Маълумот

Топологияи ДНК ҳангоми нусхабардорӣ - Биология

Топологияи ДНК ҳангоми нусхабардорӣ - Биология


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ду риштаи спирали ДНК -и волидайн бояд кушода шавад, то полимераза ҳар як қолабро хонад ва риштаи иловагии навро синтез кунад. Ферментҳое, ки ин ҷудошавиро катализ мекунанд, номида мешаванд Геликазаҳои ДНК. Фаъолияти онҳоро метавон бо роҳи табдили ДНК-и дуплекс ба ДНК-и як занҷир биохимик чен кард.

Геликазаҳои ДНК низ фаъолияти дуюм доранд. Онҳо метавонанд дар баробари ДНК -и як занҷири дорои қутби мушаххас ҳаракат кунанд. Қутббандии ҳаракатро метавон тавассути як чен кард дар vitroтаҳлил бо истифода аз зерсохт, ки дар он ду риштаи фарқкунандаи кӯтоҳ ва нишонгузор дар дуплекс бо ду нӯги риштаи дарозтар ҷойгир шудаанд (расми 5.22). Геликаз аввал ба қисми якқатораи ДНК-и субстрат пайваст мешавад ва дар баробари он пайгирӣ мекунад, то он даме, ки он ба минтақаи дуплексӣ вохӯрад ва дар он лаҳза он кушодашавии дуплексро катализ мекунад. Вобаста аз самти пайгирӣ дар минтақаи якқатор танҳо як ё дигар риштаҳои кӯтоҳи тамғагузориро вертолёт иваз мекунад. Ҷойивазкунии молекулаи А дар расми 5.22А нишон медиҳад, ки ин геликаза (DnaB) дар самти 5 'то 3' дар баробари як ДНК -и занҷири ягона барои расидан ба қисмати дуплекс, аз ҷумла A. Фрагмент А пас аз фаъолияти геликаза иваз карда шудааст.

A. B.

Расми 5.22: Санҷиш барои пайгирии чархбол дар як минтақаи танг.

Дар расми 5.22B натиҷаҳои таҳлили пайгирии чархбол бо номи PriA нишон дода шудааст. Он дар кадом самт ДНК-и якқаторро пайгирӣ мекунад?

Ҳафт вертолет аз он ҷудо карда шудааст E. coli. Функсияи фарқкунанда барои ҳамаи онҳо муайян карда нашудааст ва инчунин комилан возеҳ нест, ки кадомаш дар такрори такрорӣ амал мекунад. Спиртҳои асосӣ барои Е. coliЧунин ба назар мерасад, ки репликатсияи хромосомӣ PriA ва DnaB мебошанд, ки онҳо низ дар мошинсозӣ барои сохтани праймерҳо истифода мешаванд. Геликазаи иловагӣ, ки дар боби 7 баррасӣ мешавад, великазаи II ё UvrD мебошад, ки дар таъмири ДНК истифода мешавад.

Пас аз ҷудо шудани ду риштаи молекулаи ДНК волидайн, онҳо бояд аз навсозӣ пешгирӣ карда шаванд. Пӯшонидани ДНК-и як сутундор бо протеини ҳатмии як занҷираи ДНК (SSB) ин корро мекунад (Расми 5.21).SSB аз E. coli як homotetramer аст, ки маҷмӯи чор зербобҳои якхелаи мономерӣ мебошад. Воҳидҳои сафедаи мономерӣ 74 кДа мебошанд; онҳо аз ҷониби рамзгузорӣ шудаанд ссбген. Мутантҳо дар ссбсинтези ДНК -ро фавран қатъ кунед ва аз ин рӯ онҳо барои дароз кардан лозиманд. Чунин мутантҳои аз даст додани функсия дар таъмир ва рекомбинатсияи ДНК низ камбудӣ доранд. SSB якҷоя бо ДНК-и як занҷира пайваст мешавад ва дар ин шакл ДНК-и як занҷир наметавонад ба занҷири иловагии худ пайваст шавад. Протеини шабеҳе, ки дар эукариотҳо мавҷуд аст, Replication Factor A ё RFA мебошад. Ин гетеротример аст, яъне аз се зербобҳои гуногун иборат аст.

