 мл мебошад, интиқол диҳед. ва тақрибан дар 125 x чарх занед g барои 5 то 7 дақиқа.
  4. Пеллети ҳуҷайраҳоро бо василаи мукаммали тавсияшуда боздоред (нигаред ба маълумоти мушаххаси партия барои таносуби тавсияшудаи парҳезии фарҳанг). Ҳангоми барқарор кардани ҳуҷайраҳо аз сілтияти аз ҳад зиёди муҳити атроф пешгирӣ кардан муҳим аст. Тавсия дода мешавад, ки пеш аз илова кардани мундариҷаи шиша, зарфи парвариши дорои муҳити пурраи афзоиш дар инкубатор ҳадди аққал 15 дақиқа ҷойгир карда шавад, то ба муҳити муқаррарии рН (7,0 то 7,6) расад. pH (7.0 то 7.6)
  5. Фарҳангро дар 37 & degC дар инкубатори мувофиқ инкубатсия кунед. 5% CO2 дар атмосфераи ҳаво тавсия дода мешавад, ки ҳангоми истифодаи муҳити дар ин варақаи маҳсулот тавсифшуда.
  1. Муҳити фарҳангиро хориҷ ва партоед.
  2. Қабати ҳуҷайраҳоро бо маҳлули 0.25% (w/v) Трипсин- 0.53 мм EDTA кӯтоҳ шуед, то ҳама нишонаҳои хуноба, ки дорои ингибитор трипсин аст, нест кунед.
  3. Ба колба 2,0 то 3,0 мл маҳлули Трипсин-EDTA илова кунед ва то пароканда шудани қабати ҳуҷайра дар зери микроскопи баръакс ҳуҷайраҳоро мушоҳида кунед (одатан дар давоми 5 то 15 дақиқа).
    Эзоҳ: Барои пешгирӣ кардани ҷамъшавӣ, ҳуҷайраҳоро бо зарба додан ё ларзондан ба колбача ҳангоми интизори ҷудо шудани ҳуҷайраҳо ба хашм наоваред. Ҳуҷайраҳоеро, ки ҷудо кардан душвор аст, метавонанд дар ҳарорати 37°C ҷойгир карда шаванд, то пароканда шаванд.
  4. Бо нармӣ пипетинг кардан 6.0 то 8.0 мл муҳити пурраи афзоиш ва ҳуҷайраҳои аспиратиро илова кунед.
  5. Аликвотҳои мувофиқи таваққуфи ҳуҷайраҳоро ба зарфҳои нави фарҳангӣ илова кунед.
    Фарҳангҳоро дар байни 1 x 10 4 ва 4 x 10 4 ҳуҷайраҳои қобили зиндагӣ/см 2 таъсис додан мумкин аст. Аз 7 x 10 4 ҳуҷайра/см 2 зиёд набошед.
  6. Фарҳангҳоро дар ҳарорати 37°С инкубатор кунед.

Мушаххасоти назорати сифат

Таърих

Радди ҳуқуқӣ

Маҳсулот "ҲАМОН тавре ки" мавҷуд аст ва қобилияти коркарди маҳсулоти ATCC & reg дар давоми 30 рӯз аз рӯзи интиқол кафолат дода мешавад, ба шарте ки муштарӣ маҳсулотро тибқи маълумоти дар варақаи иттилоот дар бораи маҳсулот, вебсайт ва Шаҳодатномаи таҳлил. Барои фарҳангҳои зинда, ATCC формулаи ВАО ва реактивҳоро номбар мекунад, ки барои маҳсулот самаранок мебошанд. Дар ҳоле ки дигар васоити ахбори омма ва реагентҳои номаълум низ метавонанд натиҷаҳои қаноатбахш ба даст оранд, тағирот дар протоколҳои ATCC ва/ё аз ҷониби амонатгузор тавсияшуда метавонад ба барқароршавӣ, афзоиш ва/ё функсияи маҳсулот таъсир расонад. Агар формулаи алтернативии миёна ё реагент истифода шавад, кафолати ATCC барои қобили амал будан дигар эътибор надорад. Ба истиснои он чизе, ки дар ин ҷо ба таври возеҳ нишон дода шудааст, ҳеҷ гуна кафолати дигар, ифода ё пешбинӣ карда нашудааст, аз ҷумла ҳама гуна кафолатҳои пешбинишудаи фурӯш, мувофиқат ба ҳадафи муайян, истеҳсол тибқи стандартҳои cGMP, хосият, бехатарӣ, саҳеҳӣ , ва/ё вайрон накардан.

