Маълумот

Хатти стандартӣ барои вақти воқеӣ

Хатти стандартӣ барои вақти воқеӣ


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ҳангоми иҷрои хатти стандартӣ барои баъзе праймерҳои нав барои озмоиши тағирёбии қат, оё хатти стандартиро иҷро кардан лозим аст? Ман дар назар дорам, ки агар дар таҷрибаи шумо якчанд генотипҳо барои як заминаи экотип мавҷуд бошанд, бо назорати корреспондентҳо ва табобатҳо, ман бояд барои ҳамаи ин сенарияҳо хатҳои стандартиро иҷро кунам, ё дурусттараш, ман метавонам бигӯям, ки танҳо як генотипи тасодуфии табобатшавандагон, нигаред ки он R = 0,99 аст ё баландтар ва самаранокии 2? Барои он ки масолеҳро беҳуда сарф накунанд.


Барои муайян кардани самаранокӣ барои ҳар як ҷуфти ибтидоӣ як маротиба каҷи стандартиро иҷро кунед. Шумо метавонед арзишҳои самаранокиро барои ҳар як шумораи такрорӣ бо ягон қолаб истифода баред.

Ман фикр мекунам, ки мо дар мақолаи қаблии шумо ин масъаларо каме баррасӣ кардаем.


Таъсири шаблон ба тавлиди каҷи стандартӣ барои миқдори мутлақи вируси РНК бо реаксияи занҷири баръакси транскриптаз-полимераз

Таъсири қолибҳои гуногун ба тавлиди каҷҳои стандартӣ, ки барои миқдори мутлақи вируси РНК тавассути транскриптаза-РНК (RT-PCR) дар вақти воқеӣ заруранд, арзёбӣ карда шуд. Мо ҳамчун намунаи вируси РНК барои таҳқиқот вируси мубталои некрозии панкреатиро (IPNV), як патогенҳои асосии вирусии лососии ваҳшӣ ва фарҳангӣ истифода бурдем. Силсилаи ҳалкунии чаҳор қолаби гуногун, ки гени протеазаи IPNV-ро намояндагӣ мекунанд (ду РНК дар vitro транскриптшудаи 100 асос ва 500 асос дарозӣ, як ДНК плазмидӣ ва олиго ДНК) ҳамчун қолаб барои тавлиди каҷҳои стандартӣ барои миқдори сарбории IPNV дар гулмоҳии рангинкамон истифода шуданд. . Нишеби, хуби мувофиқат (r(2)) ва самаранокии (e) PCR новобаста аз хусусияти қолаби дар ПЗР истифодашаванда аз ҷиҳати оморӣ баробар буданд. Бо истифода аз ANOVA факториалӣ, бо истифода аз чаҳор хатҳои гуногуни стандартӣ барои миқдори мутлақи IPNV дар гулмоҳҳои рангинкамони аз ҷиҳати таҷрибавӣ мушкилшуда фарқияти назаррас дар рақами нусхаи IPNV мушоҳида карда нашуд. Аммо, вақте ки фаровонии транскрипти IPNV камтар аз 100 нусха дар як реаксия буд ва вақте ки андозаи шаблон аз ампликони андозаи ампликон калонтар буд, тағирёбандатар буд. Маълумот нишон медиҳад, ки андозаи шаблоне, ки барои тавлиди каҷи стандартӣ истифода мешавад, бояд ба андозаи ампликон хеле монанд бошад. Шаблон синтетикии олигои ДНК барои ин мақсад оптималӣ хоҳад буд, зеро он метавонад фармоишӣ бошад ва танҳо барои синтези он маълумоти пайдарпайиро талаб кунад. Аммо, агар каҷи стандартӣ бо рақами нусхаи шаблон зиёда аз 100 нусха дар як реаксия тавлид шавад, табиати қолаб ба каҷи стандартӣ таъсир намерасонад ва аз ин рӯ, қолаби арзонтар интихоби бартарии қолаб аз дигараш хоҳад буд. имконоти гаронбаҳо.


Усули стандартии бар хати кандаро барои коркарди маълумот дар вақти воқеии ПТР

Замина: Дар айни замон PCR дар вақти воқеӣ усули дақиқтарин барои чен кардани ифодаи ген мебошад. Ин усул миқдори зиёди маълумоти хоми рақамиро тавлид мекунад ва коркард метавонад ба натиҷаҳои ниҳоӣ таъсир расонад. Коркарди маълумот ё ба кунҷҳои стандартӣ ё ба арзёбии самаранокии ПТР асос ёфтааст. Дар айни замон, усули самаранокии ПТР дар ПЗР -и нисбӣ бартарӣ дорад, дар ҳоле ки хатти стандартӣ одатан барои ПТР -и мутлақ истифода мешавад. Бо вуҷуди ин, барои истифодаи каҷҳои стандартӣ барои PCR нисбӣ монеа вуҷуд надорад. Ин мақола татбиқи усули каҷи стандартиро таъмин мекунад ва афзалиятҳо ва маҳдудиятҳои онро дар вақти воқеии ПТР баррасӣ мекунад.

Натиҷаҳо: Мо тартиби коркарди маълумотро дар вақти нисбии PCR таҳия кардем. Тартиб аз арзёбии самаранокии ПТР комилан канорагирӣ мекунад, иштироки операторро кам мекунад ва арзёбии омории варианти дохили таҳлилро таъмин мекунад. Тартиб қадамҳои зеринро дар бар мегирад. (I) Садо аз хонишҳои хоми флуоресцентӣ бо роҳи ҳамворкунӣ, тарҳкунии ибтидоӣ ва нормализатсияи амплитуда филтр карда мешавад. (II) Ҳадди оптималӣ ба таври худкор аз параметрҳои регрессияи хатти стандартӣ интихоб карда мешавад. (III) Нуқтаҳои гузариш (CPs) мустақиман аз координатаҳои нуқтаҳо гирифта мешаванд, ки хати остона аз қитъаҳои флуоресценсионӣ пас аз филтри садо ба даст омадааст. (IV) Воситаҳо ва фарқиятҳои онҳо барои CP дар репликаҳои PCR ҳисоб карда мешаванд. (V) Натиҷаҳои ниҳоӣ аз воситаҳои CPs гирифта мешаванд. Тафовутҳои CPs аз рӯи қонуни паҳншавии хатогӣ ба натиҷаҳо пайгирӣ карда мешаванд. Тавсифи муфассал ва таҳлили ин коркарди маълумот оварда шудааст. Маҳдудиятҳое, ки бо истифодаи усулҳои параметрии оморӣ ва ба эътидол овардани амплитуда алоқаманданд, махсусан таҳлил карда шудаанд ва ба амалияи муқаррарии лабораторӣ мувофиқанд. Вариантҳои гуногун барои ҷамъоварии маълумоте, ки аз якчанд генҳои истинод ба даст оварда шудаанд, муҳокима карда мешаванд.

Хулоса: Тартиби стандартии коркарди маълумоти ПТР тартиб дода ва тасдиқ карда шудааст. Он нишон медиҳад, ки тарҳи стандартии каҷӣ алтернативаи боэътимод ва содда ба ҳисобҳои самаранокии ПТР дар вақти воқеии ПТР боқӣ мемонад.


9 Намунаҳои воқеии тақсимоти муқаррарӣ

Тақсимоти муқаррарӣ дар фаҳмиши тақсимоти омилҳо дар аҳолӣ васеъ истифода мешавад. Азбаски тақсимоти муқаррарӣ ба бисёр падидаҳои табиӣ хеле наздик аст, он ба стандарти истинод барои бисёре аз мушкилоти эҳтимолият табдил ёфтааст.

Тақсимоти муқаррарӣ/Гаусс як графи зангӯлаест, ки ду истилоҳи асосӣ- инҳирофи миёна ва стандартиро дар бар мегирад. Ин як сохтори симметрии маҷмӯи додаҳост, ки дар он аксари арзишҳо дар миёна ҷамъ мешаванд ва боқимонда ба таври симметрӣ ба ҳардуи шадид кам мешаванд. Омилҳои сершумори генетикӣ ва экологӣ ба хислат таъсир мерасонанд.

Теоремаи лимити марказӣ

Тақсимоти муқаррарӣ назарияи ҳудуди марказиро риоя мекунад, ки мегӯяд омилҳои мухталифи мустақил ба як хислати мушаххас таъсир мерасонанд. Вақте ки ин ҳама омилҳои мустақил ба падида мусоидат мекунанд, маблағи муқарраршудаи онҳо тамоюли тақсимоти Гауссиро ба вуҷуд меорад.

Каҷи муқаррарӣ

Миёнаи таќсимот љойгиршавии маркази графикро муайян мекунад ва инњирофи стандартї баландї ва бари графикро муайян мекунад ва майдони умумии зери каљи муќаррарї ба 1 баробар аст.

Биёед мисолҳои ҳаёти ҳаррӯзаи Тақсимоти муқаррариро дарк кунем.

1. Баландӣ

Мисоли тақсимоти муқаррарӣ баландии аҳолӣ мебошад. Аксари одамоне, ки дар як аҳолии мушаххас баландии миёна доранд. Шумораи одамоне, ки аз баландии миёна баландтар ва кӯтоҳтаранд, тақрибан баробаранд ва шумораи хеле ками одамон ё хеле баланд ё хеле кӯтоҳанд. Бо вуҷуди ин, баландӣ як хусусият нест, якчанд омилҳои генетикӣ ва экологӣ ба баландӣ таъсир мерасонанд. Аз ин рӯ, он аз тақсими муқаррарӣ пайравӣ мекунад.

2. Зарф задан

Пардохти одилонаи зарра низ намунаи хуби тақсимоти муқаррарӣ мебошад. Дар таҷриба маълум шуд, ки вақте ки кристалл 100 маротиба ғелонда мешавад, имконияти ба даст овардани 15-18% ва агар мо кристаллро 1000 маротиба ғелонда гирем, имконияти ба даст овардани 𔃱 ’ аст, аз нав, ҳамон, ки ба ҳисоби миёна ба 16,7% (1/6). Агар мо дар як вақт ду кристаллро печонем, 36 комбинатсияи имконпазир мавҷуд аст. Эҳтимоли чархзании 𔃱 ’ (бо шаш таркиби имконпазир) боз ба ҳисоби миёна тақрибан 16,7%, яъне, (6/36). Теъдоди бештари кристаллҳо графики тақсимоти муқаррарӣ хоҳад буд.

3. Партофтани танга

Варақ задани танга яке аз усулҳои қадимтарини ҳалли баҳсҳост. Мо ҳама пеш аз бозӣ ё бозӣ танга задаем. Адолати даркшуда дар гардиши танга дар он аст, ки вай барои ба даст овардани натиҷа имкониятҳои баробар дорад. Имконияти гирифтани сар 1/2 аст ва барои думҳо низ ҳамин аст. Вақте ки мо ҳардуро илова мекунем, он ба як баробар мешавад. Агар мо тангаҳоро чанд маротиба партоем, маблағи эҳтимолияти гирифтани сарҳо ва думҳо ҳамеша боқӣ хоҳад монд 1.

4. IQ

Дар ин сенарияи афзояндаи рақобат, аксари волидайн, инчунин кӯдакон мехоҳанд, ки сатҳи иктишофии интеллектуалиро таҳлил кунанд. Хуб, IQ-и аҳолии мушаххас як каҷи тақсимоти муқаррарӣ мебошад, ки дар он IQ-и аксарияти аҳолии аҳолӣ дар диапазони муқаррарӣ ҷойгир аст, дар ҳоле ки IQ-и боқимондаи аҳолӣ дар диапазони инҳирофшуда ҷойгир аст.

5. Бозори саҳҳомии техникӣ

Аксарияти мо дар бораи боло рафтан ва паст шудани нархи саҳмияҳо дар бозори саҳмияҳо шунидаем.

волидони мо ё дар хабарҳо дар бораи афтодан ва боло рафтани нархи саҳмияҳо. Ин тағирот дар арзишҳои сабти курсҳои Forex, индексҳои нархҳо ва баргардонидани нархҳои саҳмияҳо аксар вақт каҷ шакли зангро ташкил медиҳанд. Барои баргардонидани саҳмияҳо, инҳирофи стандартиро одатан ноустуворӣ меноманд. Агар даромадҳо одатан тақсим карда шаванд, интизор меравад, ки зиёда аз 99 фоизи даромадҳо дар доираи инҳирофҳои арзиши миёна афтад. Чунин хусусиятҳои тақсимоти муқаррарии зангӯла ба таҳлилгарон ва сармоягузорон имкон медиҳанд, ки дар бораи фоидаи пешбинишаванда ва хатари саҳмияҳо хулосаҳои оморӣ бароранд.

6. Тақсимоти даромад дар иқтисодиёт

Даромади кишвар дар дасти сиёсат ва ҳукуматҳои устувор аст. Ин аз онҳо вобаста аст, ки чӣ гуна онҳо даромадро дар байни ҷомеаи сарватмандон ва камбизоатон тақсим мекунанд. Мо ҳама хуб медонем, ки аҳолии табақаи миёна аз аҳолии сарватманд ва камбизоат каме баландтар аст. Ҳамин тариқ, музди меҳнати аҳолии табақаи миёна дар хати тақсимоти муқаррарӣ маънои миёна дорад.

7. Андозаи пойафзол

Оё шумо фикр кардаед, ки агар пойафзоли шишагини аз ҷониби Золушка дар хонаи шоҳзода гузошташуда пойҳои зани дигар гузошта шавад, чӣ мешуд? Ӯ мебоист бо зани дигар издивоҷ мекард. Ин яке аз тахминҳои аҷибе буд, ки мо ҳама вақт дучор омадаем. Тибқи маълумоти ҷамъоваришуда дар ИМА, фурӯши пойафзоли занона аз рӯи андоза одатан тақсим карда мешавад, зеро ороиши ҷисмонии аксари занон тақрибан якхела аст.

8. Вазни таваллуд

Вазни муқаррарии таваллуди навзод аз 2,5 то 3,5 кг аст. Аксарияти навзодон вазни муқаррарии таваллуд доранд, дар ҳоле ки танҳо чанд фоизи навзодон вазни худро аз муқаррарӣ баландтар ё камтар доранд. Ҳамин тариқ, вазни таваллуд низ аз хатти тақсимоти муқаррарӣ пайравӣ мекунад.

9. Ҳисоботи миёнаи донишҷӯён ва#8217s

Имрӯзҳо мактабҳо намоишҳои худро дар шабакаҳои иҷтимоӣ ва телевизион таблиғ мекунанд. Онҳо натиҷаи миёнаи мактаби худро пешниҳод мекунанд ва волидонро ҷалб мекунанд, ки фарзанди худро дар он мактаб номнавис кунанд. Мақомоти мактаб нишондиҳандаҳои миёнаи таълимии ҳамаи хонандагонро муайян мекунанд ва дар аксари мавридҳо он аз рӯи каҷи тақсимоти муқаррарӣ пайравӣ мекунад. Шумораи донишҷӯёни зеҳнии миёна нисбат ба аксари донишҷӯёни дигар зиёдтар аст.


SYBR Green qPCR бо Протоколи Curve Standard

Ин протокол ба таҷрибаҳои истифодаи мошини StepOnePlus асос ёфтааст ва барои кӯмак ба корбарон дар тавлиди натиҷаҳои пурмазмуни qPCR пешбинӣ шудааст.

Тартиб

Қадами 1: Тоза кардани РНК

Вобаста аз намуд ва навъи намуна (ҳуҷайраҳои ширхӯрон/бофта/хуни, хамиртуруш, растанӣ) маҷмӯаи мувофиқи дар тиҷорат дастрасро истифода баред. Протоколро бодиққат риоя кунед, дар бораи олудашавӣ бо RNAses хеле эҳтиёткор бошед. Ба ҳеҷ чиз бо дастҳои луч даст нарасонед, дастпӯшакҳоро зуд-зуд иваз кунед, миз ва таҷҳизотро бо дорупошии аз ҷиҳати тиҷоратӣ дастраси RNAse тоза кунед (масалан, RNAse Away #038184, MBP). Ҳама фарсудашавии пластикӣ (маслиҳатҳои пипетка, найҳои полипропилении 1.5 мл ва ғайра) бояд "RNAse-Free" харида шаванд. Пеш аз истифода қубурҳои пластикиро автоклав накунед. Пеш аз оғози кор таъминоти хуби оби бе РНА бефоида аст.