Пушидани риштаҳои ДНК бо вертолазҳо ба топологияи умумии ДНК таъсир мерасонад (Расми 5.23). Масалан, барои ҳар 10 ҷуфти асосӣ, ки кушода нашудаанд (DT = -1), агар тағир додани рақами пайванд тағир наёбад, ҷуброн дар гардиш зиёд мешавад (DW =+1). Тавре ки қаблан дар боби 2 муҳокима шуда будем, ферментҳое, ки метавонанд рақами пайвандро тағир диҳанд, топоизомеразҳо мебошанд. Ин ферментҳо ҳангоми реплика ҳамчун гардишкунанда амал мекунанд, то шиддати топологиро сабук кунанд. Дар E. coli, ин гардиш ферменти гираза мебошад (Ҷадвали 5.3, расми 5.23). Ин топоизомеразаи II энергияи АТФ-ро барои шикастани дукарата дар як молекулаи ДНК истифода мебарад, қисми дигари ДНК-ро аз танаффус мегузарад ва танаффусро дубора интиқол медиҳад. Самти гузариш чунин аст, ки гардиши манфии суперспиралӣ ҷорӣ карда мешавад ва ба ин васила ба тағирёбии мусбати W, ки ҳангоми кушодани ДНК ба амал меояд, муқобилат мекунад. Пайвастҳое, ки гиразаро бозмедоранд, ба монанди кислотаи наладиксикӣ ё кумаринҳо, инчунин синтези ДНК-ро бозмедоранд ва нақши муҳими гиразаро дар ин раванд нишон медиҳанд. Дар ҳуҷайраҳои ширхӯрон ё топоизомераза I ё топоизомераза II метавонанд ҳамчун гардиш истифода шаванд. Топоизомераза I дар ДНК-и олӣ як риштаи ягона месозад ва ба ин васила имкон медиҳад, ки суперкоилҳо истироҳат кунанд.

Расми 5.23. Тағирот дар топологияи ДНК ҳангоми такрор. Тағирёбии аз ATP вобаста (DT манфӣ), ки бо геликазаҳои ДНК катализ карда мешавад, боиси тағирёбии ҷуброни гардиш (DW мусбат) мегардад, ки он бо таъсири топоизомераза II, ба монанди ДНК гираза сабук мешавад. Гираза як аксуламали аз се марҳила вобаста ба ATP-ро катализ мекунад, ду риштаи ДНК-ро ҷудо мекунад, як қисми дигари дуплекси ДНК-ро тавассути танаффус мегузарад ва танаффусро дубора мӯҳр мекунад. Амали гираза як DW -и манфиро тавлид мекунад, то DW -и мусбатро аз амали геликаза мувозинат диҳад. X ва Y ду минтақаи гуногуни молекулаи ДНК-ро қайд мекунанд. Тири хокистарӣ самти ҳаракати дуплексро тавассути танаффус нишон медиҳад. Гираза тетрамер аст ва ҳамчун чор тӯби гулобӣ нишон дода шудааст.


AP Biology 6.2 - Репликатсия

Дар ин бахш, мо таваҷҷӯҳ хоҳем кард, ки чӣ тавр ДНК такрор мешавад – як раванди муҳим барои ҳаёт дар рӯи замин. Мо аз дидани назарияҳои мухталифи репликатсияи ДНК, ки пас аз фаҳмидани сохтори ДНК пешниҳод шуда буданд, оғоз мекунем: репликатсияи консервативӣ, репликатсияи нимконсервативӣ ва репликатсияи дисперсивӣ. Таҷрибаи Меселсон-Стахл ба таври машҳур муайян кард, ки такрори нимконсервативӣ назарияи дақиқтарин аст. Пас аз ин, мо ба раванди репликатсияи ДНК мегузарем. Мо бо ферментҳои геликаз ва топоизомераза оғоз мекунем, ки молекулаи дуқабата ДНК-ро мекушоянд. Пас аз викторинаи аввал, мо хоҳем дид, ки полимеразаи ДНК дар асл барои сохтани як занҷири нави ДНК аз риштаи шаблон чӣ кор мекунад. Ниҳоят, мо қадамҳои ниҳоии репликатсияи ДНК-ро мебинем, ки равандро ба итмом мерасонанд ва чӣ гуна репликатсияи ДНК ба транскрипсияи РНК хеле монанд аст.


Баромадкунандагон

  • Мӯҳлати бақайдгирӣ
  • 30 августи соли 2021
  • Мӯҳлати пешниҳоди реферат
  • 20 июли 2021
  • Иштирокчиёни интихобшуда аз ҷониби он огоҳ карда мешаванд
  • 20 августи 2021
  • Мӯҳлати пардохт
  • 10 сентябри 2021
  • СТУДЕНТ/ПОСТДОКС 75 евро
  • АКАДЕМИКИ 100 евро
  • САНОАТ 200 евро

Бақайдгирӣ дар бар мегирад:

Пардохт

Пардохт ба системаи 3D Secure пайваст карда мешавад ва онро тавассути корти кредитӣ, фактура ё интиқоли бонкӣ анҷом додан мумкин аст.

Меъёрҳои интихоб

Иштирокчиён аз рӯи асосҳои илмӣ, тавозуни гендерӣ ва тақсимоти ҷуғрофӣ (тақсимоти васеъ) интихоб карда мешаванд.

Дастурҳои абстрактӣ

Рефератҳо бояд ҳадди аксар аз 250 калима иборат бошанд, ба истиснои унвон, муаллифон ва мансубият.

Мушаххасоти плакат

Плакатҳо бояд ҳадди аксар 4 слайд бошанд. Барандагони плакатҳо флеш-суҳбати қаблан сабтшударо барои ҳадди аксар 3 дақиқа омода мекунанд.