Ин маҳсулот танҳо барои тадқиқоти лабораторӣ пешбинӣ шудааст. Он барои истифодаи терапевтии ҳайвонот ё инсон, истеъмоли инсон ё ҳайвонот ё ҳама гуна истифодаи ташхис пешбинӣ нашудааст. Ҳама гуна истифодаи тиҷоратии пешниҳодшуда бидуни иҷозатномаи ATCC манъ аст.

Дар ҳоле ки ATCC саъю кӯшиши оқилона дорад, то маълумоти дақиқ ва муосирро дар ин варақаи маҳсулот дохил кунад, ATCC дар бораи дурустии он ҳеҷ гуна кафолат ё изҳорот намедиҳад. Иқтибосҳо аз адабиёти илмӣ ва патентҳо танҳо бо мақсади иттилоотӣ пешниҳод карда мешаванд. ATCC кафолат намедиҳад, ки ин маълумот дуруст ё пуррагӣ тасдиқ карда шудааст ва фармоишгар танҳо масъулияти тасдиқи дурустӣ ва пуррагии ин гуна маълумотро дорад.

Ин маҳсулот ба шарте фиристода мешавад, ки фармоишгар барои қабул, коркард, нигоҳдорӣ, ихтиёрдорӣ ва истифодаи маҳсулоти ATCC масъул ва ба дӯши худ мегирад, аз ҷумла бидуни маҳдудият тамоми чораҳои дахлдори бехатарӣ ва коркард барои кам кардани саломатӣ ё хатари экологӣ. Ҳамчун шарти гирифтани мавод, фармоишгар розӣ аст, ки ҳама гуна фаъолияте, ки бо маҳсулоти ATCC анҷом дода мешавад ва насл ё тағирот тибқи ҳама қонунҳо, қоидаҳо ва дастурҳои амалкунанда сурат мегирад. Ин маҳсулот "тавре ки ҳаст" таъмин карда мешавад, бидуни ҳеҷ гуна эъломия ё кафолат, ба истиснои мавридҳое, ки дар ин ҷо ба таври возеҳ баён шудаанд ва дар ҳеҷ сурат набояд ATCC, волидайн, филиалҳо, директорон, афсарон, агентҳо, кормандон, таъйинкунандагон, ворисон ва шарикони он бавосита ҷавобгар бошанд , зарари махсус, тасодуфӣ ё пайдарпайи ҳама гуна намуди марбут ба истифодаи муштарӣ аз маҳсулот. Гарчанде ки барои таъмини дурустӣ ва эътимоднокии мавод дар амонат саъю кӯшиши оқилона карда мешавад, ATCC барои зарари дар натиҷаи нодуруст муайян ё пешниҳоди нодурусти ин маводҳо масъул нест.


Усулҳои тозакунии сафедаҳо: 4 усул

Усулҳое, ки дар тозакунии сафеда истифода мешаванд, тақрибан ба усулҳои аналитикӣ ва тайёрӣ тақсим мешаванд.

Фарқият дақиқ нест, аммо омили ҳалкунанда миқдори сафеда мебошад, ки онро амалан бо ин усул тоза кардан мумкин аст. Усулҳои таҳлилӣ ошкор ва муайян кардани сафедаи омехта мебошанд, дар ҳоле ки усулҳои омодагӣ ба тавлиди миқдори зиёди сафеда барои мақсадҳои дигар, ба монанди биологияи сохторӣ ё истифодаи саноатӣ. Умуман, усулҳои омодагӣ метавонанд дар барномаҳои таҳлилӣ истифода шаванд, аммо на баръакс.

Усули № 1. Истихроҷ:

Вобаста аз манбаъ, сафеда бояд бо роҳи шикастани бофта ё ҳуҷайраҳои дорои он ба маҳлул оварда шавад. Якчанд усулҳои ноил шудан ба ин яхкунӣ ва обшавии такрорӣ, sonication, гомогенизатсия тавассути фишори баланд ё пермебилизатсия тавассути ҳалкунандаҳои органикӣ мавҷуданд. Усули интихоб аз он вобаста аст, ки сафеда то чӣ андоза ноустувор аст ва ҳуҷайраҳо то чӣ андоза мустаҳкаманд.