Қадами 2: Миқдор ва сифати РНК -и тозашударо арзёбӣ кунед

Пас аз қадами ниҳоии тозакунии РНК бо истифода аз яке аз маҷмӯаҳои дар боло овардашуда, барои санҷиши сифат як қисмати хурди (5-10ул) РНК гиред. Ин аликвотро ба найчаи нави RNAse интиқол диҳед ва қисми боқимондаро дар -80C нигоҳ доред. Консентратсияи (ng/ul) РНК-и тозашудаи худро бо истифода аз мошини нанодроп ё муодили он муайян кунед. Ба шумо лозим меояд, ки мошинро бо ҳамон маҳлули холӣ (одатан оби бе РНА) холӣ кунед, ки шумо барои тоза кардани РНК дар марҳилаи ниҳоии тартиби тозакунии РНК истифода мекардед. Умуман, шумо бештар ба консентратсияи мошини нанодроп таваҷҷӯҳ хоҳед кард, аммо баъзе аз арзишҳои дигар метавонанд ба шумо дар бораи олудашавӣ бо сафеда ё ҳалкунандаҳое, ки метавонанд муфид бошанд, маълумот диҳад. Масалан, таносуби 260нм то 280нм ҳадди аққал 2,0 аз сафеда ва ҳалкунандаҳо нисбатан холӣ ҳисобида мешавад. Ба ҳамин монанд, таносуби 260 нм то 230 нм одатан аз 2,0 то 2,2 аст ва арзишҳои камтар метавонанд мавҷудияти карбогидратҳо ё ҳалкунандаҳоро нишон диҳанд.

Барои санҷиши сифат, шумо метавонед як гели РНК иҷро кунед ё Agilent Bioanalyzer ё мошини ба он баробарро истифода баред, то таносуби байни 28S ва 18S RNA -ро барои муайян кардани он ки деградатсия (ё ифлосшавии RNAse) вуҷуд дорад, ҳисоб кунед.

Ҳатто агар нармафзори ба даст овардани симои шумо ба ҳисоб кардани шиддатнокии гурӯҳ имкон намедиҳад, шумо метавонед бо истифода аз нармафзори ImageJ арзиши хеле хуби 28S: 18S тавлид кунед. Барои ин файли тасвири худро бо ImageJ кушоед, дар майдони холӣ/сиёҳ қуттии росткунҷаеро кашед ва Таҳлил-Ченакро клик кунед. Ин арзиши аслии шумост, ки шумо аз арзишҳои 28S ва 18S хориҷ мекунед. Сипас қуттиро ба банди 28S кашед, Таҳлил-Чанд кардан -ро клик кунед ва сипас барои банди 18S такрор кунед (Расми 2).

Шумо инчунин метавонед функсияи профили ImageJ Analyze-Plot -ро барои тавлиди гистограмма истифода баред, ки миқдори нисбии 28S ва 18S ва таназзулро нишон медиҳад (расми 3).

Агар шумо Agilent Bioanalyzer -ро истифода баред, шумо ҳам ба таносуби 28S: 18S ва ҳам рақами якпорчагии RNA (RIN) такя хоҳед кард. Онҳо ҳарду чораро дар ин ҳуҷҷат тавсиф мекунанд:

Agilent Bioanalyzer барои арзёбии сифати РНК равиши микрофлюидикиро истифода мебарад, аммо принсип ба он чизе, ки дар боло тавсиф шудааст, мувофиқ аст. Дар расми 4 баъзе натиҷаҳои намунавӣ нишон дода шудааст.

Барои бисёр барномаҳо беҳтар аст, ки танҳо RNA бо 28S:18S>1.5 ва RIN>8.0 истифода шавад.

Қадами 3: Синтези аввалаи занҷир (Истеҳсоли cDNA)

Аз РНК сар карда, ки шумо дар -80C нигоҳ доштаед (Қадами 2), протоколро аз маҷмӯаи синтези cDNA интихобкардаатон риоя кунед. Ин маҷмӯаҳо одатан дар ҳама ҷо аз 1нг то 5г РНК талаб мекунанд. Ба консентратсияи нанодропие, ки шумо дар Қадами 2 ба даст овардаед, муроҷиат кунед ва барои ҳамаи намунаҳои худ синтези якумро ба миқдори баробар (ng) РНК иҷро кунед. Ба шумо лозим меояд, ки ҳаҷмҳоро бо оби бидуни РНА баробар кунед.

Пас аз пур кардани протоколи марбут ба маҷмӯаи интихобкардаатон, тавсия дода мешавад, ки cDNA-ро бо маҷмӯаи аз ҷиҳати тиҷоратӣ дастрас тоза кунед (масалан. Тозакунии Qiaquick PCR ё MACHEREY-NAGEL NucleoSpin Gel ва PCR Clean-up) барои нест кардани олигомерҳои боқимонда ва транскриптазаи баръакс. Намунаҳои cDNA-и худро ҳадди аққал 1:5 дар оби озод RNAse маҳлул кунед, аз ҳар як аликвоти хурд (10ul-20ul) гиред ва намунаҳои cDNA-и боқимондаро дар -20C ё -80C нигоҳ доред, то он даме, ки ба шумо лозим аст.

Қадами 4: Принтерҳои qPCR -и худро санҷида истодаед

Новобаста аз он ки шумо праймерҳои аз ҷиҳати тиҷоратӣ дастрасро харидед ё худ бо истифода аз протоколи мо тарроҳии qPCR-и худро тарҳрезӣ кардед, санҷидани праймерҳо бо намунаҳои худ, SYBR Green Master Mix ва мошини qPCR-и шумо муҳим аст, то боварӣ ҳосил кунед, ки шумо як дастгоҳро афзоиш медиҳед. ампликон ва он пайдарпаии мувофиқ барои mRNA аст, ки шумо мехоҳед чен кунед.

*Эзоҳ ҳамеша тасдиқ кунед, ки омехтаи qPCR бо мошини qPCR, ки шумо истифода мебаред, мувофиқ аст

Тартиби тайёр кардани лавҳаи qPCR барои озмоиши ибтидоии праймерҳои qPCR

1) Аз 10-20ул аликвотҳои хурде, ки шумо дар охири Қадами 3 дар боло гирифтаед, сар карда, барои ин ҳадафи санҷиши qPCR Primer як ҳавзи ягонаи ҳамаи намунаҳои cDNA-и худро эҷод кунед. Аз ин ҳавз силсилаи ҳалкунандаро (1:5) созед, то бубинед, ки арзишҳои Ct-и шумо дар диапазони ченшаванда дар куҷо ҳастанд. Консентратсияи зерин бояд кофӣ бошад:

2) Маҳсулоти саҳҳомии ҷуфти ибтидоӣ (Forward and Reverse) бояд дар консентратсияи 10uM бошад.

3) Омехтаи устои SYBR Green Master Mix (2X) ва праймерҳо (0.4uM) омода кунед.

4) Ба таври мухтасар омехта кунед ва 10ul -ро ба ҳар як чоҳи табақи qPCR пипет кунед. Барои роҳ надодан ба ҳубобчаҳо, пеш аз ҷамъоварии омехта, плунжери pipetteman -ро ба ҳолати ихроҷ тела диҳед. Ҳоло нӯги пипетка зиёда аз 10ul -ро дар бар мегирад, аммо танҳо 10ul (ва ҳубобчаҳо) хориҷ мекунад, агар шумо дар нуқтаи муқовимати аввал ҳангоми партофтан мустақиман ба поёни чоҳ истед. Ба ҳамаи чоҳҳое, ки шумо истифода мебаред, 10ul илова кунед.

5) Барои ҳар як чоҳ нӯги алоҳидаи пипетка истифода кунед ва 10ул намунаро (дуруст бо об фасод кардашуда) мустақиман ба SYBR Green Master Mix дорои праймерҳо илова кунед. Як ё ду маротиба бо пипетинг боло ва поён омехта кунед. Барои ин қадам функсияи баровардани pipetteman -ро истифода набаред. Ҳамеша назорати манфӣ (омехтаи усто, праймерҳо ва об) -ро иҷро кунед, то шумо ҳузур, ҳарорати обшавӣ ва ғайра аз димерҳои праймерро санҷед.

6) Табақи худро бо он мӯҳр кунед мӯҳрҳои оптикии qPCR ва qPCR-ро дар мошини qPCR-и худ оғоз кунед. Агар нармафзори мошини шумо шуморо интихоб кунад, шумо мехоҳед нишон диҳед, ки шумо реагентҳои SYBR Green -ро истифода мебаред (на Taqman), ки шумо протоколи дарозро мехоҳед (на протоколи Fast), ки шумо усули delta-delta Ct -ро истифода мебаред ва ки шумо мехоҳед муайянкунии каҷии обшавиро дохил кунед. Агар шумо маҷбур бошед, ки генҳои истинод ва намунаи истинодро интихоб кунед, ягонеро интихоб кунед, зеро шумо танҳо праймерҳои qPCR -и худро месанҷед.

Пас аз qPCR Run, нармафзорро барои арзёбии натиҷаҳо истифода баред, аммо табақро дар 4С нигоҳ доред барои қадами 5.

Қубурҳои обшавӣ (мушаххасоти санҷиш)

Бо истифода аз нармафзори мошини qPCR, ба хатҳои обшавии ҳар як ҷуфти ибтидоӣ, ки санҷида мешаванд, бубинед, то бубинед, ки оё як қуллаи ҳарорат вуҷуд дорад. Дар расми 5 баъзе мисолҳои каҷҳои обшавии хуб ва бад нишон дода шудаанд.

Қитъаҳои тақвиятдиҳӣ (Ҷустуҷӯи диапазони хатӣ)

Минбаъд, бо истифода аз нармафзори мошини qPCR ба хатҳои пурқувваткунӣ барои ҳар як ҳалбаҳои 1:1, 1:5, 1:25, 1:125, ки дар боло дар якҷоягӣ бо назорати манфӣ омода карда шудаанд, нигаред. Ҳар як тағирёбии 1 воҳид дар Ct бояд фарқияти 2-маротиба дар маводи ибтидоиро ифода кунад, бинобар ин шумо бояд тағиротро ба арзишҳои баландтари Ct бо намунаҳои бештар ҳалшаванда бинед. Он чизе ки шумо бояд дар ин ҷо ба назар гиред, шакли каҷ аст. Намунаҳое, ки аз ҳад зиёд мутамарказ шудаанд, метавонанд каҷи тақвияти S-шакл дошта бошанд, дар ҳоле ки намунаҳои аз ҳад зиёд мулоимшуда наметавонанд умуман қубур дошта бошанд ё дорои арзиши Ct хеле баланд бошанд (расми 6).

Дар асоси натиҷаҳои ин таҳлил, шумо хоҳед донист, ки то кадом дараҷа (1: 1, 1: 5, 1:25 ё 1: 125) ба шумо лозим аст, ки cDNA-и худро пеш аз истифодаи ин ҷуфти ибтидоӣ барои дидани ин C- ҳангоми иҷрои Қадами 7 қубурҳои шаклдор.

Қадами 5: Сэнгер пайдарпайии маҳсулот ва тавлиди каҷи стандартӣ

Ҳоло аз плитаи пуркардашуда/мӯҳршудаи qPCR, ки шумо дар 4С нигоҳ доштаед, ДНК -ро бо маҷмӯаи аз ҷиҳати тиҷоратӣ дастрас тоза кунед (масалан. Тозакунии Qiaquick PCR аз Qiagen ё NucleoSpin Gel ва тозакунии PCR MACHEREY-NAGEL). Консентратсияи (ng/ul) ДНК-и тозашудаи худро бо истифода аз мошини нанодроп ё муодили он муайян кунед. Ба шумо лозим меояд, ки мошинро бо ҳамон маҳлуле (умуман оби бидуни ДНК) холӣ кунед, ки шумо барои тоза кардани ДНК дар марҳилаи ниҳоии тартиби тозакунии ДНК истифода мекардед.Ин консентратсияро сабт кунед, ки барои донистани фаровонии (нг) маҳсулоти ПТР, ки ҳангоми тавлиди каҷи стандартии худ истифода мебаред, хеле муҳим хоҳад буд. Аликвои хурди маҳсулоти тозашудаи ПТР ва ё праймерҳои пеш ё баръаксро ба ширкате ирсол кунед, ки пайдарпайии Sanger -ро ҳамчун хидмат иҷро карда, дастурҳои онҳоро оиди намуна ва консентратсияи праймер бодиққат иҷро кунад. Хароҷот одатан 5 EUR / пайдарпай мебошанд. Вақте ки онҳо ба шумо мефиристанд, натиҷаҳо тасдиқ мекунанд, ки маҳсулоти тавлидшуда воқеан генаи таваҷҷӯҳ аст. Шумо инчунин метавонед ба маҳсулоти тозашуда дар гели ДНК агарозии EtBr доғдор нигоҳ кунед, то боварӣ ҳосил кунед, ки дар вазни пешгӯишудаи молекулавӣ як банд мавҷуд аст, аммо пайдарпайӣ одатан кофӣ аст.

Барои тавлиди каҷи стандартӣ маҳсули пайдарпайи ПТР-ро аз боло 1:100 дар буфери 1X TE, рН 7,5 бо 10 г/мл ДНК-и Салмӯни Sperm Sheared Sperm. Масалан, ба буфери 990ul 10ul маҳсулоти покшудаи PCR илова кунед. Сипас дар ҳамон буфер силсилаи 1:10 иловакуниро иҷро кунед, то стандартҳо омода карда шаванд: 1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 ва 1:10 7. Тавсия дода мешавад, ки ҳадди аққал 500ул аз ҳар як стандарт омода карда шавад ва барои истифода дар оянда дар -20C ё -80C нигоҳ дошта шавад.

*Эзоҳ: Ҳангоми коркарди ин маҳсулоти пурқувватшудаи PCR эҳтимоли зиёд дорад, ки шумо пипетмани худро ифлос кунед. Маслиҳатҳои филтрро истифода баред ва фикр кунед, ки пипетмани ҳамсояи худро барои ин қадам қарз гиред.

Қадами 6: Арзёбии самаранокии qPCR -и шумо

Акнун, ки шумо каҷи стандартии худро тавлид кардед, шумо метавонед ин намунаҳоро бо истифода аз мошини qPCR-и худ санҷед. Бо истифода аз маҳз ҳамон тартиботе, ки дар қадами 4 аст, qPCR -ро дар стандартҳои худ иҷро кунед, ки ҳар яке дар се нусха аст. Мошини шумо метавонад ба шумо имкон диҳад, ки миқдори ҳақиқии (ng) ҳар як стандартро ворид кунед, ки шумо бояд дар асоси натиҷаҳои нанодроп дар қадами 5 донед.

Хатти стандартии хуб дар расми 7 нишон дода шудааст.

Вақте ки шумо стандартҳои худро баҳо медиҳед (1:10 3, 1:10 4, 1:10 5, 1:10 6 ва 1:10 7), шумо метавонед дарк кунед, ки баъзеҳо бо дигарон мувофиқ нестанд, зеро онҳо хеле суст ҳастанд ё аз ҳад зиёд мутамарказ шудааст. Шумо метавонед инҳоро аз таҳлил хориҷ кунед, ки беҳтарин 3 ё 4 стандарти таҳлили худро пайдо кунед. Умуман, стандартҳо аз падидаи каҷ-S-шакл, ки дар расми 6 тавсиф шудааст, азоб намекашанд ва диапазони хатӣ ҳатто метавонад ба арзишҳои Ct тақрибан 10 дароз карда шавад (Расми 7). Агар пас аз партофтани ин нишондиҳандаҳо хатти стандартии шумо ҳоло ҳам арзиши қобили қабулнашавандаи R 2 дошта бошад, ба шумо лозим меояд, ки каҷи стандартиро дубора созед ва пеш аз гузаштан ба иловагузории навбатӣ, бодиққат омехта кардани ҳар як размоишро эҳтиёт кунед. Самаранокии зиёда аз 100% метавонад мушкилоти ҷиддитарро нишон диҳад ва метавонад аз шумо ҷуфти нави праймерро талаб кунад.

Қадами 7: Гузаронидани qPCR дар намунаҳои шумо

Шумо ҳоло омодаед, ки qPCR-ро дар намунаҳои cDNA, ки шумо аз охири Қадами 3 яхкардашуда нигоҳ доштаед, иҷро кунед.

Тартиби омода кардани табақаи qPCR барои qPCR дар намунаҳои шумо

1) Оғоз аз 1: 5 cDNA -и иловакардашуда, ки шумо дар охири Қадами 3 дар боло ях карда будед, ҳама намунаҳоро мувофиқи натиҷаҳои дар Қадами 4 бадастоварда мувофиқ мувофиқ кунед (1: 1, 1: 5, 1:25 ё 1: 125). Шумо метавонед ҳамаи cDNA-и боқимондаи худро ба ин маҳлул пешакӣ ҳал кунед, аммо шумо бояд бидонед, ки баъзе ҷуфтҳои праймерҳо нисбат ба дигарон каҷҳои амплификация ба таври назаррас фарқ мекунанд. Агар шумо бо стенограммаи хеле фаровон кор карда истода бошед (масалан GAPDH), масалан, шумо метавонед cDNA-и худро аз ҳад зиёд ҳал кунед, то шумо транскриптҳои камтари фаровонро ошкор карда натавонед.

2) Маҳсулоти саҳҳомии ҷуфти ибтидоӣ (Forward and Reverse) бояд дар консентратсияи 10uM бошад.

3) Омехтаи устои SYBR Green Master Mix (2X) ва праймерҳо (0.4uM) омода кунед.