Грантҳои сайёҳӣ

Ба ҷои грантҳои сафар, барои иштирокчиён як қатор имтиёзҳои пардохт дастрас хоҳанд буд. Довталабон лозим нест, ки барои озод кардани пардохт барои ин чорабинӣ алоҳида муроҷиат кунанд, аммо бояд дар варақаи бақайдгирӣ нишон диҳанд, ки агар онҳо мехоҳанд, ки барои озод кардани пардохт баррасӣ шаванд. Интихоби ҷоизадорон мустақиман аз ҷониби ташкилкунанда сурат мегирад, ки ҳамаи иштирокчиёни мувофиқро огоҳ мекунад. Маълумоти бештар дар саҳифаи EMBO Travel Grants дастрас аст.

Барои иштироккунандагони ҳар миллате, ки дар лабораторияҳои Чили, Ҳиндустон, Сингапур ва Тайван кор мекунанд, пардохти махсус вуҷуд дорад. Барои дархост кардан, лутфан мустақиман ба ташкилкунандагони вохӯрӣ дархости шуморо паёми электронӣ фиристед.

Гранти нигоҳубини кӯдак

Курсҳо ва семинарҳои EMBO грантҳоро барои ҷуброн кардани хароҷоти иловагии нигоҳубини кӯдак, ки аз ҷониби иштирокчиён ё баромадкунандагон ҳангоми иштирок дар ҳама гуна вохӯриҳои маблағгузории EMBO ва Семинар сар мезанад, пешниҳод мекунад. Хароҷоти қобили қабул ҳаққи хидматрасонӣ барои парастор ё муассисаи нигоҳубини кӯдак, хароҷоти роҳкиро барои парастор ё хароҷоти роҳкиро барои бурдани кӯдак ба вохӯрӣ ва ғайра дар бар мегирад. Лутфан дар варақаи бақайдгирӣ нишон диҳед, ки оё шумо мехоҳед барои гирифтани грант баррасӣ шавад. Лутфан инчунин тавзеҳ диҳед, ки чӣ тавр шумо гранти нигоҳубини кӯдакро истифода бурдан мехоҳед ва маблағи лозимаро муайян кунед.


Топологияи ДНК ҳангоми репликатсия - Биология

Ҷон Э. Ҳерст (а, б), Лу Кауфман (в), В. Мартин МакКлейн (в) ва Яоминг Ши (а)

(a) Департаменти химия, Донишгоҳи Калифорния, Беркли
(б) Шӯъбаи биологияи сохторӣ, Лабораторияи миллии Лоуренс Беркли
(в) Шӯъбаи математика, Донишгоҳи Иллинойс, Чикаго
(г) Шӯъбаи химия, Донишгоҳи давлатии Уэйн, Детройт

Реферат

I. Муқаддима

Ба таври умум мувофиқа карда шудааст, ки пас аз оғоз дар пайдоиши муайяни реплика, синтези ДНК дар ду "чангакҳои афзоянда", ки аз ҳамдигар дар контури ДНК фарқ мекунанд (1) дуҷониба сурат мегирад. Синтези пешбари ришта пайваста аст ва аз ҷониби полимеразаи ДНК иҷро карда мешавад ва мавқеи ақибмонда пайваста дар ҷараёни ҷалби примазаи РНК, ҳадди ақал як полимеразаи иловагии ДНК (а) ва шояд бештар аз он, RNase H, ки праймерҳои РНК -ро паст мекунад, ва лигазаи ДНК, ки қисмҳои кӯтоҳи (2000 bp) ДНК -и пайваста синтезшударо бофтаанд. Комплексҳои полимеразӣ дар паҳн кардани дуплекси ДНК бо кӯмаки як геликаза, ки дуплекси ДНК -ро мекушояд ва тавассути "қулфҳои лағжанда", ки коркарднокии ҳар як раванди полимеризатсияи ДНК -ро афзоиш медиҳад (2). Вақте ки дуплекси аслии ДНК ба "шахри афзоянда" ворид мешавад, ки дар он ДНК кушода мешавад, ҳар як риштаи ягона аз ҷониби комплекси полимераз такрор карда мешавад. Дар ин дастнавис, ҳар як чунин маҷмӯи полимеразҳо, аз ҷумла великаза, қулфҳои ғалтак ва ДНК -и гирифташуда, ба воситаи фардои репликатсия номида мешавад ва ин гуна чангакҳо асоси андешаҳои топологии мо дар бораи репликатсияи ДНК мебошанд.