Пас аз ин раванди истихроҷ, сафедаи ҳалшаванда дар ҳалкунанда хоҳад буд ва онҳоро метавон аз мембранаҳои ҳуҷайра, ДНК ва ғайра тавассути центрифуга ҷудо кард. Раванди истихроҷ инчунин протеазҳоро истихроҷ мекунад, ки онҳо ба ҳазм кардани сафедаҳои маҳлул шурӯъ мекунанд. Агар сафеда ба протеолиз ҳассос бошад, одатан матлуб аст, ки зуд идома дода, иқтибосро хунук нигоҳ дошта, протеолизро суст кунед.

Усули №2. Боришот ва ҳалли дифференсиалӣ:

Ҳангоми тозакунии сафедаҳои оммавӣ қадами аввалини ҷудо кардани сафедаҳо боришот бо сулфат аммоний (NH) мебошад.4)2СО4. Ин бо роҳи илова кардани миқдори афзояндаи сулфат аммоний ва ҷамъ овардани фраксияҳои гуногуни сафедаи боришот анҷом дода мешавад. Як бартарии ин усул дар он аст, ки онро бо ҳаҷми хеле калон арзон иҷро кардан мумкин аст.

Аввалин сафедаҳои тозашуда сафедаҳои дар об ҳалшаванда мебошанд. Тоза кардани сафедаҳои мембранаи интегралӣ вайрон кардани мембранаи ҳуҷайраҳоро талаб мекунад, то ягон сафедаи мушаххасро аз дигарон, ки дар як ҳуҷраи мембрана ҷойгиранд, ҷудо кунанд. Баъзан як кашиши махсуси мембрана метавонад аввал ҷудо карда шавад, масалан ҷудо кардани митохондрия аз ҳуҷайраҳо пеш аз тоза кардани сафедаи дар мембранаи митохондрия ҷойгиршуда.

Барои пароканда кардани мембранаҳои ҳуҷайра ва нигоҳ доштани сафедаҳои мембрана ҳангоми тозакунӣ шустушӯй ба монанди натрий додецил сулфати (SDS) метавонад истифода шавад, зеро SDS денатуратсияро ба вуҷуд меорад, шустушӯйҳои нармтар ба монанди Triton X-100 ё CHAPS метавонанд барои нигоҳ доштани сафеда истифода шаванд. Конфигуратсияи модарии 8217s ҳангоми тозакунӣ.

Усули №3. Ультрацентрифугация:

Центрифуга ҷараёнест, ки барои ҷудо кардани омехтаҳои зарраҳои масса ё зичии гуногун дар моеъ овезоншуда қувваи марказро истифода мебарад. Вақте ки зарфе (одатан қубур ё шиша), ки омехтаи сафедаҳо ё дигар моддаҳои заррача дорад, ба монанди ҳуҷайраҳои бактериявӣ, бо суръати баланд гардиш мекунад, импулси кунҷӣ ба ҳар як зарра қувваи берунӣ медиҳад, ки ба массаи он мутаносиб аст.

Тамоили ба воситаи моеъ ҳаракат кардани як зарра аз сабаби ин қувва бо муқовимати моеъ ба зарра ҷуброн карда мешавад. Таъсири софи намуна дар центрифуга дар он аст, ки зарраҳои азим, хурд ва зич нисбат ба зарраҳо ё зарраҳои камтар бо моеъи бештар “драҷ ” зудтар ба берун ҳаракат мекунанд.

Ҳангоме ки суспензияҳои зарраҳо дар як центрифуга печонида мешаванд, дар поёни зарф як зарбаи "8220" пайдо шуда метавонад, ки барои зарраҳои аз ҳама калон бо кашиши пасти моеъ бой карда шудааст. Зарраҳои боқимондаи фишурдашуда, ки ҳоло ҳам асосан дар моеъ боқӣ мемонанд, “супернатант” номида мешаванд ва онҳоро аз зарф хориҷ кардан мумкин аст, то супернатантро аз пеллет ҷудо кунад.