4) Ба таври мухтасар омехта кунед ва 10ul -ро ба ҳар як чоҳи табақи qPCR пипет кунед. Барои роҳ надодан ба ҳубобчаҳо, пеш аз ҷамъоварии омехта, плунжери pipetteman -ро ба ҳолати ихроҷ тела диҳед. Ҳоло нӯги пипетка зиёда аз 10ul -ро дар бар мегирад, аммо танҳо 10ul (ва ҳубобчаҳо) хориҷ мекунад, агар шумо дар нуқтаи муқовимати аввал ҳангоми партофтан мустақиман ба поёни чоҳ истед. Ба ҳамаи чоҳҳое, ки шумо истифода мебаред, 10ul илова кунед.

5) Барои ҳар як чоҳ нӯги алоҳидаи пипетка истифода кунед ва 10ул намунаро (дуруст бо об фасод кардашуда) мустақиман ба SYBR Green Master Mix дорои праймерҳо илова кунед. Як ё ду маротиба бо пипетинг боло ва поён омехта кунед. Барои ин қадам функсияи баровардани pipetteman -ро истифода набаред. Намунаҳо бояд ҳадди аққал се маротиба таҳлил карда шаванд. Ҳамеша назорати манфӣ (омехтаи усто, праймерҳо ва об) -ро иҷро кунед, то шумо ҳузур, ҳарорати обшавӣ ва ғайра аз димерҳои праймерро санҷед. Дар ҳамон табақ инчунин каҷи стандартии худро дар ду ё се маротиба бор кунед.

6) Табақи худро бо он мӯҳр кунед мӯҳрҳои оптикии qPCR ва qPCR-ро дар мошини qPCR-и худ оғоз кунед. Агар нармафзори мошини шумо шуморо интихоб кунад, шумо мехоҳед нишон диҳед, ки шумо реагентҳои SYBR Green (на Taqman) -ро истифода мебаред, протоколи дарозро мехоҳед (на протоколи Fast), усули каҷкунии стандартиро истифода мебаред ва шумо мехоҳед. мехоҳанд муайянкунии каҷии обшавиро дар бар гиранд.

Сипас мошини qPCR натиҷаҳои миқдории ПТР -ро ба вуҷуд меорад ва ба шумо миқдори ҳақиқии транскрипти шуморо дар ҳар як намуна мегӯяд. Шумо ба пайдарпайӣ, мушаххасият ва хаттии таҳлил итминон хоҳед дошт.

Эзоҳҳои ҳуқуқӣ:

StepOnePlus тамғаи молии ба қайд гирифташудаи Applied Biosystems мебошад. NanoDrop тамғаи молии ба қайд гирифташуда мебошад Ширкати NanoDrop Technologies, Inc. TaqMan RNase AWAY тамғаи молии ба қайд гирифташудаи Molecular Bio-Products, Inc мебошад. Qiaquick тамғаи молии ба қайд гирифташудаи QIAGEN Group мебошад. NucleoSpin® тамғаи молии ба қайд гирифташудаи MACHEREY-NAGEL мебошад. SYBR тамғаи молии ба қайд гирифташудаи Molecular Probes, Inc мебошад. Тамғаҳои молии ҷонибҳои дигар моликияти соҳибони мувофиқи онҳо мебошанд ва бояд ҳамчун чунин муносибат карда шаванд.

Ин протокол ба шумо писанд омад? Бо Шабакаи илмҳои ҳаёт сабти ном кунед.
Агар шумо аллакай шабакаи Life Science, LinkedIn ё ҳисоби Google дошта бошед:


Хусусиятҳои нармафзори CFX Maestro

Ҳама системаҳои муайянкунии PCR-и Bio-Rad дар вақти воқеӣ нармафзори пуриқтидори CFX Maestro-ро дар бар мегиранд. Бо як нармафзор барои ҳамаи чаҳор система, шумо метавонед ба осонӣ файлҳоро аз ягон асбоб кушоед ва хонед, бо муҳаққиқони дигар ҳамкорӣ кунед ва бидуни омӯхтани истифодаи нармафзори нав ба системаи дигар гузаред.

Ба монанди дигар нармафзори PCR дар вақти воқеӣ, нармафзори CFX Maestro якчанд модулҳои таҳлилро пешниҳод мекунад, аз ҷумла миқдор, каҷи обшавӣ, ифодаи ген, табъизи аллеликӣ ва таҳлили нуқтаи ниҳоӣ. Намунаи таҳлили таҷрибаи генофонди дар нармафзори CFX Maestro дар зер нишон дода шудааст.

Табақро насб кунед &mdash мавқеъи номаълум, назорати шаблон (NTC) нест ва намунаҳои каҷи стандартиро дар лавҳа нишон медиҳанд (Расми 1). Инро пеш аз давидан, дар давоми ва ё баъд аз давидан кардан мумкин аст.

Расми 1. Танзими табақҳо дар равзанаи Муҳаррири Плата.

Маълумотро таҳлил кунед & mdash файли додаҳо пас аз иҷро бо модули ифодаи ген ба таври худкор тавлид мешавад. Бо ҷадвали Custom View Data то 6 диаграмма ё ҷадвалҳои гуногунро ба осонӣ дидан кунед, ба монанди қитъаи амплификация, каҷи стандартӣ, диаграммаи ифодаи генҳо, тарҳбандии табақҳо ё қуллаи обшавии он (Расми 2). Самаранокӣ ва R 2-и каҷи стандартиро санҷед. Самаранокӣ бояд дар ҳудуди 90 & ndash110% ва R 2 бояд & gt0.990 бошад. Агар ин арзишҳо берун аз ҳудуд бошанд, ба шумо лозим меояд, ки мушкили таҷрибаи худро бартараф кунед.

Расми 2. Равзанаи Намоиши маълумоти фармоишӣ.

Натиҷаҳоро барои нашр содир кунед &mdash Бо пахши тугмаи рости равзана ва интихоби Захира кардани тасвир ҳамчун (расми 3) ё содирот ба Excel (расми 4) ҳама гуна диаграммаҳо ё ҷадвалҳоро зуд содир кунед. Шумо инчунин метавонед барои воридоти зуд ба нармафзори qbase+ гузоришҳо ё файлҳои забони қайдкунии маълумоти PCR (RDML) дар вақти воқеӣ эҷод кунед.

Расми 3. Дар равзанаи таҳлили маълумот Захира кардани тасвирро ҳамчун интихоб кунед.

Расми 4. Дар равзанаи таҳлили маълумот Содирот ба Excel -ро интихоб кунед.


Cy0 - Усули нави миқдории qPCR

Замина: Ба наздикӣ PCR дар вақти воқеӣ ба усули интихоб барои миқдори мутлақ ва нисбии кислотаи нуклеинӣ табдил ёфтааст. Усули миқдории стандартии тилло дар ПРР дар вақти воқеӣ тахмин мекунад, ки намунаҳои муқоисашуда дорои самаранокии ПТР мебошанд. Бо вуҷуди ин, омилҳои зиёде, ки дар намунаҳои биологӣ мавҷуданд, ба таҳлили миқдории миқдории ПКР таъсир мерасонанд. Дар ин кор мо стратегияи навро барои ошкор кардани намунаҳои беруна пешниҳод менамоем, ки SOD ном дорад.
Натиҷаҳо: Функсияи Ричардс дар хондани флуоресценсия барои параметр кардани кунҷҳои тақвиятдиҳанда насб карда шудааст. Байни параметрҳои ҳисобкардашудаи тақвиятдиҳӣ (плато, нишебӣ ва координатаи нуқтаи гардиш) ва Сабти ДНК-и воридшаванда ягон робитаи назаррас вуҷуд надошт, ки нишон медиҳад, ки ин равишро барои ба даст овардани "изи ангушт" барои ҳар як каҷи тақвият истифода бурдан мумкин аст. Барои муайян кардани ченакҳои берунӣ, параметрҳои ҳисобшудаи ҳар як намунаи номаълум бо намунаҳои стандартӣ муқоиса карда шуданд. Ҳангоме ки баҳои назарраси молекулаҳои ибтидоии ДНК ёфт шуд, бинобар мавҷудияти ингибиторҳои биологӣ ба монанди кислотаи таннӣ, IgG ё кверцитин, SOD ин профилҳои тақвиятдиҳандаро ба таври муассир қайд кард. Минбаъд SOD бо KOD муқоиса карда шуд, ки равиши кунунӣ ба арзёбии самаранокии ПТР асос ёфтааст. Маълумоти бадастомада нишон дод, ки SOD нисбат ба KOD ҳассостар аст, дар ҳоле ки SOD ва KOD баробар мушаххас буданд.

Хулоса: Натиҷаҳои мо нишон доданд, бори аввал, ки ошкоркунии берунӣ метавонад ба шакли тақвият ба ҷои самаранокии ПТР асос ёбад. SOD беҳбуди таҳлили PCR-ро дар вақти воқеӣ нишон медиҳад, зеро он фарқияти маълумотро коҳиш медиҳад ва ба ин васила эътимоднокии миқдорро зиёд мекунад.

-->

Салом, шумо ҳастед 102954 меҳмон, ташаккур.

Аз .

Кликҳои охирин.

Дар чанд соли охир, реаксияи занҷири миқдории полимеразӣ дар вақти воқеӣ (ПТР дар вақти воқеӣ) бо сабаби суръатнокӣ, дақиқӣ ва ҳассосияти он барои интихоби миқдори мутлақ ё нисбии ифодаи генҳо табдил ёфтааст [1-3].
Ғайр аз он, пешрафтҳои охирин дар пайдарпайии геноми инсон, профили экспрессияи mRNA ва miRNA намудҳои сершумори саратон, муайянкунии полиморфизми марбут ба беморӣ ва дастрасии васеъ кардани иттилооти пайдарпайии геномӣ барои патогенҳои инсон боиси афзоиши назаррас дар ташхиси молекулавӣ шуданд [4-6] ].
Усули миқдории стандартии тиллоӣ (усули Ct) дар вақти воқеии ПТР тахмин мекунад, ки намунаҳои муқоисашуда дорои самаранокии ПТР мебошанд. Бо вуҷуди ин, муайянкунии миқдор тавассути PCR дар вақти воқеӣ ба фарқиятҳои ночиз дар самаранокии PCR байни намунаҳо ҳассос аст. Дар ҳақиқат, фарқияти хурди 5% дар самаранокии PCR боиси се маротиба фарқияти миқдори ДНК пас аз 25 давраи амплификацияи экспоненсиалӣ мегардад. Бисёр омилҳое, ки дар намунаҳо мавҷуданд, инчунин ифлоскунандаҳои якҷоя истихроҷшуда метавонанд ПЗР-ро боздоранд ва таҳкими шаблон ва таҳлилро халалдор созанд [7-10]. Ҳангоми кор бо намунаҳои биологӣ ин мушкилии асосӣ аст. Ингибитсияи шадид ба натиҷаҳои манфии манфӣ оварда мерасонад, дар ҳоле ки ингибитсияи ночиз ва миёна метавонад боиси нодида гирифтани консентратсияи ДНК-и намунаи зарардида гардад [11]. Ғайр аз он, самаранокии амплификация метавонад ҳамчун функсияи тарҳрезии таҳлили ғайримуқаррарӣ, ноустувории фермент ё мавҷудияти ингибиторҳо тағйир ёбад [12]. Гарчанде ки усулҳои гуногун барои чен кардани қолаби ДНК таҳия карда шудаанд [11, 13-17], хеле ками онҳо имкон медиҳанд, ки ҳамзамон миқдор ва сифати шаблон бе илова намудани назорати дохилии мусбат, ки бо ҳадафи таваҷҷӯҳ тавсеа меёбад, баҳо диҳанд. Аз ин рӯ, Бар ва ҳамкорон усулеро пешниҳод карданд (бо номи KOD) дар асоси ҳисобкунии самаранокии амплификация барои ошкор кардани барвақти шароити таҳлили ғайримуқаррарӣ [18, 19]. Ин равиш бениҳоят содда ва муассир аст, аммо он ба ҳисобкунии самаранокии тақвияти ПТР асос ёфтааст, ки то ҳол ягон усуле, ки ҷомеаи илмӣ пурра пазируфтааст, вуҷуд надорад. Шумораи зиёди тадқиқотҳо кӯшиш карданд, ки самаранокии тақвиятро ҳисоб кунанд, бо назардошти он, ки ПТР табиатан экспоненсиалӣ аст. Дар асоси фарзияи минтақаи лог-хаттӣ, самаранокии амплификацияи доимӣ аз нишебии регрессияи хатӣ дар он равзана ҳисоб карда мешавад [20, 23]. Равиши алтернативӣ ба мушоҳидае асос ёфтааст, ки траекторияи ПТР метавонад бо функсияи сигмоид ба таври муассир моделсозӣ карда шавад [14, 24], ки имкон медиҳад, ки самаранокии ПЗР бо истифода аз мувофиқати регрессионии ғайрихаттӣ ҳисоб карда шавад [15, 25, 26]. Ба наздикӣ, равиши соддакардашуда бо номи "регрессияи хаттии самаранокӣ" ба мо имкон дод, ки самаранокии амплификатсияро тавассути истифодаи таҳлили хаттии регрессивӣ ба хонишҳои флуоресценсия дар минтақаи марказии профили тақвиятдиҳӣ баҳо диҳем [27]. Қобили зикр аст, ки баҳодиҳии самаранокии PCR вобаста ба равиши қабулшуда ба таври васеъ фарқ мекунад [28].
Ба наздикӣ, Тичопад ва дигарон. [29] озмоиши нави назорати сифатро барои ПТР -и миқдорӣ ҷорӣ кард, ки дар ин тартиб максимумҳои ҳосилаҳои аввал ва максимумҳои ҳосилаҳои дуюм бо истифода аз мутобиқати логистикӣ дар траекторияи ПТР ҳисоб карда шуданд. Ин равиш ба онҳо имкон дод, ки бо истифода аз ду параметр нимаи аввали каҷро назорат кунанд. Ҳадафи омӯзиши мо таҳияи як асбоби санҷиши сифат аст, ки ба арзёбии самаранокии тақвият асос намеёбад, то намунаҳое, ки кинетикаи амплификатсионии шабеҳи намунаҳои стандартиро нишон намедиҳанд, асос ёбад. Дар ин кор, барои параметри профилҳои амплификатсияи ПТР аз маҷмӯи калони намунавӣ мувофиқати ғайримутамаркази муодилаи Ричардс истифода шудааст. Ҳисобкунии минбаъдаи дисперсияҳои параметрҳои ҳисобшуда ва таҳияи ченаки оморӣ дар асоси масофаи Маҳаланобис ба мо имкон дод, ки усули SOD (Скинетикӣ дар асоси hape Омуфид Дтавсиф). Тахлили SOD-и пурзуркунихои монеъшуда ва мукоисаи ин усул бо КОД муфассал тахкик карда шуд.

ПКР дар вақти воқеӣ

Стандарти ДНК аз плазмиди pGEM-T (Promega) иборат буд, ки дорои порчаи 104 bp аз гени митохондриалӣ NADH дегидрогеназа 1 (MT-ND1) ҳамчун замима мебошад. Ин порчаи ДНК аз ҷониби ҷуфти праймерҳои ND1/ND2 (ба пеш ND1: 5'-ACGCCATAAACTCTTCACCAAAG- 3 'ва баръакси ND2: 5'-ТАГТАГАГАГГГТГГТАГАГТАКТА-3') истеҳсол карда шудааст. Ин плазмид бо истифода аз Plasmid Midi Kit (Qiagen) тибқи дастури истеҳсолкунанда тоза карда шуд. Консентратсияи ниҳоии плазмиди стандартӣ ба таври спектрофотометрӣ бо ҳисоби миёна се такрори А ҳисоб карда шуд.260 муайянкунии абсорбент.
Таҷдиди вақти воқеии PCR бо истифода аз он гузаронида шуд LightCycler & # 174 480 SYBR сабз ман устоди (Roche) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда, бо 500 примерҳои нМ ва миқдори тағирёбандаи стандарти ДНК дар ҳаҷми реаксияи ниҳоии 20 µл. Thermocycling бо истифода аз a гузаронида шуд LightCycler ® 480 (Roche) бо инкубатсияи 10 дақиқа дар 95°176C оғоз шуда, пас аз 40 давра (95°176C барои 5 сония 60°176C барои 5 сония 72°176C барои 20 сония) бо як хониши флюоресцентӣ дар охири ҳар як давра гирифта мешавад. .
Ҳар як комбинатсияи реаксия, аз ҷумла фоизи омехтаи ибтидоии ДНК ва амплификация, дар се нусха гузаронида шуд ва дар чор даври ҷудогона такрор карда шуд. Ҳама давишҳо бо таҳлили каҷи обшавӣ анҷом дода шуданд, то мушаххасоти тақвият ва набудани димерҳои праймерро тасдиқ кунанд. Ct (усули нуқтаи мувофиқ) ва Cp (усули ҳосилаҳои дуюм) арзишҳо аз ҷониби муайян карда шуданд LightCycler ® 480 версияи нармафзори 1.2 ва барои таҳлил пас аз тарҳи пасзамина ба варақаи иттилоотии MS Excel (Microsoft) содир карда мешавад (ҳамчун файли иловагии 1 дастрас аст). Барои Ct (усули нуқтаи мувофиқ) баҳодиҳии ҳадди флуоресцентӣ, ки ба таври дастӣ ба 0,4 муқаррар карда шудааст, барои ҳама давидан истифода шудааст.