Далели дуввуми собитшуда мавҷудияти пайдоиши такрории сершумор дар хромосомаи эукариотӣ мебошад (1). Дар ҳар як пайдоиш, ду порчаи такрорӣ (ба муқобил нигаронидашуда, тавре ки дар расми 1А нишон дода шудааст) дар макони муайяни оғози репликатсия тавлид мешаванд, ки бовар меравад, ки бо пайвасти "комплекси ҳатмии ибтидоӣ", ORC муайян карда мешавад. Ҳангоми нусхабардорӣ, ду фард дар контури ДНК аз ҳамдигар дур шуда, ду дуплекси нав ба вуҷуд омадаи ДНК -ро ба вуҷуд меоранд.

Дар ин кор, мо ҳеҷ гуна тахмине дар бораи сохтори муфассал ё пайванди ҷузъҳои сафеда надорем, ки фокусҳои репликатсияро муайян мекунанд ё ягон сохтори мушаххасе, ки берун аз фарзияи беайбии топологии риштаҳои қолаби ДНК, ки аз ибтидо Дуплекси ДНК пеш аз нусхабардорӣ. Масъалаҳои топологияи ДНК, ки ба такрори дигарон алоқаманданд, баррасии хеле арзишманд вуҷуд дошт. (3) Аксар вақт масъалаҳое, ки ҳал карда шудаанд, ба дараҷаи фавқулодаӣ ё шиддати чархиш, ки тавассути раванди репликатсия ба вуҷуд омадааст, ҳам дар дуплекси қолаби волидайн байни вилкаҳои репликатсияи конвергатсияшуда, ки аз пайдоиши ҳамшафати репликатсия оғоз ёфтаанд ва дар минтақаҳои дуплекси дуплекс алоқаманданд. , ки инчунин ба тафсилоти модели маҳаллӣ вобастаанд. Мо дар ин ҷо ба масъалаи печидагии дуплексии навбаромада, ки метавонад ё бо гардиши фаъоли вилка дар ҳар 10 ҷуфти пойгоҳ ба вуҷуд ояд, ки бо гардиши фаъоли ҳарду чангакҳои репликатсияи ҷудошаванда ҳангоми паҳншавӣ (3) ё бо гардиши нисбии ҷудошавӣ алоқаманд аст. ҷуфтҳои репликатсия, танҳо аз диффузия. Дар расми 1 мисоли графикӣ оварда шудааст, ки чӣ тавр гардиши мустақили нисбии фардҳои такрории такрорӣ ба печутоби ДНК -и дуплексии навбунёд оварда мерасонад. Аҳамият диҳед, ки масъалаи печидан аз масъалаи суперхеликии ДНК ё шиддати чархиш, ё дар дуплекси қолаби волидайн ё дар дуплексҳои духтари навзод (аз нав синтезшуда) фарқ мекунад.

Барои пешгирӣ кардани печи эҳтимолии дуплексҳои навзод байни фардҳои такроршаванда, мо фарзия мекунем, ки чангакҳо аз ҷиҳати ҷисмонӣ пайвастанд ва аз ин рӯ нисбат ба якдигар гардиш карда наметавонанд. Агар репликатсия бо сабаби фардҳои мустақили димерӣ бошад, ҳангоми репликатсия ногузирии ду дуплекси ДНК-и нав ба вуҷуд меояд ва сегрегатсия механизми махсуси новобаста аз худи раванди репликатсияро талаб мекунад, то бандҳоро бартараф кунад. Омехтаи элементарии имконпазир дар расми 1 тасвир шудааст.

Расми 1. Ҳодисаи соддаи печиши рагҳо. $A) Фарқҳои репликатсияи ҳамшафат бидуни печидан. $ B) Шохаҳои такрории ҷудошаванда бо як гардиши пурра нисбат ба якдигар паҳн шуда, боиси печутоби оддӣ мегарданд. (C) Дар митоз дуплексҳои ба ҳам печидаи духтари ДНК бидуни гузариш ҷудо шуда наметавонанд.

Рақам мультфильмест, ки дар он сохтори байзавии кабуд он қисми сафедаҳои репликатсияро ифода мекунад, ки бо риштаи пешбар ҳамкорӣ мекунанд. Баръакси ин, сохтори сурхи даврашакл барои ифода кардани он қисми сафедаҳои репликатсияи мушакҳо, ки бо риштаи ақибмондаи чангак ҳамкорӣ мекунанд, пешбинӣ шудааст. Пайвастагии ҷисмонии байни ин ду гурӯҳи сафедаҳои фардӣ метавонад комилан тавассути ДНК бошад ё метавонад таъсири мутақобилаи сафеда-протеинро дар байни ду синфи сафедаҳо дар решаи такрорӣ дар бар гирад. Масъалаи "гардиши чангакҳо" ва аз ин рӯ "печутоби дуплексии пайдошуда" новобаста аз сохтори чангакҳои маҳаллӣ аст, аммо комилан аз фарзияи нигоҳ доштани беайбии топологии риштаҳои қолаби волидайн ҳангоми такрор вобаста аст. Топоизомеразаи дараҷаи I ё дар дуплекси волидайн дар дуплексҳои духтари навзод амал мекунад, беайбии топологиро, ки мо дар борааш мегӯем, тағйир намедиҳад. Аз тарафи дигар, метавонад як эътирофи сохтори маҳаллӣ вуҷуд дошта бошад (4), ки бо фаъолияти топоизомеразаи дараҷаи II алоқаманд аст, ки метавонад печутоби марбут ба гардиши фаъоли чангакҳои такрорӣ ҳангоми паҳншавии чангакҳоро сабук кунад. Мо намунаи худро ба манфиати содда ва ҳамчун намуна пешкаш мекунем. Механизми мураккабтареро метавон тасаввур кард ва пешниҳод карда шуд, ки дар он механизми ҷудошавӣ фарзияи беайбии топологии риштаҳои волидайнро вайрон мекунад.