Суръати центрифуга бо суръатбахшии кунҷӣ ба намуна истифода мешавад, ки маъмулан дар муқоиса бо g чен карда мешавад. Агар намунаҳо ба қадри кофӣ центрифугал карда шаванд, зарраҳо дар зарф ба мувозинат мерасанд, ки дар он зарраҳо махсусан дар як нуқтаи зарф ҷамъ мешаванд, ки зичии устувори онҳо бо қувваи марказишавӣ мувозинат ёфтааст. Чунин центрифугакунии “мувозинат” метавонад ба тозакунии васеи заррачаи додашуда имкон диҳад.

Sucrose gradient centrifugation:

A linear concentration gradient of sugar (typically sucrose glycerol, or Percoll) is generated in a tube such that the highest concentration is on the bottom and lowest on top. A protein sample is then layered on top of the gradient and spun at high speeds in an ultracentrifuge. This causes heavy macromolecules to migrate towards the bottom of the tube faster than lighter material.

During centrifugation in the absence of sucrose, as particles move farther and farther from the centre of rotation, they experience more and more centrifugal force (the further they move, the faster they move). The problem with this is that the useful separation range within the vessel is restricted to a small observable window.

Spinning a sample twice as long does not mean the particle of interest will go twice as far in fact, it will go significantly farther. However when the proteins are moving through a sucrose gradient, they encounter liquid of increasing density and viscosity.

A properly designed sucrose gradient will counteract the increasing centrifugal force, so the particles move in close proportion to the time they have been in the centrifugal field. Samples separated by these gradients are referred to as “rate zonal” centrifugations. After separating the protein/particles, the gradient is then fractionated and collected.

Method # 4. Chromatographic Methods:

Usually a protein purification protocol contains one or more chromatographic steps. The basic procedure in chromatography is to flow the solution containing the protein through a column packed with various materials. Different proteins interact differently with the column material, and can thus be separated by the time required to pass the column, or the conditions required to elute the protein from the column. Usually proteins are detected as they are coming off the column by their absorbance at 280 nm.

Many different chromatographic methods exist:

1. Size Exclusion Chromatography:

Chromatography can be used to separate protein in solution or denaturing conditions by using porous gels. This technique is known as size exclusion chromatography. The principle is that smaller molecules have to traverse a larger volume in a porous matrix. Consequentially, proteins of a certain range in size will require a variable volume of eluant (solvent) before being collected at the other end of the column of gel.

In the context of protein purification, the eluant is usually pooled in different test tubes. All test tubes containing no measurable trace of the protein to purify are discarded. The remaining solution is thus made of the protein to purify and any other similarly-sized proteins.

2. Ion Exchange Chromatography:

Ion exchange chromatography separates compounds according to the nature and degree of their ionic charge. The column to be used is selected according to its type and strength of charge. Anion exchange resins have a positive charge and are used to retain and separate negatively charged com pounds, while cation exchange resins have a negative charge and are used to separate positively charged molecules.

Before the separation begins a buffer is pumped through the column to equilibrate the opposing charged ions. Upon injection of the sample, solute molecules will exchange with the buffer ions as each competes for the binding sites on the resin. The length of retention for each solute depends upon the strength of its charge.

The most weakly charged compounds will elute first, followed by those with successively stronger charges. Because of the nature of the separating mechanism, pH, buffer type, buffer concentration, and temperature all play important roles in controlling the separation. Ion exchange chromatography is a very powerful tool for use in protein purification and is frequently used in both analytical and preparative separations.

3. Affinity Chromatography:

Affinity Chromatography is a separation technique based upon molecular conformation, which frequently utilizes application specific resins. These resins have ligands attached to their surfaces which are specific for the compounds to be separated. Most frequently, these ligands function in a fashion similar to that of antibody-antigen interactions. This “lock and key” fit between the ligand and its target compound makes it highly specific, frequently generating a single peak, while all else in the sample is un-retained.

Many membrane proteins are glycoproteins and can be purified by lectin affinity chromatography. Detergent solubilized proteins can be allowed to bind to a chromatography resin that has been modified to have a covalently attached lectin.

Proteins that do not bind to the lectin are washed away and then specifically bound glycoproteins can be eluted by adding a high concentration of a sugar that competes with the bound glycoproteins at the lectin binding site. Some lectins have high affinity binding to oligosaccharides of glycoproteins that is hard to compete with sugars, and bound glycoproteins need to be released by denaturing the lectin.