Арзёбии самаранокии PCR

Маълумоти хоми PCR барои ҳисоб кардани самаранокии амплификация истифода мешуд. Самаранокии ПТР барои ҳар як намунаи инфиродӣ аз нишебии хати регрессия дар равзанаи хатӣ гирифта шудааст [20]. Ислоҳи ибтидоӣ ва равзанаи муайянкунии хатӣ бо истифода аз нашри охирини LinRegPCR [23] гузаронида шуд. Самаранокии PCR аз чаҳор маҷмӯи намунаҳо ҳисоб карда шуд: каҷҳои стандартии амплификация, каҷҳои стандартии тақвияти иловашуда аз хондани кислотаи танникӣ, каҷҳои стандартии амплификация аз хондани IgG ва каҷҳои стандартии амплификация аз хондани кверситин. Равзанаи хаттие, ки аз ҳама маҷмӯи меандатаҳо ҳисоб карда мешавад, ҳадди флуоресценсияи 0.4 -ро, ки барои таҳлили миқдорӣ интихоб шудааст, фаро гирифтааст.

Модели математикии KOD

Модели математикии KOD, ки ба самаранокӣ асос ёфтааст, аз ҷониби Бар et al. [18]. Хулоса, ин дар муқоиса бо самаранокии ПТР намуна анҷом дода шуд (хэфф) бо самаранокии намунаҳои каҷи стандартӣ. Намунаи санҷиш ҳамчун аутриент тасниф карда мешавад, агар |з| & gt 1.96 бо < z = frac<>> - mu _ < таъкид>> < sigma _ < таъкид> > > , дар куҷо &микроэфф самаранокии миёна аст ва σэфф ин инҳирофи стандартии самаранокии намунаҳои каҷи стандартӣ мебошад. Интихобан, бояд ба назар гирифт, ки омор < чап ( frac ight )^2 > is distributed as a c ² with one degree of freedom if c ² > 3.84, we can reject the null hypothesis at a = 0.05. c IE7 Mozilla c ²Chrome c -->

Модели математикии SOD

Муайянкунии кинетикии берунии кинетикӣ (SOD) ба шаклҳои кунҷҳои тақвият асос ёфтааст. Барои мувофиқ кардани маълумоти хоми флуоресценсионӣ, мувофиқкунии регрессияи хаттии функсияи 5-параметри Ричардс, ки тавсеаи хати афзоиши логистика буд, истифода шуд [11, 25]:

баробар. 1
дар куҷо х рақами давра аст, Фх флуоресцентсияи реаксия дар давра мебошад х, Фмакс реаксияи максималии флуоресценция мебошад, Фб реаксияи заминавии флуоресценция ва мебошад б, в ва г коэффисиентҳои тахминиро ифода мекунад. Регрессияҳои ғайримутамарказ барои функсияҳои 5-параметрии Ричардс муайянкунии сметаҳои квадратҳои вазннашудаи ҳадди ақалли параметрҳоро бо истифода аз Левенберг-Маркварт усул
Параметрҳои шакли истифодашуда арзиши платои каҷи пурқувват буданд (Фмакс), нишебии хати рости тангенс дар нуқтаи гардиш (м) ва y-координатаи нуқтаи гардиш (Yе)(Файли иловагии 2).
Координатаи нуқтаи гардиш (Yе) ба таври зерин ҳисоб карда шуд:
баробар. 2018-04-02 Хохарчон 121 2
ва нишебии хати рости тангенс (м) чунин ҳисоб карда шуд:
баробар. 3
Тақсимоти муқаррарӣ Фмакс, Яе ва м параметрҳое, ки аз намунаҳои стандартӣ гирифта шудаанд, бо истифода аз санҷида шуданд Колмогоров-Смирнов санҷиши муқаррарӣ аҳамияти таносуби байни ин параметрҳо ва консентратсияи ДНК-и воридшаванда, ки ҳамчун ифода карда мешавад Сабт (ДНК) бо а озмуда шуд т санҷиш ба таври зерин:
баробар. 4
дар куҷо р коэффисиенти Пирсон аст ва н андозаи намуна (н = 72). Мӯътадилии бисёрҷанбаи маҷмӯи истинодҳои қабулшуда мувофиқи Rencher AC [30] арзёбӣ карда шуд (Файли иловагӣ 3). Илова бар ин, асимметрия (Асим) каҷҳои тақвиятдиҳанда ба таври зерин арзёбӣ карда шуданд:
баробар. 5
иваз кардан Yе ва Фмакс, баробар. 5 метавонад содда карда шавад:
баробар. 6
Мувофиқи ин муодила хати каҷ симметрӣ аст (яъне Асим = 0), вақте ки d = 1 аст, ё 2*Yf = Fmax. Баръакс, вақте ки d & gt 1 мо 2*Yf & lt Fmax (каҷ асимметрӣ аст) дорем, аз ин рӯ Asym & gt 0.

Пас аз таҳияи усул барои арзёбии се параметрҳои гуногуни шакл (Фмакс, yе ва м), қадами навбатӣ муқаррар кардани меъёр барои муайян кардани намунаҳои санҷише буд, ки аз арзишҳои пешбинишуда дур мешуданд. Ин бо истифода аз вектори намунавӣ анҷом дода шуд, ки онро барои ҳар як амплификацияи таҷрибавӣ ҳисоб кардан мумкин аст, агар y ба тақсимоти муқаррарии бисёрсоҳавӣ тааллуқ дорад, бо вектори миёна ва Σ матритсаи мувофиқи дисперсия-коварианти,y - Σ)' Σ -1 (y - Σ) арзиш (масофаи Маҳаланобис) дорои тақсимоти асимптотикии c ², бо 3 дараҷаи озодӣ. Масофаи Маҳаланобис ба таносуби байни тағирёбандаҳо асос ёфтааст, ки тавассути онҳо намунаҳои гуногунро муайян ва таҳлил кардан мумкин аст. Ин як роҳи муфиди муайян кардани шабоҳати намунаи бисёрҷонибаи номаълум ба намунаи маълум аст. Он таносуби маҷмӯи маълумотро ба назар мегирад ва аз миқёси андозагирӣ вобаста нест. Матритсаи вектори миёна ва дисперсия-ковариансия аз параметрҳои шакли намунаҳои каҷи стандартӣ ҳисоб карда шудааст. Пас, агар c ² & gt 7.81, мо метавонем гипотезаи нулро рад кунем (бо a = 0,05) ва муқаррар кунем, ки шакли каҷи тақвиятдиҳӣ бо назардошти ҳар се параметр [30] аз шакли намунаҳои каҷи стандартӣ фарқ мекунад [30]. Ҳама тахияҳо ва графикҳо бо истифода аз Excel (Microsoft), Statistica 6.0 (Statsoft) ва бастаи омори илмҳои иҷтимоӣ (SPSS 13.0) ба даст оварда шудаанд.

Таҳлили каҷи стандартии SOD

Модели SOD ба фарзия такя мекунад, ки барои ба даст овардани миқёси боэътимод, каҷҳои тақвияти намунаҳои номаълум набояд аз қубурҳои стандартӣ ба куллӣ фарқ кунанд. Мо чунин ақидаро ҷорӣ кардем, ки кинетикии пурқувватро тавассути шакли хатти пурқувват назорат кардан мумкин аст. Шакли каҷҳои амплификация бо истифода аз мувофиқати регрессионии ғайрихаттии функсияи Ричардс дар хонишҳои флуоресцентӣ параметргузорӣ карда шуд [11].
Ин тартиби математикӣ ба мо имкон дод, ки панҷ параметрҳои хоси муодилаи Ричардсро ба даст орем. Ин арзишҳо баъдан барои ҳисоб кардани нишебии тангенс дар нуқтаи гардиш истифода шуданд (м), координати y-и нуқтаи гардиш (yе) ва арзиши максималии флуоресценция (Фмакс) аз хондан. Ниҳоят, ин се параметр ба мо имкон доданд, ки барои ҳар як каҷи тақвият додани "изи ангушт" эҷод кунем.
Дар асоси ин тахмин, параметрҳо м, yе ва Фмакс Амплификацияҳое, ки барои сохтани хатти стандартӣ истифода мешаванд, набояд аз ҳамдигар ба таври назаррас фарқ кунанд ва набояд бо ДНК-и воридотӣ алоқаманд бошанд. Барои тасдиқи ин фарзия, каҷи стандартӣ дар доираи васеи ДНК-и вуруд тавлид шуд (3.14x10 7 -3.14x10 2 Расми 1 Файлҳои иловагӣ 1).
Ҷадвали 1 санҷиши миёна, SD ва Колмогоров- Смирновро аз 72 давидан нишон медиҳад. Ин натичахо нишон доданд, ки м, yе ва Фмакс одатан тақсим карда мешуданд, гарчанде ки онҳо парокандагии дигарро нишон медоданд. Баъдан, муносибати байни м, yе ва Фмакс ва Журнали қолаби ибтидоии ДНК омӯхта шуд. Тавре ки дар расми 2 нишон дода шудааст, байни Сабти воридшавии ДНК ва ин параметрҳо ягон робитаи назаррасе вуҷуд надошт (Фмакс: R 2 = 0.017 саҳ = 0.28 yе : R 2 = 0.033 саҳ = 0.12 м: R 2 = 0.030 саҳ = 0.14). Дар асл, коэффициентҳои муайянкунанда (R 2) танҳо як қисми хеле ками фарқиятҳои параметрҳо камтар аз 3,3% миқдорӣ муайян карда шудааст.
Бо мақсади объективона муайян кардани профили тақвиятдиҳанда ҳамчун тағирёбанда мо тағирёбандаи Log (Ноб/Н.экс), ки хатогиҳои таҳлили миқдорро бо усули Ct арзёбӣ мекунад. Ин тағирёбанда ба боқимондаҳое, ки ҳамчун фарқи байни молекулаҳои ҳисобшуда ҳисоб карда мешаванд, бо истифода аз усули Ct (Логи шумораи молекулаҳои мушоҳидашаванда, ки LogNob номида мешавад) ва молекулаҳои воридотии ДНК (Логи молекулаҳои пешбинишуда, ки дар асл LogNexp номида мешаванд, такя мекунад. LogNexp = Журнал (Ноб/Н.exp)). Таносуби гузориш (Ноб/Н.exp) тақсимоти муқаррариро нишон дод, ки фарзияи гомоскедастикиро қонеъ мекунад (Файли иловагӣ 4). Ҳамин тавр, барои тағирёбандаи Log (95) фосилаи эътимод (CI) -ро муайян кардан мумкин аст (Ноб/Н.экс). Ин пасмондаҳо новобаста аз қолаби ибтидоии ДНК тақсимоти муқаррариро нишон доданд, ки миёнааш ба сифр баробар аст ва доимии инҳирофи стандартӣ (σ = 0.041). Дар пойгоҳи додаи мо, аз 72 давидан, ки барои сохтани хатти стандартӣ истифода мешуданд, 6 давр таносуби Log(-ро) нишон дод.Ноб/Н.exp) аз CI (Файли иловагӣ 5). Баъдан, самаранокии PCR (Eff) инчунин барои ҳар як каҷи пурқувватсозӣ ҳисоб карда шуд, нармафзори Lin-RegPCR [20, 23] барои мувофиқ кардани нуқтаҳои додаҳо дар диапазони оптималии марҳилаи экспоненсиалии PCR барои ба даст овардани арзёбии автоматии Эфф (Ҷадвали 1) ).
Барои муайян кардани он ки то чӣ андоза намунаҳои бартариятро тавассути KOD ва SOD муайян кардан мумкин аст, мо ин таҳлилҳои омориро ба хати каҷи стандартӣ татбиқ кардем, алахусус мо фаҳмидем, ки KOD 2 давишро аз арзиши ҳадди c ² аз 3,84 муайян кардааст, дар ҳоле ки SOD 3 давишро ошкор кардааст. аз CI (Файли иловагии 5). Ин фарқиятҳо эҳтимолан аз сабаби таъриф ва хосиятҳои дохилии 95% CI мусбат бардурӯғанд.

Љадвали 1: Як намунаи Колмогоров-Смирнов Санљиши каљи калибризатсия.

Воситаҳо (инҳирофи стандартӣ) ва арзиши санҷиши Колмогоров-Смирнов (K-S) -и параметрҳои зерин: самаранокии LineReg (Эфф), арзиши ординатсионии нуқтаи гардиш (yе), нишебии хати рости тангенс дар нуқтаи гардиш (м) ва арзиши плато (Фмакс).

Таъсири ингибиторҳо ба тақвияти вақти воқеӣ

Кислотаи танин оксид шуда, хинонҳоро ба вуҷуд меорад, ки бо ковалентӣ пайваст мешаванд Так Полимеразаи ДНК фаъолияти онро бозмедорад [31].
Қитъаҳои тақвиятдиҳии воқеӣ аз 3,5 х 10 4 молекулаҳои ДНК дар ҳузури зиёдшавии консентратсияҳо (0-0.1 мг дар як мл) кислотаҳои танникӣ ба даст оварда шуданд. Ҳама арзишҳои миқдорӣ бо истифода аз он гирифта шуданд Ct усул Хатҳои пурқуввати натиҷавӣ ва миқдорҳои мувофиқ таъсири монеъшавиро дар таҳлили вақти воқеӣ нишон медиҳанд (расми 3A ва 3B). Бо зиёд шудани консентратсияи кислотаи танинӣ, Ct арзишҳо мунтазам боло мерафтанд ва боиси нодида гирифтани молекулаҳои ибтидоӣ мешуданд. Ин хатои миқдорӣ ҳангоми қайд карда шуд Log(Ноб/Н.exp) CI -и мувофиқро тарк кард (Расми 3B). Амплификатсияи фурўшуда тавассути ҳисобҳои самаранокӣ бо истифода аз тартиби LinRegPCR нишон дода шуд (Файли иловагии 5). Хатогиҳои мушоҳидашуда натиҷаи коҳиши тадриҷии плато, дарозии марҳилаи хатӣ ва нишебии кунҷҳои манъшуда буданд, ки ин таъсирҳо боиси афзоиш ёфтанд Ct арзишҳо (расми 3А) [19, 32].

Таҳлилҳои SOD ва KOD барои муайян кардани намунаҳо бо кинетикаи ғайримуқаррарии ПТР аз сабаби мавҷудияти ингибиторҳо, ки метавонанд ба миқдорҳои нодуруст оварда расонанд, истифода шуданд. Фмакс, м, ва yе арзишҳое, ки аз ҳар як хатти пурқувваткунӣ ҳисоб карда шудаанд, ки дар ҳузури афзоиши консентратсияи кислотаи танникӣ, IgG ё кверситин ба даст оварда шудаанд, барои ҳисоб кардани 2 даври муайяншуда дар тӯли c ² истифода шуданд.СОД арзиш. Аз ин рӯ, агар c ²SOD арзиш аз каҷи тақвиятдиҳанда аз арзиши ҳадди ҳадди 7.81 баландтар буд, миқдор ҳамчун аутриент муайян карда шуд. Самаранокии ПТР низ ҳисоб карда шуд ва c ²KOD арзишҳое, ки аз ҳамон тақвиятҳо муайян карда мешаванд. Каҷҳои миқдорӣ бо c ²КОД арзишҳои беш аз 3.84 рад карда шуданд.
Аз ин рӯ, нишондиҳандаҳои SOD ва KOD аз рӯи қобилияти онҳо барои муайян кардани амплификатсия ҳамчун нишондиҳандаи берунӣ ҳангоми Log(Ноб/Н.экс) таносуб дар доираи 95% CI нест.
Натиҷаҳои таҳлили SOD ва KOD дар ҳузури зиёдшавии консентратсияи кислотаи танин дар расми 6А ва 6В нишон дода шудаанд. Вақте ки консентратсияи кислотаи таннӣ аз 0,1 - 0,0125 мг/мл илова карда шуданд, ҳамаи кунҷҳои бадастомада хатогиҳои миқдории зиёд доштанд (расми 6А ва 6В аломатҳои пурраи намунаҳоеро нишон медиҳанд, ки таносуби Лог (Ноб/Н.экс) аз ҳадди поёнии 95% CI).

Ҷадвали 2: Ҳассосият ва хосияти таҳлили KOD ва SOD.