Идеяи пайвастани ҷисмонии фардҳои афзоянда ба ин муаллифон аслан нест. Дар як мақолаи классикӣ, Сундин ва Варшавски (5) чунин изҳорот медиҳанд: "Агар дар вақти такрорӣ, ду чангакҳои афзоянда нисбат ба ҳамдигар гардиш мекарданд, печиши риштаҳои хроматини духтар ба амал омада метавонанд. Барои пешгирӣ кардани ин мушкилот, мо пешниҳод мекунем, ки ҳарду фардҳои такрорӣ бо ҳам пайванданд ва ба таври беназир ба як маҷмӯи бинарӣ нигаронида шудаанд ". Илова бар ин, Wessel, Schweizer ва Stahl (6) далелҳои таҷрибавӣ барои чунин замима дар такрори дуҷонибаи SV40ро гузориш доданд. Ин асар дурустии чунин фарзияро исбот карда наметавонад. Он чизе ки мо дар ин ҷо мекунем, оқибатҳои механизми таҳияи чунин фарзия аст. Дар ҳама ҳуҷайраҳои зинда фаъолиятҳои ферментативии хуб ба роҳ мондашуда мавҷуданд, ки дар шароити мувофиқ метавонанд як дуплекси ДНК -ро аз дигараш гузаронанд (фаъолиятҳои топоизомеразаи Синфи II) (7). Аммо дар гиреҳи мураккабе, ки ба ҳаҷми хурд локализатсия нашудааст, фазое вуҷуд дорад, ки ферменти амалкунанда барои шинохти сохтор замина дошта бошад, гузариши тасодуфии як ришта аз риштаи дигар ҳамон тавре, ки гиреҳро кам мекунад (8) . Ҷудо кардан дониши глобалии топологияи гиреҳро талаб мекунад, аммо системаҳои ферментҳо бояд дар доираи ҳаҷми хеле маҳаллӣ, ки бо доираи кӯтоҳи қувваҳои байнимолекулавӣ маҳдуданд, ҳис кунанд ва амал кунанд. Ҳалли ин мушкили парокандагии Гордиан пешниҳод шудааст (4), ки дар он фермент ба ду макони алоҳидаи пайвандшаванда дар ДНК -и дуплекс пайгирӣ карда метавонад (дар баробари контур муҳоҷират кунад), катенатсияҳоро ба сохтори шинохташавандаи маҳаллӣ шинонад. Чунин механизм ба осонӣ ба ДНК-ҳои даврӣ татбиқ карда мешавад. Онро метавон дар байни шохаҳои ҷудошавандаи афзоянда татбиқ кард, аммо боз ҳам шаффофтар, агар онҳо ба таври ҷисмонӣ ба ҳам пайваст бошанд, ҳадди аққал дар охири муҳоҷирати чангак. Мо бори дигар таъкид мекунем, ки кори мо барои муайян кардани кадоме аз якчанд алтернативаҳо дуруст нест. Он ният дорад, ки оқибатҳои топологии гипотезаи афзояндаи фардро нишон диҳад.

Модели пайвастаи ғалладонагиҳои афзоянда худро ҳамчун як намуди символизми молекулавӣ муаррифӣ мекунад, ки ба он як ҳисобро оператори математикӣ, ба истилоҳ "ламбда" (9) татбиқ кардан мумкин аст. Мо ба ин тарзи тафаккури нав симбиологӣ ном медиҳем. Мафҳумҳои асосии ҳисобҳои ламбда аллакай дар забонҳои пешрафтаи компютерӣ таҷассум ёфтаанд ва ин як алгоритми мушаххасро илҳом бахшидааст, ки сенарияи муфассали рамзӣ барои такрори тетрамерии ҳар як хромосомаи рамзии додашударо тавлид мекунад. Дар айни замон, мо сенарияи рамзиро ҳамчун маълумот барои филми оддии таҷдиди хромосомаҳо истифода мебарем. Филм таъсири эҳтимолии модели репликатсияи пайвастшударо нишон медиҳад, яъне конденсатсияи хаттии хромосома ҳангоми репликатсия. Дар оянда ба чунин ҳисобҳои симбиологӣ ва тасвирҳои визуалии онҳо хосиятҳои муфассали ДНК (таркиб, чандирӣ, гистон ва дигар замимаҳо ва топология) дохил кардан мумкин аст.