4. Metal Binding:

A common technique involves engineering a sequence of 6 to 8 histidines into the C-terminal of the protein. The polyhistidine binds strongly to divalent metal ions such as nickel and cobalt. The protein can be passed through a column containing immobilized nickel ions, which binds the polyhistidine tag. All untagged proteins pass through the column.

The protein can be eluted with imidazole, which competes with the polyhistidine tag for binding to the column, or by a decrease in pH (typically to 4.5), which decreases the affinity of the tag for the resin. While this procedure is generally used for the purification of recombinant proteins with an engineered affinity tag (such as a 6xHis-tag or Clontech’s HAT tag), it can also be used for natural proteins with an inherent affinity tor divalent cations.

5. Immunoaffinity Chromatography:

Immunoaffinity chromatography uses the specific binding of an antibody to the target protein to selectively purify the protein. The procedure involves immobilizing an antibody to a column material, which then selectively binds the protein, while everything else flows through. The protein can Ix eluted by changing the pH or the salinity. Because this method does not involve engineering in a tag, it can be used for proteins from natural sources.

6. HPLC:

High performance liquid chromatography or high pressure liquid chromatography is a form of chromatography applying high pressure to drive the solutes through the column faster. This means that the diffusion is limited and the resolution is improved. The most common form is “reversed phase” HPLC, where the column material is hydrophobic.

The proteins are eluted by a gradient of increasing amounts of an organic solvent, such as acetonitrile. The proteins elute according to their hydrophobicity. After purification by HPLC the protein is in a solution that only contains volatile compounds, and can easily be lyophilized. HPLC purification frequently results in denaturation of the purified proteins and is thus not applicable to proteins that do not spontaneously refold.


Growth Curve of Bacteria: 4 Phases

After inoculation into the sterile nutrient medium, the bacterium first under­goes a period of acclimatisation. At that time, necessary enzymes and intermediate metabolites are synthesised, thereby bacte­rium reaches a critical stage before multi­plication, multiplication takes place at this stage.

The duration of lag phase depends on the type of bacteria, quality of culture medium, size of inoculum and several environmental factors such as CO2, temperature, pH, etc. The average time of lag phase is 2 hours, although it varies from species to species (1-4 hours).

2. Log Phase or Exponential Phase:

In this phase, the bacteria undergo cell division and their population (number) increase exponentially at a logarithmic rate. The number of viable count, when plotted against time, gives a straight line of inclined fashion. The average time of log phase is 8 hours, though it varies in different species.

3. Stationary Phase:

In this phase, the growth i.e., cell division, almost ceases due to exhaustion of nutrients and also the accu­mulation of toxic products. At this stage the cell death starts at a slow rate and is com­pensated by the formation of new cell through cell division.

The total cell number increases at a slow rate, but the viable count remains almost constant. The duration of this phase is variable which ranges from few days to few hours. Secondary metabolites like antibiotics, toxins etc. are produced in this phase.

4. Decline Phase:

In the phase of decline, the total number of cells remains constant, but the number of viable cells gradually decreases due to exhaustion of nutrients and also the accumulation of toxic products. In some cases a few- cells remain viable for long time, even after death of most of the cells. These viable cells probably grow by utilising nutrients released from dead cells.

The cells attain maximum size at the end of lag phase and become smaller in log phase (exponential phase). In spore forming species, the sporulation occurs at the end of log phase (exponential phase) or in the early part of sta­tionary phase.


Nanoluciferase Reporter Mycobacteriophage for Sensitive and Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis Drug Susceptibility