Мавзӯи таваҷҷуҳи зиёд таҳияи абзорҳои дастӣ барои муайян кардани профилҳои амплификацияи аберрантӣ дар таҳлили PCR дар вақти воқеӣ мебошад. ПТР дар вақти воқеӣ босуръат ба усули маъмултарин дар миқёси кислотаи нуклеин табдил ёфтааст. Гарчанде ки таҳлили ПРР дар вақти воқеӣ дар бисёр соҳаҳои биологияи молекулавӣ таваҷҷӯҳи зиёд пайдо кардааст, он ҳанӯз ҳам аз мушкилоти назарраси техникӣ нигарон аст [34]. Аз ин рӯ, таҳқиқоти мазкур ба таҳқиқи равиши нави муайянкунии берунӣ, ки на ба арзёбии самаранокии PCR, балки ба шакли профили амплификация асос ёфтааст, тамаркуз кардааст.
Табиати тақвияти ПТР онро ба фарқиятҳои хурди самаранокии намунаҳои муқоисашуда осебпазир месозад [20]. Дар асл, "стандарти тиллоӣ" -и кунунӣ дар таҳлили ПРР дар вақти воқеӣ, усули давраи ҳадди ақал (ном Ct метод), самаранокии шабеҳи PCR -ро дар байни намунаҳои муқоисашаванда талаб мекунад.
Аммо, фарқият дар самаранокии ПТР аз сарчашмаҳои гуногуни маводи ибтидоӣ, масалан, намудҳои гуногуни бофтаҳо ба вуҷуд меояд [9]. Чунин фарқиятҳо метавонанд ҳангоми ингибиторҳои Так Полимеразаи ДНК дар намунаҳои cDNA [35] ё дар ҳузури SYBR сабзи пастсифат ва/ё dNTP [36, 37] мавҷуд аст. Ғайр аз он, басомади ингибиратсияи ПТР [38] ва эффектҳои гуногуни ингибиторӣ ҳатто дар байни такрориҳо [39] зарурати баҳодиҳии сифати кинетикии ҳар як намунаро нишон медиҳанд. Аз ин рӯ, Бар ва дигарон. [18] усули омориро пешниҳод кард, ки KOD номида мешавад, то намунаҳои дорои самаранокии ба ҳам монанд надоранд.
KOD нишондиҳандаҳои беруниро дар асоси фарзияи асосӣ ҷустуҷӯ мекунад, ки барои ба даст овардани миқдори боэътимоди ченкунӣ, ченҳои PCR бояд самаранокӣ нишон диҳанд, ки аз ҳамдигар ба таври назаррас фарқ намекунанд. Ин ҳолат бо муқоисаи нишебиҳои регрессияи рост, ки дар равзанаи хатӣ пас аз трансформатсияи лог-трансформатсияи ҳар як флуорессенсияи хондашуда ҳисоб карда шудааст, тасдиқ карда мешавад. Ба ибораи дигар, агар мо ба маълумоти хом баргардем, профили кунҷҳои экспоненсиалӣ дар равзанаи хатӣ набояд дар байни давраҳои муқоисашуда ба куллӣ фарқ кунад. Ҳангоми таҳияи усули SOD мо ин консепсияро ба тамоми каҷ дароз кардем ва ҳамаи давишҳое, ки ба таҳлил дохил карда шудаанд, бояд профилҳои муқоисашавандаи тақвиятдиҳиро нишон диҳанд.
Дар Ct Усул ба таҳлили ҳадафи сершумор ҳалшаванда асос ёфтааст. Намунаи ин равиш дар расми 1 оварда шудааст. Тафтиши дақиқи профилҳои амплификатсияи бадастомада принсипи марказии усули SOD -ро нишон медиҳад: ҳама кунҷҳои тақвиятдиҳӣ шакли якхела доранд ва танҳо мавқеи профил бо миқдори ҳадаф алоқаманд аст. Профилҳои аввалини амплификация, ки ба намунаҳои аз ҳама мутамарказ мувофиқанд, дар тарафи чап ҷойгиранд, дар ҳоле ки намунаҳо бо омили афзояндаи маҳлул мунтазам ба тарафи рост мегузаранд. Ин мушоҳида моро ба фаҳмиш овард, ки меъёри истисно метавонад ба фарқияти шакл асос ёбад, на самаранокӣ. Ин бо кори Рутлеҷ ва Стюарт [40] мувофиқат мекунад, ки дар он муаллифон каҷи пурқувватро ҳамчун функсияи самаранокӣ тавсиф кардаанд. Аз ин рӯ, агар самаранокӣ шакли каҷро муайян кунад, тавассути мониторинги шакли профили тақвиятдиҳанда, маълумотро дар бораи самаранокии тақвият гирифтан мумкин аст.
Аввалан, "изи ангушт" барои ҳар як каҷи пурқувваткунӣ истифода мешавад м, yе ва Фмакс ки дар натиҷаи мувофиқ кардани муодилаи Ричардс ба маълумоти хом ба даст омадааст. Баъдтар, ин параметрҳо барои ба даст овардани матритсаи дисперсия-ковариансия барои ҳисоб кардани он истифода шуданд Масофаи Маҳаланобис [30].
Ин ченаки оморӣ ба таносуби байни тағирёбандаҳо асос ёфтааст, ки тавассути онҳо намунаҳои гуногунро муайян ва таҳлил кардан мумкин аст. Аз ҷумла, таҳлили SOD масофаи Маҳаланобисро барои муайян кардани шабоҳати намунаи номаълум дар муқоиса бо маҷмӯи стандартӣ истифода бурд. Ин равиш хеле муфид буд, зеро он ба мо имкон дод, ки на танҳо фарқияти параметрҳои ягона (м, yе ва Фмакс), балки инчунин барои миқдор кардани вариантҳои мутақобилаи байни м, yе ва Фмакс.
Фмакс Ҳангоми таҳияи SOD баррасӣ карда шуд, зеро ин параметр тақвияти бомуваффақиятро нишон медиҳад ва одатан, дар шароити тақвияти субоптималӣ, хонишҳо ба хусусият намерасанд Фмакс арзиш[9]. Базаи маълумоти моро тафтиш карда, қайд карда шуд, ки Фмакс ихтилофи баланд нишон дод, аз ин рӯ он каме таъсир c & # 178SOD танҳо, аммо Фмакс ба матрицаи дисперсия-ковариансй таъсири калон расонд. Параметр м нишебии каҷро дар нуқтаи гардиш тавсиф мекунад [11]. Дар модели мо, арзиши баландтар аст м, баландшавии суръати тақвият аст. Бо вуҷуди ин, ин ҳисобкунак самаранокии пурқувватро, ки ҳамчун таносуб байни миқдори маҳсулоти ҷорӣ ва қаблӣ фаҳмида мешавад, мустақиман нишон намедиҳад [38].
Ниҳоят, асимметрияи профилҳои амплификатсия аз рӯи робитаи байни онҳо назорат карда шуд Фмакс ва yе. Исбот шудааст, ки хатҳои комилан симметрии ПТР хеле кам ба амал меоянд, ки ҷорӣ намудани мувофиқати панҷ параметрро асоснок мекунанд [25]. Ғайр аз он, дар кори пешинаи мо [11] нишон дода шуд, ки аксуламали амплификатсия дар сурати самаранокии субоптималӣ метавонад аз хати каҷи симматикӣ то сигмоиди асимметрӣ (бо муодилаи Ричардс хуб тавсиф карда шавад) дур шавад. Дар асл, некӯаҳволии модели логистикӣ тадриҷан коҳиш ёфта, самаранокии паст нишон медиҳад, ки тағир додани шакли тақвияти хати ПТР [32].
Таҳлили таносуби байни м, yе ва Фмакс ки аз каҷи стандартӣ ва ДНК ворид карда шудаанд, нишон доданд, ки ин параметрҳои шакл ба консентратсия вобастагӣ доранд. Ин гипотезаи таҷрибавии моро дастгирӣ мекунад, ки ҳама кунҷҳои тақвияти хатти стандартӣ ба ҳам монанданд ва танҳо мавқеи профил миқдори ҳадафро муайян мекунад. Ҳангоми мавҷуд набудани ингибиторияи ПТР муайян карда шуд, ки афзоиши консентратсияи кислотаи танин ва IgG боиси коҳиш Фмакс ва м арзишҳо, дар ҳоле ки асимметрия бо консентратсияи баланди ингибиторҳо афзоиш меёбад (ҳангоми асимметрия афзоиш меёбад, yе нисбат ба мувофик бештар кам мешавад Фмакс Расми 3 ва 4). Мумкин аст, ки ҷилавгирӣ аз кислотаи танинӣ танҳо ба хомӯш кардани флуоресцентҳо вобаста бошад, зеро мо коҳиши назарраси Фмакс ва коҳиши нишебии каҷи слайд. Бо вуҷуди ин, мо инчунин нишон додем, ки асимметрияи флуоресцентӣ зиёд шуда, нишон дод, ки кислотаи танникӣ таҳрифи кинетикии пурқувватро ба вуҷуд меорад. Илова кардани кверцитин ба тақвияти ПТР маълумоти хеле ҷолибро ба вуҷуд овард. Дар асл, мо дидем, ки коҳиш ёфтааст Фмакс ва м арзишҳо дар ҳузури консентратсияи ингибиторҳои баланд, аммо ин флавонид тағироти асимметрии каҷҳоро ба вуҷуд наовард (расми 5D). Маълумоти гузоришшуда ба таври возеҳ нишон медиҳад, ки усули SOD метавонад кинетикаи ғайримутаносиби ПТР-ро, ки дар натиҷаи моделҳои мухталифи ингибитсия муайян карда мешавад, муайян кунад. Ғайр аз он, натиҷаҳое, ки дар ҳузури кверситин ба даст оварда шудаанд, аҳамияти истифодаи равиши бисёрҷонибаро таъкид мекунанд.
Ҳангоми муқоисаи SOD бо иҷрои KOD, маълум шуд, ки SOD дар ҳама танзимоти санҷидашуда нисбат ба KOD ҳассостар аст. SOD ва KOD дар ҳузури IgG ва кверситин яксон мушаххас буданд, дар ҳоле ки SOD дар ҳузури кислотаи танинӣ нисбат ба KOD мушаххастар буд.
Ғайр аз он, усули SOD як қатор бартариҳоро дар муқоиса бо KOD SOD комилан дастӣ дорад. Дар ҳақиқат, барои корбар муайян кардани равзанаи таҳлил ба мисли усули KOD шарт нест ва муҳимтар аз ҳама, SOD ба арзиши доимии самаранокӣ такя намекунад, то аз ҳама мушкилоти марбут ба муайян кардани он канорагирӣ кунад [28, 40, 41]. Тавре ки пештар хабар дода будем, муайянкунии самаранокии ПТР метавонад боиси натиҷаҳои гуногун гардад, ки ба миқдорҳои хато ва паҳншуда мусоидат мекунанд [19].
Гузашта аз ин, тағирёбии гузоришҳои флуоресценс, ки метавонанд барои ғаразнокӣ дар таҳлил масъул бошанд, пешгирӣ карда мешавад.
Усули SOD барои кимиё Sybr Green таҳия шудааст ва татбиқи ин тартиб дар кимиёҳои дигар ба монанди TaqMan бояд ба таври васеъ арзёбӣ карда шавад.
Ба наздикӣ, Тичопад ва дигарон. [29] тартиби нави KOD -ро дар асоси омори Малаханобис пешниҳод кард [30]. Дар ин тадқиқот максималии ҳосилшудаи якум ва максими ҳосилаҳои дуюм бо истифода аз фитинги логистикӣ дар қисми марказии траекторияи PCR ҳисоб карда шуданд. Бо истифода аз ин ду параметр, ин муаллифон мониторинги танҳо нимаи аввали каҷро пешниҳод кардаанд. Баръакс, усули SOD ба имкони тавсифи тамоми траекторияи PCR бо истифода аз муодилаи Ричардс асос ёфтааст. SOD идома ва тавсеаи татбиқи муодилаи Ричардсро ба хонишҳои PCR дар вақти воқеӣ ифода мекунад [11]. Мо фикр мекунем, ки усули SOD мафҳумҳои аслиро пешниҳод мекунад, ки дар усули ба наздикӣ таҳияшуда, ки Тичопад ва дигарон тавсиф кардаанд, мавҷуд нестанд. [29]. SOD аз имкони тавсифи шакли тамоми траекторияи PCR тавассути омезиши параметрҳо истифода мебарад. м, yе ва Фмакс дар ҳоле ки усули Тичопад ва дигарон. [29] ба ду нуқтаи калидии траектория тамаркуз мекунад: ҳадди максималии ҳосилаҳои якум ва дуюм.
Ғайр аз он, дар усули SOD мо як равиши дигари метрикиро истифода бурдем. Ҳарчанд дигар усулҳои гуногунҷабҳа барои вазифаҳои шабеҳ дастрасанд (мошинҳои вектории дастгирӣ, кластери K-васила), мо тақсимоти асимптотикии масофаи Маҳаланобисро истифода бурдем, зеро он тавсеаи мантиқии усули KOD мебошад, ки ба тақсимоти муқаррарии яктарафа асос ёфтааст.

Мо нишон додем, бори аввал, ки муқоисаи тағирёбии шакли профили амплификация бо шакли профилҳои стандартӣ метавонад барои истисно кардани намунаҳои ғайриоддӣ истифода шавад. Ct таҳлил. Ин ба мо имкон медиҳад, ки паҳншавии натиҷаҳоро пешгирӣ кунем ва аз ин рӯ потенсиали таҳлили миқдориро афзоиш диҳем.
Аз ин рӯ, мо SOD-ро ҳамчун усули назорати бидуни даст дар таҳлили вақти воқеии ПТР бо замимаҳо дар ҳама соҳаҳои ташхиси молекулавӣ пешниҳод менамоем.

Файли иловагӣ 1 -
Маълумоти флуоресценсия ва таҳияи мувофиқи тақвиятдиҳии намунаи стандартӣ (каҷи стандартӣ) ва амплификатсияҳое, ки дар ҳузури: кислотаи таннӣ, IgG ва кверситин ба даст оварда шудаанд. Файли иловагӣ 2 -
Ҳалли таҳлилӣ барои арзиши y нуқтаи гардиш (Yе.) ва нишебии хати рости тангенс (м) аз нуктаи гардиш гузаштан.
  • A) Тақсимоти хи-мураббаъ масофаҳои квадратӣ дар бораи вектори миёнаи аҳолӣ (D2 = y - Σ)'Σ -1 (y - Σ)) бо 3 дараҷаи озодӣ.
  • $ B) Қитъаҳои парокандаи ҳамаи ҷуфтҳои тағирёбанда Фмакс, Yе ва м.
Файли иловагӣ 2 -
амплификатсияҳо (каҷи стандартӣ) ва амплификатсияҳое, ки дар ҳузури: кислотаи таннӣ, IgG ва кверситин ба даст оварда шудаанд.

Ct: сикли остона IgG: иммуноглобулин Г SOD: муайянкунии берунии кинетикӣ дар асоси шакл КОД: муайянкунии берунии кинетикӣ Асим: Ассиметрия.

MG ва DS тарҳи таҳқиқотро анҷом доданд, дар таҳлили маълумот иштирок карданд, усули SOD -ро таҳия карданд ва дастнависро таҳия карданд. MBLR дар ҷамъоварӣ ва таҳлили маълумот ширкат варзид ва дастнависро ба таври интиқодӣ аз назар гузаронд. PT дар вақти воқеӣ ПТР гузаронд. ДМ дар ҷамъоварии маълумот иштирок кард. VS дар тарҳрезии омӯзиш ширкат варзид ва дастнависро аз нигоҳи танқидӣ аз нав дида баромад. Ҳама муаллифон дастнависи ниҳоиро хонданд ва тасдиқ карданд.

1 Dipartimento DiSUAN, Sezione di Biomatematica, University of Studi di Urbino "Carlo Bo", Campus Scientifico Sogesta Localitî Crocicchia - 61029 Urbino, Италия ва 2 Dipartimento di Scienze Biomolecolari, Sezione di Ricerca SaluliaAutivia "Studi di Urbino" Carlo Bo ", Тавассути I Маггетти, 26/2 - 61029 Урбино, Италия.

Ин мақоларо ҳамчун иқтибос овардан: Систи ва дигарон., Муайян кардани кинетикаи берунии кинетикӣ дар вақти воқеии ПТР Биоинформатикаи BMC 2010, 11:186

1. Gingeras TR, Higuchi R, Kricka LJ, Lo YM, Wittwer CT: Панҷоҳ соли ташхиси молекулавӣ (ДНК/РНК).

Протоколҳои табиат 2006 , 1(3):1559-1582. PubMed Abstract | Нашри пурраи матни BioMed

Техникаи био 2008 , 44(5):619-626. BioMed

Gunson RN, Bennett S, Maclean A, Carman WF: Истифодаи мултиплекс PCR дар вақти воқеӣ бо мақсади ба тартиб даровардани хидмати муқаррарии ташхис.

Ҷ Клин Вирол 2008 , 43(4):372-375.

Watzinger F, Ebner K, Lion T: Муайян кардан ва мониторинги сироятҳои вирусӣ тавассути ПТР дар вақти воқеӣ.