II. Репликатсияи хромосомаҳо тавассути механизми афзояндаи фард

Расми 2. Нусхабардории ғалладонагиҳои дуҷониба. $A) Дуплекси ДНК бо комплекси репликатсияи нопурра. (B) Анҷоми маҷмӯа, аз ҷумла расидани сигнали оғозёбӣ ду фардҳои дохилии пушти ба пуштро тавлид мекунад, ки нисбат ба ҳамдигар қодир нестанд гардиш кунанд. (C) Марҳилаи минбаъдаи репликатсия бо ду ҳалқаи навбунёди ДНК дуплексӣ аз паҳлӯҳои муқобили комплекси репликатсия хориҷ мешаванд.

Ҷои пайдоиш ё мавқеи пайвастшавии ORC қисми якуми ДНК мебошад, ки репликатсия ва экструдсия карда мешавад. Пешниҳод шудааст, ки минтақаҳои пайдоиши нав синтезшуда аз оғози такрори такрорӣ дар як макон бори дуюм дар давраи ҳуҷайра пешгирӣ карда мешаванд, зеро сигнали дигар барои оғозёбӣ рух намедиҳад. Доираҳои пайдошуда аз ҳамон як маҷмааи такрорӣ ва ё аз комплексҳои чангакҳои ҳамсоя метавонанд ба қадри кофӣ дароз шаванд, то ҳатто пас аз дубора хроматин ришта шудан, аммо то он даме, ки ҷуфтҳо гардиши нисбии дохилиро эҳсос накунанд, печида шудан мумкин нест. Ин имкон медиҳад, ки сегрегатсияи бефосила.

Дар геномҳои эукариотӣ хромосомаҳои хатӣ мавҷуданд, ки пайдоиши репликатсия дар масофаи тақрибан 100 ҷуфт килобаза ҷойгиранд (1), ки ҳар як минтақаи ҷуфти 100 килобаза ҳамчун репликон номида мешавад. Ҳангоми S-марҳила, ин пайдоиши мухталифи хаттии алоқаманд бо такрорӣ дар вақти барномарезишудаи ҳамзамон ва дар фармоишҳои барномарезишуда аз рӯи сигналҳои мушаххас оғоз меёбад.

Расми 3 муаррифии такрори як хромосомаи хеле хурд аст. Он дар ҳолати васеъ бо dimers пайдоиши дар ҷои оғоз (расми 3A). Дар расми 3B, комплексҳои репликатсияи чангалҳо ба вуҷуд меоянд ва ҷуфтҳои фардии ДНК ногузир ба пушт ба вуҷуд меоянд. Вақте ки репликатсия дар расми 3C ва расми 3D идома дорад, ҳалқаҳои навзод калон мешаванд ва бахшҳои дуплексии волидайн байни комплексҳои конвергентии репликатсия кам мешаванд, то он даме ки боқимонда як қатори васеъи комплексҳои репликатсионӣ боқӣ мемонад (расми 3E), ҳар кадоме бо ду ҳалқаи дароз, вале гиреҳнашудаи ДНК-и навзод ба паҳлӯҳои онҳо пайваст карда шудаанд. Камшавии дарозии дар ин расм дидашуда воқеӣ аст ва метавонад ба конденсатсияи хромосомаҳо пеш аз митоз мусоидат кунад. Маълум аст, ки омили дигар барои конденсатсияи хромосома ҳам аз таҷриба ва ҳам аз он сабаб аст, ки хроматидҳои хромосомаҳои метафаза нисбат ба дарозии хаттии ҳалқаҳои аз нав такроршавандаи ДНК хурдтар буда, нишон медиҳанд, ки дигар механизмҳои конденсация бояд дар ниҳоят муҳим бошанд ташаккули хромосомаи метафаза.

Дар чаҳорчӯбаи ниҳоӣ, комплексҳои репликатсионӣ дар акси қадами ташаккули худ дубора тақсим мешаванд ва нисфи таркиби сафеда ба ҳар як риштаи дукарата таъин карда мешаванд. Дар ин лаҳза митоз метавонад оғоз шавад, ки табиатан аз ҳама гуна печидаҳо озод аст.

Тафсилоти конфигуратсияи комилан бархӯрд дар расми 3E ба муҳокима ниёз дорад. Дарозии хурди ДНК дар иртиботи мустақим бо маҷмӯаҳои чангакҳои бархӯрда ҳангоми такрори бархӯрд дубора ба анҷом нарасидааст ва он бояд бо механизми махсуси такрории хоси ин сохторҳои бархӯрд анҷом дода шавад. Ин "бозии ниҳоӣ" дар нусхабардории ДНК бо истифода аз SV40 ҳамчун модел ба таври муфассал омӯхта шудааст ва агар бетартиб гузошта нашавад, он барои пешгирии печутоби муассир аст (5). Гуфта мешавад, ки ин раванд фаъолияти топоизомеразаи дараҷаи II -ро талаб мекунад.