Phenotypic testing for drug susceptibility of Туберкулёзи микобактерия is critical to basic research and managing the evolving problem of antimicrobial resistance in tuberculosis management, but it remains a specialized technique to which access is severely limited. Here, we report on the development and validation of an improved phage-mediated detection system for Туберкулёзи М. We incorporated a nanoluciferase (Nluc) reporter gene cassette into the TM4 mycobacteriophage genome to create phage TM4-nluc. We assessed the performance of this reporter phage in the context of cellular limit of detection and drug susceptibility testing using multiple biosafety level 2 drug-sensitive and -resistant auxotrophs as well as virulent Туберкулёзи М. штаммҳо. For both limit of detection and drug susceptibility testing, we developed a standardized method consisting of a 96-hour cell preculture followed by a 72-hour experimental window for Туберкулёзи М. detection with or without antibiotic exposure. The cellular limit of detection of Туберкулёзи М. in a 96-well plate batch culture was ≤10 2 CFU. Consistent with other phenotypic methods for drug susceptibility testing, we found TM4-nluc to be compatible with antibiotics representing multiple classes and mechanisms of action, including inhibition of core central dogma functions, cell wall homeostasis, metabolic inhibitors, compounds currently in clinical trials (SQ109 and Q203), and susceptibility testing for bedaquiline, pretomanid, and linezolid (components of the BPaL regimen for the treatment of multi- and extensively drug-resistant tuberculosis). Using the same method, we accurately identified rifampin-resistant and multidrug-resistant Туберкулёзи М. штаммҳо.IMPORTANCE Туберкулёзи микобактерия, the causative agent of tuberculosis disease, remains a public health crisis on a global scale, and development of new interventions and identification of drug resistance are pillars in the World Health Organization End TB Strategy. Leveraging the tractability of the TM4 mycobacteriophage and the sensitivity of the nanoluciferase reporter enzyme, the present work describes an evolution of phage-mediated detection and drug susceptibility testing of Туберкулёзи М., adding a valuable tool in drug discovery and basic biology research. With additional validation, this system may play a role as a quantitative phenotypic reference method and complement to genotypic methods for diagnosis and antibiotic susceptibility testing.

Калидвожаҳо: Mycobacterium tuberculosis bacteriophages drug screening drug susceptibility testing nanoluciferase phage.

Copyright © 2020 Jain et al.

Рақамҳо

Schematic overview of phage reporter…

Schematic overview of phage reporter construct and method. TM4-nluc derives from modifying the…

Phage-mediated M. tuberculosis limit of…

Phage-mediated M. tuberculosis limit of detection is ≤10 2 CFU, and signal improves…

Seventy-two-hour drug susceptibility testing of…

Seventy-two-hour drug susceptibility testing of auxotroph and virulent M. tuberculosis strains with a…

Using defined drug-sensitive and -resistant…

Using defined drug-sensitive and -resistant M. tuberculosis auxotrophs TM4-nluc enables 72-hour resistance testing…


Cell culture-based production and in vivo characterization of purely clonal defective interfering influenza virus particles

Замина: Infections with influenza A virus (IAV) cause high morbidity and mortality in humans. Additional to vaccination, antiviral drugs are a treatment option. Besides FDA-approved drugs such as oseltamivir or zanamivir, virus-derived defective interfering (DI) particles (DIPs) are considered promising new agents. IAV DIPs typically contain a large internal deletion in one of their eight genomic viral RNA (vRNA) segments. Consequently, DIPs miss the genetic information necessary for replication and can usually only propagate by co-infection with infectious standard virus (STV), compensating for their defect. In such a co-infection scenario, DIPs interfere with and suppress STV replication, which constitutes their antiviral potential.

Натиҷаҳо: In the present study, we generated a genetically engineered MDCK suspension cell line for production of a purely clonal DIP preparation that has a large deletion in its segment 1 (DI244) and is not contaminated with infectious STV as egg-derived material. First, the impact of the multiplicity of DIP (MODIP) per cell on DI244 yield was investigated in batch cultivations in shake flasks. Here, the highest interfering efficacy was observed for material produced at a MODIP of 1E-2 using an in vitro interference assay. Results of RT-PCR suggested that DI244 material produced was hardly contaminated with other defective particles. Next, the process was successfully transferred to a stirred tank bioreactor (500 mL working volume) with a yield of 6.0E+8 PFU/mL determined in genetically modified adherent MDCK cells. The produced material was purified and concentrated about 40-fold by membrane-based steric exclusion chromatography (SXC). The DI244 yield was 92.3% with a host cell DNA clearance of 97.1% (99.95% with nuclease digestion prior to SXC) and a total protein reduction of 97.2%. Finally, the DIP material was tested in animal experiments in D2(B6).A2G-Mx1 r/r mice. Mice infected with a lethal dose of IAV and treated with DIP material showed a reduced body weight loss and all animals survived.

Хулоса: In summary, experiments not only demonstrated that purely clonal influenza virus DIP preparations can be obtained with high titers from animal cell cultures but confirmed the potential of cell culture-derived DIPs as an antiviral agent.

Калидвожаҳо: Animal experiments Antiviral Cell culture-based production DI244 Defective interfering particles Genetically engineered MDCK cells Influenza A virus Scale up Steric exclusion chromatography.