Ҷанбаҳои молекулавии тиб 2006 , 27(2-3):254-298. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Калтенбоек Б, Ванг С: Дастовардҳо дар вақти воқеии ПТР: татбиқ ба ташхиси лаборатории клиникӣ.

Пешрафтҳо дар химияи клиникӣ 2005 , 40:219-259. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Акане А, Матсубара К, Накамура Х, Такахаши С, Кимура К: Муайян кардани пайвастагии гем, ки бо кислотаи дезоксирибонуклеинӣ (ДНК) аз доғҳои хун тоза карда шудааст, ингибитори асосии тақвияти реаксияи занҷири полимеразӣ (PCR).

Маҷаллаи илмҳои криминалистӣ 1994 , 39(2):362-372. PubMed Abstract | BioMed

Уилсон IG: Ингибит ва мусоидат ба тақвияти кислотаи нуклеинӣ.

Микробиологияи амалӣ ва экологӣ 1997 , 63(10):3741-3751. PubMed Abstract | PubMed Central Матни пурра | BioMed

Тичопад А, Дидье А, Пфаффл МВ: Монеаи муайянкунии миқдорӣ дар вақти воқеӣ RT-PCR аз сабаби ифлоскунандаҳои хоси бофта.

Зондҳои ҳуҷайраҳои Mol 2004 , 18(1):45-50. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Россен Л, Норсков П, Холмстром К, Расмуссен ОФ: Манъ кардани ПТР аз ҷониби ҷузъҳои намунаҳои ғизо, ташхисҳои ташхиси микробҳо ва маҳлулҳои истихроҷи ДНК.

Маҷаллаи байналмилалии микробиологияи ғизо 1992 , 17(1):37-45. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Guescini M, Sisti D, Rocchi MB, Stocchi L, Stocchi V: Усули нави PCR дар вақти воқеӣ барои бартараф кардани нодурустии назарраси миқдорӣ аз сабаби ҷилавгирӣ аз амплификация.

Кайнз П: Марҳилаи платформаи ПТР - ба дарки маҳдудиятҳои он.

Biochimica ва biophysica acta 2000 , 1494(1-2):23-27. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Ливак КД, Шмиттген ТД: Таҳлили маълумоти ифодаи нисбии ген бо истифода аз PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеӣ ва усули 2(-Delta Delta C(T)).

Усулҳо (Сан Диего, Калифорния) 2001 , 25(4):402-408. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Лю В, Сент -DA: Тасдиқи усули миқдорӣ барои кинетикаи PCR дар вақти воқеӣ.

Biochem Biophys Res Commun 2002 , 294(2):347-353. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Rutledge RG: Муайян кардани каҷҳои сигмоидалӣ PCR-и миқдорӣ дар вақти воқеиро бо дурнамои таҳияи замимаҳои автоматии баландсуръат муайян мекунад.

Pfaffl MW: Модели нави математикӣ барои миқдории нисбӣ дар вақти воқеии RT-PCR.

Голл Р, Олсен Т, Куи Г, Флорҳолмен Ҷ: Арзёбии миқдорҳои мутлақ аз ҷониби регрессияи ғайрихаттӣ дар вақти воқеии ПТР.

Бар Т, Сталберг А, Муста А, Кубиста М: Муайянкунии кинетикии берунӣ (KOD) дар вақти воқеии ПТР.

Kontanis EJ, Reed FA: Арзёбии самаранокии тақвияти PCR дар вақти воқеӣ барои ошкор кардани ингибиторҳои ПТР.

Маҷаллаи илмҳои судӣ 2006 , 51(4):795-804. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Ramakers C, Ruijter JM, Deprez RH, Moorman AF: Таҳлили бидуни тахминии маълумотҳои реактивии занҷири полимеразӣ (ПТР) дар вақти воқеӣ.

Neurosci Lett 2003 , 339(1):62-66. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Вилҳелм Ҷ, Пингуд А, Ҳаҳн М: Санҷиши алгоритми рақамгузории автоматии рақамҳои нусхаи кислотаи нуклеин бо реаксияи занҷираи полимеразӣ.

Биохимияи анал 2003 , 317(2):218-225. PubMed Abstract | Матни пурраи нашркунанда | BioMed

Вилҳелм Ҷ, Пингуд А, Ҳаҳн М: SoFAR: нармафзор барои арзёбии пурраи автоматии маълумоти PCR дар вақти воқеӣ.

Техникаи биологӣ 2003 , 34(2):324-332. BioMed

Ruijter JM, Ramakers C, Hoogaars WM, Karlen Y, Bakker O, Hoff MJ, Moorman AF: Самаранокии тақвият: алоқаи асосӣ ва ғаразнок дар таҳлили маълумоти миқдории ПТР.

Лю В, Сент -DA: Усули нави миқдории санҷиши реаксияи занҷири баръакси транскрипсияи полимеразӣ дар асоси моделиронии кинетикаи реаксияи полимеразҳо.

Биохими анал 2002 , 302(1):52-59. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Spiess AN, Feig C, Ritz C: Ҷойгиркунии дақиқи сигмоидалии маълумоти ПТР дар вақти воқеӣ тавассути ҷорӣ кардани параметр барои асимметрия.

Qiu H, Durand K, Rabinovitch-Chable H, Rigaud M, Gazaille V, Clavere P, Sturtz FG: Ифодаи гении HIF-1alpha ва XRCC4, ки дар намунаҳои инсон тавассути RT-PCR дар вақти воқеӣ бо усули сигмоидалии мувофиқ кардани қубур чен карда шудааст.

Техникаи биологӣ 2007 , 42(3):355-362. BioMed

Rutledge RG, Стюарт Д: Модели сигмоидалӣ дар асоси кинетикӣ барои реаксияи занҷири полимераз ва татбиқи он ба ПЗР-и миқдории мутлақ бо иқтидори баланд.

Cikos S, Bukovska A, Koppel J: Миқдори нисбии mRNA: муқоисаи усулҳое, ки айни замон барои таҳлили маълумоти ПТР дар вақти воқеӣ истифода мешаванд.

Tichopad A, Bar T, Pecen L, Kitchen RR, Kubista M, Pfaffl MW: Назорати сифат барои PCR -и миқдорӣ дар асоси санҷиши мутобиқати тақвият.

Rencher AC: Усулҳои таҳлили гуногунҷанба. нашри 2. Wiley, дар ИМА 2002 чоп шудааст.

Ҷавонони CC, Burghoff RL, Keim LG, Minak-Bernero V, Lute JR, Hinton SM: Поливинилпирролидон-Агароза гели электрофорез Тоза кардани ДНК-и реаксияи занҷири полимеразӣ аз хок.

Микробиологияи амалӣ ва муҳити зист 1993 , 59(6):Солҳои 1972-1974 PubMed Abstract | Матни пурраи PubMed Central | BioMed

Tichopad A, Polster J, Pecen L, Pfaffl MW: Модели пешгирии полимеразаи Thermus aquaticus polymerase ва вируси лейкемияи мурини Moloney транскриптазаи баръакс бо полифенолҳои чой (+)-катехин ва (-)-эпигаллокатехин-3-галлат.

J Этнофармакол 2005 , 99(2):221-227. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Nolan T, Hands RE, Ogunkolade W, Bustin SA: SPUD: санҷиши миқдории ПТР барои муайян кардани ингибиторҳо дар омодагӣ кислотаи нуклеин.

Биохимияи анал 2006 , 351(2):308-310. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Мерфи Ҷ, Бустин SA: Эътимоднокии ПТР-и баръакси транскрипт дар вақти воқеӣ дар ташхиси клиникӣ: стандарти тиллоӣ ё ғайристандартӣ?

Баррасии коршиносони ташхиси молекулавӣ 2009 , 9(2):187-197. PubMed Abstract | Матни пурраи ношир | BioMed

Chandler DP, Wagnon CA, Bolton H Jr: Ингибитсияи баръакси транскриптазаи (ҶТ) ПТР дар консентратсияҳои пасти шаблон ва оқибатҳои он барои миқёси RT-PCR.

Микробиологияи амалӣ ва экологӣ 1998 , 64(2):669-677. PubMed Abstract | PubMed Central Матни пурра | BioMed

Кубиста М, Стахлберг А, Бар Т: Санҷиши равшанӣ дар асоси Q-PCR дар вақти воқеӣ.

Дар Технологияҳои геномика ва протеомикӣ аз SPIE Таҳрир: TW Raghavachari R. 2001, 53-58. BioMed

Karsai A, Muller S, Platz S, Hauser MT: Арзёбии омехтаи реаксияи худсохти SYBR Green I барои миқдори воқеии PCR-и ифодаи ген.

Техникаи био 2002 , 32(4):790-792. BioMed

Tichopad A, Dzidic A, Pfaffl MW: Такмили миқдорӣ дар вақти воқеии RT-PCR тавассути баланд бардоштани самаранокии амплификацияи вобаста ба праймер.

Мактубҳои биотехнология 2002 , 24:2053-2056. Матни пурраи ношир | BioMed

Rosenstraus M, Wang Z, Chang SY, DeBonville D, Spadoro JP: Назорати дохилӣ барои ПТР -и ташхиси муқаррарӣ: тарҳ, хосиятҳо ва таъсир ба иҷрои клиникӣ.

Маҷаллаи микробиологияи клиникӣ 1998 , 36(1):191-197. PubMed Abstract | PubMed Central Матни пурра | BioMed

Rutledge RG, Стюарт Д: Арзёбии интиқодии усулҳое, ки барои муайян кардани самаранокии амплификация истифода мешаванд, хусусияти экспоненсиалии PCR-ро дар вақти воқеӣ рад мекунад.

Скерн Р, Фрост П, Нилсен Ф: Миқдори нисбии транскрипт бо ПТР -и миқдорӣ: тақрибан дуруст ё аниқ нодуруст?


Натиҷаҳо

Миқдор бо истифода аз AccuCal

Барои ҳалли мушкилоти деринаи усулҳои анъанавии миқёси ПТР [8], ҳалли методологӣ бояд ба осонӣ ба ҳар як даврии qPCR ворид карда шавад, натиҷаҳои дақиқ диҳад ва ба таври идеалӣ дар ҳама ҷо татбиқ карда шавад.

Ин усул ба AccuCal-D, калибратори дукаратаи ДНК барои истифода бо рангҳои байниҳамдигарӣ ё AccuCal-P, калибратори якқатор ва флуоресцентӣ бо тамғакоғазӣ барои таҳлилҳои qPCR дар асоси зонд такя мекунад. Оптимизатсияи аввала лозим аст, аммо пас аз ин, усули AccuCal се қадами оддиро дар бар мегирад (расми 1а ва муфассал дар Усулҳо). Нармафзори RealCount ™ барои автоматикунонии қадамҳои ҳисоб таҳия шудааст.

Миқдори кислотаи нуклеинӣ тақвиятёфтаи ПТР бо истифода аз калибратори AccuCal. а Ҷараёни кор бо истифодаи AccuCal барои муайян кардани миқдори кислотаи нуклеин дар ҳар як ПТР, б Калибратори AccuCal гудохта шуд, то 0, 40, 60, 80, 120, 140 ва 200 нг дар Sso Fast EvaGreen Supermix ба чоҳҳои дахлдори табақи ПТР илова карда шуда, ба 40 давраҳои тақвиятёбанда дучор оянд. в Шиддатнокии флуоресценсияи ҳар як калибратори AccuCal (пас аз тарҳкунии флюоресценти 0 нг AccuCal) дар муқоиса бо миқдор (пмолҳо) ва хатти регрессияи хаттӣ, ки барои тавлиди хати калибрченкунӣ муҷаҳҳаз карда шудааст, тасвир карда шуд. г Маҳлулҳои даҳкаратаи ДНК лямбда, ки аз 4,5 × 10 6 – 4,5 × 10 1 нусха/PCR иборатанд, дар чор маротиба дар Sso Fast EvaGreen Supermix дар як табақи калибраторҳои AccuCal тақвият дода шуданд. д Каҷи калибрченкунӣ дар баробари самаранокии ҳисобшудаи ҳар як реаксияи пурқувваткунӣ ва рақамҳои давра байни нуқтаи парвоз (Cq) ва максимаҳои ҳосилшудаи дуюм барои ҳар як реаксияи амплификация барои муайян кардани миқдори миёнаи ибтидоии ДНК дар ҳар як ПТР истифода шуд. Хатои стандартии миёна низ нишон дода шудааст. е Шумораи назариявӣ ва муайяншудаи нусхаҳо/ПТР, илова бар SEM, бар зидди якдигар ва хати регрессионӣ нишон дода шудаанд, то созишномаи байни ин ду арзишро нишон диҳанд

Барои муайян кардани диапазони AccuCal-D, оптимизатсияи аввалия дар ҳамон шароити реаксия барои тақвияти ДНК анҷом дода шуд. Дар мисоли нишон додашуда, диапазони 0–140 нг оптималӣ буд, зеро ин қисмати экспоненсиалии каҷҳои тақвиятдиҳандаро дар бар мегирифт, ки дар он миқдори ҳадафи тавсеаёфта бо ҳаҷми воридот мутаносибан мутаносиб аст [9, 10] ва хатӣ дода шудааст хати калибрченкунӣ бо арзиши R 2 аз 0.9987 (расми 1b, c ва файли иловагӣ 1). Ин муайянкуниро танҳо як маротиба иҷро кардан лозим аст, ба шарте ки шароити реаксияи ҳама ПТРҳои минбаъда доимӣ боқӣ монад.

Барои нишон додани дақиқии миқдории AccuCal-D, мо иловаҳои сершумори даҳ маротиба миқдори ампликони 92 bp аз ДНК ламбда, аз 4,5 × 10 6-4,5 × 10 1 нусхаҳоро дар чор маротиба дар баробари AccuCal-D, дар маблағи пешакӣ муайяншударо тартиб дода, хатти калибрченкуниро тартиб доданд (расми 1b-d). Самаранокии ҳар як аксуламали тақвиятдиҳӣ аз ҷониби RealCount бо истифода аз алгоритмҳои маълум муайян карда шуд [10]. Ниҳоят, бо истифода аз арзишҳои самаранокӣ ва хатти калибрченкунӣ, миқдори миёнаи ДНК -и вуруд ва хатои стандартии миёна барои ҳама давраҳо дар марҳилаи экспоненсиалии ҳар як каҷи тақвият бо истифода аз RealCount ҳисоб карда шуд (расми 1e). Таҳлили регрессивӣ байни арзишҳои муайяншуда ва миқдори назариявии ба ПТР кошташуда R 2 аз 0.9977 (расми 1f) -ро нишон дод, ки истифодаи усули AccuCal-D ва дурустии онро дар миқёси мутлақи qPCR дар вақти воқеӣ нишон медиҳад.

AccuCal-D барои тавлиди флуоресцент ба рангҳои байниҳамдигарӣ такя мекунад, аммо ранг: таносуби флуорессенси AccuCal-D маълум нест. Барои фаҳмидани ин муносибат, мо як версияи таҳқиқи AccuCal, AccuCal-P таҳия кардем. Ампликони 92 bp аз як қатор консентратсияҳои ДНК лямбда тақвият дода шуд ва бо истифода аз як проби гидролизи бо номи FAM ё рангкардашудаи EvaGreen муайян карда шуд. Ҳарду AccuCal-D ва FAM бо тамғаи AccuCal-P ба лавҳаи ПТР дохил карда шуда буданд ва мустақилона барои миқдор кардани ДНК-и лямбда, ки ҳарду маркер ошкор карда буданд, истифода мешуданд. Миқдорӣ бо истифода аз AccuCal-D ё AccuCal-P, барои ҳар ду маҷмӯи пурзӯркунии PCR, натиҷаҳои фарқнашавандаро барои ҳар як ҳалкунанда бидуни фарқияти назаррас байни нишебиҳо дод, вақте ки шумораи назариявии нусхаҳо дар муқоиса бо шумораи муайяни нусхаҳо (нишебиҳо = 0,9601, 0,9653) ҳисоб карда мешавад. , 0.9623 ва 0.9701, R 2 = 1 барои ҳар як расми 2а ва файли иловагии 1). AccuCal-P ва проби гидролиз бо як порчаи FAM дар як молекулаи ДНК нишонгузорӣ карда мешаванд ва ҳамон як флуоресценцияро ба як молекулаи ДНК, ки ранги EvaGreen дар ин шароити qPCR мекунад, гузориш медиҳанд.