Расми 3. Пайвастани репликатсияи фардии афзояндаи хромосома бо митозҳои беайб. (A) монтажи мураккаб, (B) форкинг, (C, D) такрор, (E) бархӯрд, (F) митоз.

Пас аз митоз бояд тамдиди хромосома ба амал ояд, то иттилооти он дар марҳилаи G1 дастрас карда шавад. Эҳтимол аст, ки комплексҳои такрорӣ аз ДНК ҷудо шаванд ва ба он имкон диҳанд, ки бо ҳаҷми дар ядрои ҳуҷайра ишғолшуда тавассути диффузия васеъ шавад. Пас аз он комплексҳои нав барои дубора ҷамъоварӣ кардани комплексҳои шинохти пайдоиш, ORC (10) равона карда мешаванд. Ҳамчун алтернатива, дар филм мо тамдиди хромосомаҳоро нишон медиҳем, ки бо бозгашти баъзе ҷузъҳои сафедаҳои репликатсияи ҳоло ҷудошуда дар ДНК алоқаманданд ва тавассути контури ДНК дар раванде, ки роҳи онҳоро ҳангоми такрор тағир медиҳад, муҳоҷират мекунанд , то он даме ки онҳо пайдоиши такрор ё ORC -ро, ки онҳоро муайян мекунанд, пайдо кунанд. Саволҳо дар бораи марҳилаи васеъшавӣ нишон медиҳанд, ки ба корҳои таҷрибавии бештар лозим аст, ки қоидаҳои ҷуфткунии зербахши полимеразҳои ДНК ва макони воқеии маконҳои пайдоишро муайян кунанд, аммо ҳеҷ кадоме аз инҳо ягон принсипи мушкилоти Гордианро дар бар намегирад.


Натиҷаҳо

Ҳадафи асосии мо ин ҷилавгирӣ аз Topo IV бидуни таъсир ба гиразаи ДНК буд. Аз ин сабаб, мо аввал интихоб кардем E. coli Ҳуҷайраҳои DH5 & # x003b1F & # x02032, вақте ки онҳо мутатсияро доранд gyrA96 ки ин ҳуҷайраҳоро ба ҳосилаҳои кислотаи налидиксиӣ муқовимат мекунад (25, 44). Дар ҳақиқат, ҳуҷайраҳои ин штамм, ки ба норфлоксацин дучор шудаанд, қаблан барои ҷамъ кардани катенҳо бидуни таъсир ба гиразаи ДНК бомуваффақият истифода мешуданд (17, 45). Илова бар ин, ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ RecA − мебошанд, ки аз ташаккули мултимерҳо пешгирӣ мекунанд (46, 47). Бароҳатии истифодаи штамми RecA − дар расми 4 равшан нишон дода шудааст. А.. pBR-terE@AatII барои табдил додани ҳуҷайраҳои W3110, ки RecA + мебошанд, истифода шудааст. Муайянкунии якҷояи шаклҳои такрорнашуда ва қисман такроршудаи мономерҳо ва мултимерҳо, яъне димерҳо, тримерҳо ва ғайра муайян кардани сигналҳои шавқоварро душвор месозад. Бо вуҷуди ин, мо дарёфтем, ки молекулаҳои дорои чангакҳои қатъшуда дар ҳузури норфлоксацин шикаста мешаванд (расми 4). Б.). Сигналҳое, ки ҳамчун 𠇋roken RIs” ишора шудаанд, нишон медиҳанд, ки RI-ҳо дар винтҳо шикастаанд (48, 49). Аз ин сабаб, барои ҷилавгирӣ аз Topo IV бидуни таъсир ба гиразаи ДНК мо ба ҳуҷайраҳои parE10 гузаштем, ки мутацияи Topo IV ts доранд (25, 26, 44). Барои санҷидани он, ки оё топологияи плазмидҳои бактериявӣ дар ҳуҷайраҳои DH5 дар сурати мавҷуд набудани норфлоксацин дар муқоиса бо штаммҳои навъи ваҳшӣ ягон гуна таъсир расонидааст, мо зичии суперкилингро (& # x003c3) шаклҳои такрорнашавандаи pBR-ро муайян кардем.terE@AatII аз ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ ҷудо карда шудааст, ки RecA −, Topo IV + ва гирА96 ё ҳуҷайраҳои W3110, ки RecA +, Topo IV + ва Gyr + мебошанд. Натиҷаҳои бадастомада дар расми 5 нишон дода шудаанд. Дар ҳарду ҳолат & # x003c3 & # x022120.065 (модал & # x00394) будЛк = �). Аз ин рӯ, дар таҷрибаҳои минбаъда, барои муайян кардани шиддати гардишии RI дар ҳузур ва набудани Topo IV, мо тасмим гирифтем ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ ва ҳуҷайраҳои parE10ро, ки дар як соати охир ба ҳарорати маҳдудкунанда дучор мешаванд, истифода барем.