Миқдор бо истифода аз AccuCal-D ва AccuCal-P. а Панҷ ва даҳ баробар гудозиши миқдори маълуми ДНК ламбда, ки аз 4,5 × 10 5 то 4,5 × 10 1 мебошанд, ду маротиба дар чор маротиба зиёд карда шуданд ва бо истифода аз EvaGreen, рангҳои байнишахсӣ дар Sso Fast mastermix ё тамғаи FAM тамға карда шуданд санҷиши гидролизӣ, ки ба ампликони мақсаднок хос аст. Дар ҳарду ҳолат, калибраторҳои AccuCal-D ва AccuCal-P ба як табақ дохил карда шуда буданд ва барои мустақилона миқдор кардани миқдори ибтидоии ДНК-и вуруд дар ҳар як ПТР истифода мешуданд. Маблағи назариявӣ нисбат ба маблағи ҳисобшуда, ки аз ҷониби AccuCal-D ё AccuCal-P муайян карда шудааст, бо истифода аз рангҳои EvaGreen (EG) ё проби гидролиз (P) муайян карда шуда, регрессияи хаттии ҳар кадоме дар графики рост нишон дода шудааст . б Панҷ ва даҳ баробар гудохтани миқдори маълуми ДНК лямбда дар чор маротиба дар мастермикси Sso Fast бо ёрии праймерҳо барои додани ампликони 501 bp зиёд карда шуданд. Калибраторҳои AccuCal-D ва AccuCal-P ба ҳамон як табақ дохил карда шуда буданд ва барои мустақилона муайян кардани миқдори ибтидоии ДНК ламбда дар ҳар як ПТР истифода мешуданд. Маблағи назариявӣ нисбат ба маблағи ҳисобшуда, ки аз ҷониби AccuCal-D ё AccuCal-P муайян карда мешавад, барои ампликони 501 bp, графикӣ карда шуд ва регрессияи хаттии ҳар яки онҳо дар графики рост нишон дода шудааст. в Панҷ, даҳкарата (3-100 бор дар эко) миқдори маълуми ДНК-и ламбда дар мастермиксҳои гуногун (ниг. Усулҳо) дар платформаҳои гуногуни qPCR, ки зиёда аз 2-10 давраи PCR нишон дода шудаанд, тақвият дода шуданд. Маблағи назариявӣ бо миқдори миёнаи ҳисобкардашуда, ки аз ҷониби AccuCal-D муайян карда шудааст, дар тамоми платформаҳо кашида шуда буд ва регрессияи хатӣ дар графики рост нишон дода шудааст. Шумораи миёнаи нусхаҳои ҳисобшуда/PCR ва SEM дар ҳар як ҳолат нишон дода мешаванд

Барои муайян кардани доираи андозаи ампликонҳо, ки барои онҳо AccuCal-D миқдорро истифода бурдан мумкин аст, мо инчунин ампликонҳои лямбдаро 501 bp такмил додем. Ампликонҳои 92 bp то 501 bp спектри андозаҳои ампликонҳоро дар бар мегиранд, ки одатан бо qPCR тақвият дода мешаванд. Боз ҳам, AccuCal-P ва проби гидролизи мушаххаси шаблон бо номи FAM ҳамчун муқоисакунанда барои рангҳои AccuCal-D ва intercalating истифода шуданд. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки миқдор барои ҳарду андозаи ампликон якхела аст, новобаста аз он ки он бо истифода аз AccuCal-D ё AccuCal-P ҳисоб карда мешавад ва ҳеҷ нишебии он аз 1 фарқ надорад (Расми 2b). Ин аз он шаҳодат медиҳад, ки флуорессенсияи ранг ва зонд дар ин диапазони андозаҳои ампликон доимӣ боқӣ мемонад ва аз ин рӯ AccuCal метавонад барои муайян кардани миқдори ҳама гуна ампликон дар ин диапазон боэътимод истифода шавад.

Барои арзёбии кори AccuCal-D дар як қатор мастермиксҳои бар асоси рангҳо дар як қатор платформаҳои qPCR дар вақти воқеӣ, ҳашт гурӯҳи мустақили тадқиқотӣ бо AccuCal-D ва реагентҳо барои амплификацияи ламбда (92 bp ампликон) таъмин карда шуданд. Ҳар як лаборатория GOI-ҳои худро ва миқдори маълуми воридоти ламбдаро дар як қатор шароитҳое, ки барои ин лабораторияҳо хосанд, афзоиш доданд. Натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки AccuCal-D миқдори дақиқи дақиқи консентратсияи маълуми ДНК-и лямбдаро дар ин санҷишҳои гуногун ва мустақил таъмин мекунад (расми 2в). Ҳангоми муқоисаи дастаҷамъона дар тамоми платформаҳо, миқдори миёнаи муайяншуда бо шумораи назариявии нусхаҳои ҳар як ПТР комилан мувофиқ аст (расми 2в, нишеб = 1).

Ҳангоми ворид шудан ба ҳар як qPCR дар ҳамон шароите, ки GOI (ҳо) иҷро мешаванд, AccuCal миқдорҳои боэътимоди мутлақро дар доираи миқдори воридотӣ ва андозаи ампликон дар таҳлилҳои ба ранг ё санҷиш асосёфта таъмин мекунад.

AccuCal эътимодро ба таҳлили нисбии миқдорӣ таъмин мекунад

Миқдори нисбӣ Таҳлилҳои qCq [11] ва Pfaffl [12], маъмулан усули соддатарин ва аз ҳама бештар истифодашавандаи миқдории ПТР будаанд. Гарчанде ки AccuCal миқдори мутлақро пешниҳод мекунад, онро нисбатан истифода бурдан мумкин аст.

Барои муқоисаи AccuCal-D бо таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl, мо сатҳҳои CD40 ва вариантҳои занҷири ресепторҳои алфа (IL7R)-ро арзёбӣ кардем. Фаъолсозии ҳуҷайраҳои мононуклеарии периферии хуни инсон (PBMCs) репертуари вариантҳои ҷудошавии ин генҳоро нишон медиҳад, ки майл ба склерозҳои сершуморро инъикос мекунанд [13, 14]. Мо барои чен кардани сатҳҳо таҷрибаҳо гузаронидем CD40 ва IL7R дар PBMC -ҳои инсон тавассути qPCR пас аз фаъолсозии 24 соат бо миқдори гуногуни форбол мирсат ацетат (PMA) ва иониомицин (PMA/I). Миқдори мутлақи qPCR бо истифода аз AccuCal-D ва RealCount анҷом дода шуд (расми 3а ва файли иловагии 1). Миқдори нисбӣ бо ифодаи арзишҳои мутлақи AccuCal-D нисбат ба назорати PMA/ionomycin ё таҳлили анъанавии qCq ё Pfaffl бо истифода аз глицералдегид 3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH) ҳамчун генҳои истинод ва ҳуҷайраҳои ҳавасмандкунанда ҳамчун назорат (расми 3б). Барои таҳлили Pfaffl, самаранокии ҳисобкардаи RealCount истифода шуданд.

Шумораи CD40, IL7R ва GAPDH дар PBMCs, ки бо 0-1x PMA / иономицин ҳавасманд карда мешаванд. а Миқдори мутлақ CD40, IL7R ва GAPDH дар PBMCs бо 0, 0.25x, 0.5x ва 1x PMA/иономицин (20 нг мл -1 PMA, 500 нг мл -1 иономицин PMA/I) аз ҷониби нармафзори RealCount пас аз qPCR бо истифода аз калибраторҳои AccuCal-D ҳавасманд карда шудаанд. б Сатҳи ифодаи нисбии CD40 ва IL7R дар PBMCs бо 0, 0.25x, 0.5x ва 1x PMA/ionomycin (20 ng ml -1 PMA, 500 ng ml -1 ionomycin) ҳавасманд карда мешаванд. Барҳои чӯбдаста сатҳҳои ифодаи нисбӣ мебошанд, ки бо истифода аз ΔΔCq муайян карда мешаванд GAPDH ҳамчун генҳои истинод ва ҳеҷ PMA/ionomycin ҳамчун намунаи назоратӣ, сутунҳои сахт сатҳҳои ифодаи нисбат ба таҳлили Pfaffl муайяншуда, бо истифода аз GAPDH ҳамчун генҳои истинод, ҳуҷайраҳои стимулятсиянашуда ҳамчун назоратҳо ва арзишҳои самаранокии инфиродӣ, ки аз ҷониби нармафзори RealCount ҳисоб карда шудаанд ва сутунҳои чекӣ миқдор карда мешаванд аз ҷониби нармафзори RealCount пас аз ворид кардани AccuCal-D ба ҳамон як коркарди ПТР, ва нисбат ба назорати PMA/ionomycin изҳор нашудааст. в Графикаи намояндагӣ аз ситометрияи ҷараён, ки ченкунии нисбии CD40 ва IL7R -ро дар ҳамон як аҳолии PBMC -ҳо, ки бо 0 (сурх), 0,25х (кабуд), 0,5х (сабз) ва 1x PMA/ionomycin (20 ng ml -1 PMA, 500 ng ml -1 ionomycin норанҷӣ) тавре ки дар (а). **** саҳ & lt 0.0001 нисбат ба ягон назорати PMA/ionomycin, н = 4

Ҳам таҳлили мутлақ ва ҳам нисбӣ ифодаи IL7R дар ҳуҷайраҳои ҳавасмандшуда 3-10 маротиба камтар буд (саҳ ≤ 0.0001 бо ҳама усулҳо) дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои стимулятсияшуда, дар ҳоле ки ҳама гуна фарқиятҳо дар сатҳи CD40 аҳамияти калон надоштанд. Дар ин таҷриба, тафсири маълумоти qPCR аз таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl ҳамон тавре буд, ки аз ҷониби AccuCal-D пешниҳод карда шудааст (расми 3б). Фарзия барои таҳлили ΔΔCq ва Pfaffl ин аст, ки сатҳи GAPDH гени истинод дар байни табобат доимӣ боқӣ мемонад. Муҳим он аст, ки миқдории мутлақ бо истифода аз AccuCal-D нишон дод, ки ин воқеан чунин аст (расми 3а). Натиҷаҳои таҳлили qPCR бо ситометрияи ҷараён дастгирӣ карда мешуданд, ки дар сатҳи ифодаи CD40 фарқият надоштанд ва 3-5-5 маротиба коҳиш ёфтани ифодаи IL7R дар гурӯҳи табобат дар муқоиса бо ҳуҷайраҳои табобатнашуда (расми 3в).

Муҳим он аст, ки таҳлили AccuCal-D ва RealCount маълумотро дар бораи сатҳҳои ифодаи ҳама генҳо, аз ҷумла генҳои истинод, дар байни табобатҳо/гурӯҳҳо (расми 3а) ва самаранокии инфиродӣ барои ҳар як аксуламали тақвиятдиҳӣ, ки бо истифодаи ΔΔCq ва Pfaffl дастрас нестанд, пешниҳод мекунад. тахлилхо.

AccuCal таҳлили анъанавии миқдорро иваз мекунад

Фосфатазаи хоси простата ва нокаути тенологии гомологӣ (pePTENKO) патологияи простатаро [15] ба вуҷуд меорад ва ифодаи ретсепторҳои махсуси андрогении простата (AR) -ро дар мушҳо, ки аз ҷониби иммуногистохимия муайян карда шудааст, тағир медиҳад (расми 4а ва файли иловагӣ 1) ё блоки ғарбӣ (расми 4b) ). Таҳлили ғарбӣ нишон дод, ки сатҳҳои сафедаи β-актин (ACTB) доимӣ буданд ва барои муайян кардани сатҳи нисбии ифодаи сафедаҳо истифода мешуданд. Мазмуни сафедаи AR ба таври назаррас зиёдтар буд (саҳ = 0.008) дар бофтаи простата аз мушҳои pePTENKO дар муқоиса бо намуди ваҳшӣ (WT Расми 4b).

Миқдори сатҳи сафеда ва mRNA-и ретсепторҳои андроген (AR, Ар) дар простата пеши муш. а Иммуногистохимияи намояндагӣ, ки ифодаи сафедаи AR (ранги қаҳваранг) ва патологияи дифференсиалиро дар простата мушҳои WT ва pePTENKO нишон медиҳад. б Миқдори протеини AR аз ҷониби blot Western дар простатаҳои пешинаи WT (н = 2) ва pePTENKO (н = 4) мушҳо, β-актин (ACTB) -ро ҳамчун назорати боркунӣ барои муайян кардани сатҳи нисбии сафедаҳо истифода мебаранд. в Миқдори нисбии Ар бо истифода аз таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl Актб ҳамчун гени истинод ва WT ҳамчун назорат. г qPCR аз Ар ва Actb дар WT (каҷҳои кабуд, н = 7 дар нусха) ва pePTENKO (кунҷҳои сурх, н = 5 дар дубликат) мушҳо. д Муқоисаи миқдорҳои назариявӣ ва муайяншудаи размҳои силсилавии плазмидҳо Ар ё Актб ампликонҳо аз рӯи хатҳои анъанавии стандартӣ (алмосҳои кабуд ва хат) ё истифодаи AccuCal ва RealCount (чоркунчаҳои сурх ва хат). е Миқдори миқдори нусхаи мутлақи mRNA аз Ар ва Actb гени истинод дар простати пеши WT (н = 7) ва pePTENKO (н = 5) мушҳо, ки аз ҷониби RT-qPCR бо калибраторҳои AccuCal ва нармафзори RealCount (AC) ё хатҳои стандартӣ (Std) муайян карда шудаанд. g Миқдори мутлақи як қатор генҳои истинод бо истифода аз AccuCal ва RealCount барои ҳарду WT (н = 7) ва пеПТЕНКО (н = 5) мушҳо. ч Муқоисаи методологияҳои нисбии миқдор барои Ар. Таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl низ истифода мешаванд Актб ё Hmbs ҳамчун гени истинод ва WT ҳамчун назорат ва арзишҳои мутлақи AccuCal (AC) ва каҷи стандартӣ (Std) ба таври нисбӣ ба WT ҳамчун назорат ифода карда шуданд. Ҳама маълумоти графикӣ ҳамчун миёна ± SEM нишон дода мешаванд. **** p <0.0001, ** саҳ = 0.001–0.01, * саҳ = 0,01-0,05 аз ҷониби ду намунаи мустақил т-санҷиш байни ифодаи ретсепторҳои андроген ё mRNA β-актин ё протеин дар мушҳои pePTENKO дар муқоиса бо мушҳои WT, ё байни усулҳои ифодаи нисбӣ дар муқоиса бо ΔΔCq ва Pfaffl, ки бо истифодаи Актб ҳамчун гени истинод

Барои муайян кардани он, ки оё ин таҳлилҳои мураккабро метавон бо таҳлили mRNA бо истифода аз qPCR иваз кард, мо PCR-ро тақвият додем. Ар ва Actb аз РНК -и простата, ки аз мушҳои WT ва pePTENKO гирифта шудааст. Дар аввал, миқдори нисбӣ тавассути таҳлилҳои анъанавии ΔΔCq ва Pfaffl бо Актб ҳамчун генҳои истинод ва WT ҳамчун назорат. Актб интихоб карда шуд, зеро сафеда дар байни гурӯҳҳо устувор ифода мешуд (расми 4б). Таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl нишон доданд, ки дар он тағироти назаррасе ба амал наомадааст Ар сатҳи ифода дар мушҳои pePTENKO нисбат ба WT (1.250 ва 1.286 маротиба афзоиш, расми 4c). Маълум аст, ки сатҳҳои сафеда ва mRNA ҳатман бо ҳам алоқаманд нестанд [16, 17], ки метавонанд ин натиҷаро шарҳ диҳанд. Интихобан, таҳлили нисбии qPCR метавонад нодуруст бошад. Тафтиши қитъаҳои тақвиятдиҳанда ифодаи бештари онро пешниҳод кард Ар, инчунин Актб, дар простата мушҳои pePTENKO (расми 4d).

Барои ҳалли ин масъала мо миқдори мутлақро тавассути AccuCal-D ё каҷҳои стандартӣ барои муайян кардани сатҳҳои Ар ва Актб дар мушҳои pePTENKO ва WT. Натиҷаҳо нишон доданд, ки сатҳҳои ифодаи ҳар як ген бо ҳар ду усул миқдори мутлақи шабеҳ доштанд (расми 4e) ва дар простата аз мушҳои pePTENKO назар ба мушҳои WT барои ҳам каҷи стандартӣ ва ҳам AccuCal-D хеле баландтар буданд (Ар, саҳ < 0,0001 ва саҳ & lt 0.0001 Актб, саҳ = 0,0049 ва саҳ = 0.0043, мутаносибан расми 4f). Вақте ки ба таври нисбӣ ифода шудааст, Ар ифода дар мушҳои pePTENKO аз рӯи миқдори каҷи стандартӣ аз мушҳои WT 3.806 маротиба ва аз рӯи миқёси AccuCal-D 3.697 маротиба баландтар буд. Ҳардуи инҳо аз таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl ба таври назаррас фарқ мекарданд Актб ҳамчун генҳои истинод (саҳ < 0.0001 Расми 4h), аммо бо натиҷаҳои blot Western мувофиқ буданд. Дар ин мисол, таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl дақиқ набуданд, зеро генҳои истинодшудаи истифодашуда ба GOI байни фенотипҳо шабеҳ тағир ёфтаанд (расми 4f).

Илова бар ин, мо бо AccuCal-D як қатор генҳои дигари истинодро барои ба эътидол овардан истифода бурдем. Байни ифодаи сафедаи рибосомаи L19 фарқияти назаррас вуҷуд надошт (Rpl19) ва гидроксиметилбилансинтаза (Хмбс) байни WT ва pePTENKO, аммо генҳои истинод боқимонда ҳама дар простатаҳои мушҳои pePTENKO нисбат ба мушҳои WT ба таври назаррас фаровонтар ифода ёфтаанд, ки мушкили дарёфти генҳои мувофиқро дар баъзе таҷрибаҳо нишон медиҳанд (Расми 4g). Пас аз он мо таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl-ро бо истифода аз гени истинодҳои тағйирёбандаи камтарин такрор кардем, Хмбсва натиҷаҳо (мутаносибан 4.294 ва 3.603 маротиба афзоиш) ба натиҷаҳое, ки бо истифодаи AccuCal-D ё миқдори каҷии стандартӣ гирифта шудаанд, хеле шабеҳ буданд ва аз таҳлилҳои ΔΔCq ва Pfaffl, ки бо истифода Актб ҳамчун генҳои истинод (саҳ & lt 0.0001 дар ҳарду ҳолат расми 4h).

Дар намунаи тавсифшуда, AccuCal-D як усули алтернативии миқдорӣ, новобаста аз генҳои истинод, ки онҳоро ёфтан душвор аст, пешкаш кардааст (Расми 4h). Муҳим он аст, ки мо инчунин нишон додем, ки миқдори мутлақ аз рӯи хатти стандартӣ ба таҳлили AccuCal-D комилан мувофиқат кардааст (расми 4e, f). Ин нишон дод, ки сатҳи ифодаи сафеда ва генҳои AR/Ар бо ҳам алоқаманд буда, имкон медиҳад, ки таҳлили mRNA аз ҷониби qPCR ҳамчун санҷиши хабарнигори мӯътамад истифода шавад. Ҷолиби диққат аст, ки AccuCal ин маълумотро нисбат ба усули каҷи стандартӣ хеле соддатар пешниҳод кардааст ва барои чен кардани ҳамаи генҳои ҳамзамон таҳқиқшуда як хати калибрченкуниро истифода бурдан мумкин аст.


Prism 3 - Ҳисоб кардани консентратсияи "номаълум" бо истифода аз каҷи стандартӣ

Каҷи стандартӣ графикест, ки миқдори ченшуда (масалан, радиоактивӣ, флуорессенсия ё зичии оптикӣ) ба консентратсияи моддаҳои мавриди таваҷҷӯҳ дар намунаҳои "маълум" алоқаманд аст. Шумо намунаҳои "маълум"-ро, ки дорои моддаҳо мебошанд, ба миқдори интихобшуда барои фарогирии диапазони консентратсияҳое, ки шумо дар намунаҳои "маълум" пайдо мекунед, омода ва таҳлил мекунед. Пас шумо каҷи стандартиро тавассути нақшаи миқдори таҳлилшуда (дар меҳвари Y) нисбат ба консентрат (дар меҳвари X) кашед. Чунин каҷро барои муайян кардани консентратсияи модда дар намунаҳои "номаълум" истифода бурдан мумкин аст. Призма ин равандро автоматӣ мекунад.

Призма метавонад ба кунҷҳои стандартӣ бо истифода аз регрессияи ғайримуқаррарӣ (мувофиқати каҷӣ), регрессияи хатӣ ё қубури сплайн (ё LOWESS) мувофиқат кунад. Барои дарёфти консентратсияи "маълум" бо истифода аз каҷи стандартӣ, ин қадамҳоро иҷро кунед:

Дар Хуш омадед ба Призма қуттии муколама, -ро интихоб кунед Лоиҳаи нав эҷод кунед ва Мустақилона кор кунед. Формат кардани сутуни X -ро интихоб кунед Рақамҳо ва сутуни Y -ро барои шумораи такрори маълумоти шумо формат кунед. Барои мисоли мо, интихоб кунед Як сутуни арзишҳо.

Маълумотро барои каҷи стандартӣ ворид кунед. Дар мисоли мо, ки дар зер нишон дода шудааст, мо консентратсияҳоро барои намунаҳои & quot quot & quot дар сутуни X, сатрҳои 1-5 ва натиҷаҳои таҳлили мувофиқро ба сутуни Y ворид кардем. Парво накунед, агар Prism сифрҳои пасмондаро нишон диҳад, ки шумо ворид накардаед-мо инро баъдтар тағир хоҳем дод. Танҳо дар поёни арзишҳои каҷи стандартӣ, аз сатри 6 сар карда, натиҷаҳои таҳлилро барои намунаҳои "unknown"-ро ба сутуни Y ворид кунед ва ҳуҷайраҳои мувофиқи X-ро холӣ гузоред. Баъдтар, Призма ба хати стандартӣ мувофиқат мекунад ва сипас консентратсияи моддаҳои номаълумро бо истифода аз он каҷ хабар медиҳад.

-Ро пахш кунед Таҳлил кунед тугма Интихоб кунед Таҳлили дарунсохт. Аз Curves & amp Регрессия категория, интихоб кунед Регрессияи хатӣ агар шумо маълумоти намунавии моро истифода баред (ё агар шумо маълумотеро таҳлил карда истодаед, ки гумон мекунед, ки он каҷ аст) Регрессияи ғайрихаттӣ [мувофиқати каҷӣ]). Барои мисол дар бораи чӣ гуна идома додани маълумоти ғайримуқаррарӣ, ба намунаи Таҳлили маълумоти RIA ё ELISA нигаред.

Дар қуттии муколамаи Параметрҳо: Регрессияи хатӣ қуттии ишорашударо қайд кунед Curve Standard X аз Y, зеро мо мехоҳем, ки консентратсияҳои номаълумамон таъмин карда шаванд. Дар Натиҷа категорияи имконоти интихоб кунед Авто Вариантҳо барои муайян кардани он, ки Призм хати регрессияро оғоз ва ба охир мерасонад. Шумораи рақамҳои муҳимро ба 3 таъин кунед.

Вақте ки шумо клик мекунед Хуб барои тарк кардани муколамаи параметрҳои хаттии регрессия, Prism мувофиқро иҷро мекунад ва варақаи натиҷаҳоро эҷод мекунад.

Призма натиҷаҳоро дар саҳифаҳое нишон медиҳад, ки манзара ном дорад. Намуди пешфарз параметрҳои муайянкунандаи каҷи мувофиқати беҳтаринро нишон медиҳад.

Қуттии афтандаро дар сатри сеюми панели асбобҳо бо нишони "Намоиш" ҷойгир кунед (на менюи "Намоиш" дар қисми болоии экран). Интихоб кунед Арзишҳои интерполятсияшудаи X (дар релизҳои аввали призма, ин & quot; каҷи стандартии X аз Y & quot буд).

Prism арзиши X -и мувофиқро барои ҳар як арзиши ҷудошудаи Y дар варақаи иттилоотии шумо гузориш медиҳад.

Ба графики худ номаълум илова кунед

Графикаи автоматии Prism ' маълумотро аз варақаи маълумот ва каҷро дар бар мегирад. Барои илова кардани "unknowns" ба график:

Гузариш ба Графикҳо бахши лоиҳаи шумо.

-Ро пахш кунед Тағйир тугмаро пахш кунед ва сипас интихоб кунед Маълумот дар бораи график.

Қуттии муколама ҳамаи маълумотҳо ва ҷадвалҳои натиҷаҳоро, ки дар график нишон дода шудаанд, нишон медиҳад. -Ро пахш кунед Илова тугма

Аз рӯйхати афтанда дар болои Ба график маҷмӯи маълумотро илова кунед қуттии муколама, -ро интихоб кунед . Регрессияи хатӣ: арзишҳои интерполятсионӣ X. Пахш кунед Илова, пас Пӯшед. Рӯйхати маҷмӯаҳои маълумоте, ки ба график дохил карда шудаанд, акнун бояд ба равзанаи дар поён овардашуда монанд бошанд.

Пахш кунед Хуб барои баргаштан ба график.

Агар шумо хоҳед, ки & quotnknowns & quot ҳамчун хӯшаҳое, ки ба меҳвари X пешкаш карда мешаванд, муаррифӣ карда шавад (на ба нуқтаҳои додаҳо), тугмаи Тағиротро клик кунед ва Рамзҳо ва Хатҳоро интихоб кунед. Аз рӯйхати афтанда "Маҷмӯи маълумот", -ро интихоб кунед. Регрессияи хатӣ: арзишҳои интерполятсионӣ X. Шакли аломатро ба яке аз 4 имконоти охирин иваз кунед (андоза) ва андозаи онро ба 0 муқаррар кунед.

Натоиҷи каҷи стандартӣ -- Номаълумҳо ҳамчун хӯшаҳо дар график нишон дода мешаванд, ки натиҷаҳои ададӣ ҳамчун ҷадвали дарунсохт гузориш дода мешаванд. Тасвир баъзе тағироти форматкуниро дар бар мегирад, ки дар ин ҷо баррасӣ нашудаанд.


Муҳокима

  • Ман фикр мекардам, ки ин як роҳи олиест барои фаҳмидани он ки ман чӣ кор карда истодаам, ба ҷои он ки танҳо гуфта шавад, ки чӣ кор кунам.
  • Воқеан интихоби мутацияе, ки МО шахсан анҷом додам, аз ҳама ҷолибтарин дар тӯли тамоми касби ман дар ин ҷо дар IUP буд.
  • Интихоби мутацияи худ нисбат ба фаҳмидани мутацияи каси дигаре ҷолибтар буд.
  • Ман фикр мекардам, ки ин дар ҳақиқат бузург буд. Ин маро ҳамчун як муҳаққиқ ва таҳқиқгари воқеӣ эҳсос кард.

Бо интихоби мутацияи худ, ин донишҷӯён ба режими тадқиқотчиён дохил мешаванд ва онҳо инро возеҳ пазируфтанд. Хавф дар тақлид кардани вазъияти тадқиқотӣ дар курси лаборатории донишҷӯӣ ин потенсиали баланди натиҷаҳои камтар аз оптималӣ дар муқоиса бо расмиёти “аз ҷониби донишҷӯён санҷидашуда” мебошад. Дар ҳақиқат, танҳо яке аз се гурӯҳ дар BIOC 312 дар тавлиди протеини мутант барои таҳлил муваффақ буд ва ин сафеда танҳо бо усули дар курс истифодашуда қисман тоза карда шуд. Дар ҳоле ки нокомӣ дар тавлиди сафедаи мутация ноумедкунанда хоҳад буд, ҳар як гурӯҳ сафедаи навъи ваҳшии худро бомуваффақият истеҳсол ва тоза хоҳанд кард. Давраҳои курс, ки барои таҳлили сафедаи мутация сарф мешуданд, метавонанд ба осонӣ барои таҳлили иловагии шакли ваҳшӣ истифода шаванд.

Илова ба омезиши хусусиятҳои ду лоиҳаи қаблан тавсифшуда, ин лоиҳа як унсури навро дар бар мегирад, истифодаи усули таҳлили баландсифат дар шакли омӯзиши устувории сафедаҳо бо истифода аз асбоби PCR дар вақти воқеӣ. Бо дарназардошти таваҷҷӯҳи афзоянда ба усулҳои баландсуръат дар таҳқиқот, фош кардани донишҷӯён ба ин усулҳо матлуб аст. Дар ин ҳолат як қатор имтиёзҳои иловагӣ мавҷуданд. Истифодаи асбоби PCR дар вақти воқеӣ ҳам шумораи намунаҳои таҳлилшуда ва ҳам шумораи сессияҳои асбобҳоро барои ҳар як гурӯҳ дар муқоиса бо таҳлили як спектрофлюориметри намуна хеле зиёд кард. Гурӯҳҳое, ки асбоби ПРР-ро дар вақти воқеӣ истифода мебаранд, аз 36 то 76 қубурҳои обшавиро барои сафедаи навъи худ дар панҷ ҷаласаи алоҳида чен мекунанд. Дар соли гузашта, се гурӯҳи донишҷӯён бо истифода аз спектрофлюориметр аз 3 то 5 каҷи обшавии чен карда шуданд. Аз ин рӯ, донишҷӯён имкони бештаре доштанд, ки техникаи худро сайқал диҳанд, тағирёбандаҳои таҷрибавӣ ва таҷрибаҳои минбаъдаро тарҳрезӣ кунанд. Илова бар ин, онҳо дар идоракунӣ ва таҳлили маҷмӯи маълумоти калонтар аз оне, ки одатан дар дигар курсҳои лабораторӣ дучор меоянд, таҷриба андӯхтанд.

Камбудии денатуратсияи гармидиҳӣ, ки аз ҷониби як ранги хабарнигор ба монанди SYPRO норанҷӣ назорат карда мешавад, дар он аст, ки таҳлили термодинамикӣ, ки бо маълумоти дохилии флуоресценсионӣ имконпазир аст.Ҳ о ва ΔС о барои кушодани 11 эътибор надорад Ин таҳлил тавозуни оддии баръаксро дар байни сафедаи пӯшида ва пӯшида пешбинӣ мекунад. Гарчанде ки ин барои аксари сафедаҳо дар шароити денатуратсияи термикӣ комилан дуруст нест, он бешубҳа дар ҳузури ранги хабарнигор дуруст нест, ки ҳангоми ба вуқӯъ омадан бо сафеда ба таври гуногун пайваст мешавад. Арзишҳои термодинамикӣ, ки дар ин ҳолат ба даст омадаанд, ҳам ҷараёни сафеда ва ҳам ҳатмии ранги хабарнигорро инъикос мекунанд.

Якчанд вариантҳо имконпазиранд, агар хоҳед, ки таҳлил берун аз ҳисобҳои оддии он дохил карда шавад Т.м аз каҷҳои обшавии. Барои ҳисоб кардани константаҳои диссоциатсияи лигандҳо 7, 8 флюориметрияи дифференсиалии сканерӣ (ченкунии каҷҳои обшавӣ дар ҳолати набудани ва мавҷудияти лиганд) метавонад истифода шавад. Барои ин таҳлил, сафеда дар аввал набояд лиганди бандад дошта бошад. Интихобан, каҷ обшавии чен бо асбоби PCR дар вақти воқеӣ дар ҳузури афлесун SYPRO метавонад истифода шавад барои ҳисоб параметрҳои кинетикӣ барои кушода сафеда дар ҳузури денатурантҳои кимиёвӣ 9. Ҳеҷ яке аз ин таҳлилҳо дар озмоиши ибтидоии лоиҳаи тавсеаи омили тарҷума кӯшиш карда нашуданд. Алтернативаи сеюм дар муҳити алоҳида омӯхта шуд. Ин ба бартараф кардани рангҳои репортерҳо бо истифода аз GFP (EGFP), сафедае асос ёфтааст, ки табиатан дар дарозии мавҷ, ки тавассути асбоби ПРР дар вақти воқеӣ муайян карда мешавад.

EGFP ва протеинҳои флуоресцентии алоқаманд ҳамчун биосенсорҳо дар доираи васеи барномаҳо, аз ҷумла омӯзиши таъсири мутақобилаи сафедаҳо ва сафедаҳо ва тағироти конформалӣ истифода мешаванд. Раванди пӯшидан/кушодани ин сафедаҳои муҳим бо як қатор усулҳои 15-17 омӯхта шудааст. Ин сафедаҳо дар шароити муқаррарии физиологӣ устувории баланди гармӣ доранд ва таҳқиқоти зиёде дар бораи пӯшиш / кушодани онҳо дар рН паст ё дар ҳузури денатурантҳо анҷом дода мешаванд. Таҳлили адабиёт нишон медиҳад, ки таҳқиқоти денатуратсияи гармидиҳии EGFP кам гузаронида шудаанд. Дар ҳоле ки маълум аст, ки ин сафедаҳо модели оддии ду ҳолати кушодашавиро риоя намекунанд, каҷҳои денатуратсия дар баъзе шароитҳо шакли мувофиқи ин модел доранд ва аз ин рӯ метавонанд барои ба даст овардани арзишҳои термодинамикӣ барои раванди умумии кушодашавӣ истифода шаванд. Дар расми 7 қубурҳои обшавии EGFP нишон дода шудааст, ки бо асбоби ПРР дар вақти воқеӣ ба даст оварда шудааст. Натиҷаҳои EGFP аз ҷониби донишҷӯёни бакалавр дар як семестри биохимия тавлид карда шуданд, ки одатан ҷузъи лабораториро дар бар намегирад. Таҷрибаи лабораторӣ бо ифода, поксозӣ ва тавсифи EGFP ба курси бо бақайдгирии хурд дар ҷаласаи тобистона пешниҳодшуда дохил карда шуд. Ин натиҷаҳои ибтидоӣ оид ба денатуратсияи гармидиҳии EGFP бо истифода аз асбоби ПРР дар вақти воқеӣ нишон медиҳанд, ки ин система метавонад барои дохил шудан ба таҷрибаи лаборатории донишҷӯён як умеди умедбахш бошад.