Иммунограммаҳои шаклҳои солимии pBR-terE@AatII аз ҳарду ҷудо карда шудааст E. coli Ҳуҷайраҳои W3110 ё DH5 㬟 ′ (ба норфлоксацин дучор мешаванд) бо электрофорези дуҷонибаи агарозаи гел таҳлил карда мешаванд. A, Ҳуҷайраҳои W3110 RecA +, Topo IV + ва Gyr + мебошанд (44). Б, Ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ RecA − ва TopoIV + мебошанд ва ба зимма доранд gyrA96 мутация, ки ин ҳуҷайраҳоро ба ҳосилаҳои кислотаи налидиксиӣ муқовимат мекунад. DH5 㬟 ′ то он даме ки фарҳанг ба афзоиши логарифмӣ расид ва дар тӯли 15 дақиқаи охир ба 15 μ м норфлоксацин дучор шуданд, парвариш карда шуданд. Ба дуруст ҳар як иммунограмма диаграммаи тафсирии хусусиятҳои аз ҳама мувофиқ мебошад, ки дар он CCC ва OCҳои такрорӣ тасвир нашудаанд сиёҳ. CCRIs дар тасвир шудаанд сурх. Рақамҳо ба мономерҳо (1) ва мултимерҳо ишора мекунанд: димерҳо (2), тримерҳо (3) ва ғайра. РИ шикаста нишон дода шудаанд (48, 49).

Шаклҳои такрории pBR-терЕ@AatII аз DH5 & # x003b1F & # x02032 ё W3110 ҷудо карда шудааст E. coli ҳуҷайраҳое, ки бо электрофорези агарозаи дуҷониба таҳлил карда мешаванд. Иммунограммаҳои намояндагии гелҳои андозаӣ нишон медиҳанд, ки ченакҳои якум ва дуввум дар ҳузури консентратсияҳои гуногуни хлорокин барои ҳалли ҳама популясияи топоизомерҳо ба амал омадаанд. Андозаи аввал дар ҳузури 1 μg/ml ва андозаи дуввум дар ҳузури 2 μg/ml хлорокин буд. Топоизомери аз ҳама фаровон бо a нишон дода шудааст тирчаи кабуд. Дар ҳарду ҳолат, зичии supercoiling 𢄠.065 (modal Δ) будЛк = �).

Мо ҳарду штаммҳои ҳуҷайраро бо плазмидҳои бактериявии pBR- табдил додем.terE@StyI, pBR-terE@AatII ва pBR-terE@DraI, ҳуҷайраҳоро то он даме ки онҳо ба афзоиши логарифмӣ расанд, парвариш карданд ва ДНК -ро аз ҳарду ҷудо карданд E. coli Ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ (ки Topo IV фаъол аст) ё ҳуҷайраҳои parE10 дар давоми 1 соати охир дар ҳарорати маҳдудкунанда парвариш карда мешаванд (ки дар он Topo IV ғайрифаъол аст). Барои тафтиши RI-ҳои солими се плазмида, ҳалли баланди электрофорези дуҷонибаи агарозаи гел ва гибридизатсияи ДНК бо пробҳои мувофиқ истифода шуданд.

Натичахои ба даст овардашуда дар расми 6 нишон дода шудаанд. Ҳама иммунограммаҳо бо назардошти ҳаракати OCҳо мувофиқ карда шудаанд. Аҳамият диҳед, ки интеркалатсияи хлорохин ба ҳаракатнокии электрофоретикии молекулаҳои такрорнашавандаи никинг таъсир намерасонад (29, 37, 50).

Иммунограммаҳои шаклҳои солимии се плазмид, ки аз DH5 ё parE10 ҷудо карда шудаанд E. coli ҳуҷайраҳое, ки бо электрофорези агарозаи дуҷониба таҳлил карда мешаванд. Гелҳои дученакае, ки андозаи дуюм дар ҳузури 5 μg/ml хлорохин ба вуҷуд омадааст, дар боло. Ба дуруст ҳар як иммунограмма диаграммаи тафсирии хусусиятҳои аз ҳама мувофиқ мебошад, ки дар он CCRI -ҳо тасвир шудаанд сурх. Дар куҷое ки татбиқ мешавад, CatAs (дар кабуди сабук), CatBs (дар кабуди торик) ва CatCs (дар сабз) низ нишон дода шудаанд. Ҳама иммунограммаҳо мувофиқи ҳаракати электрофорезии мономерҳои никӣ (OCs) ва миёнаравҳои репликатсияи никӣ (OCRI), ки аз хлорохин таъсир намерасонанд, мувофиқ карда шуданд. Тирҳои кабуд ба топоизомери фаровонтарини шаклҳои такрорнашаванда ишора мекунад ва тирҳои сурх дар ҳама ҳолатҳо ба фаровонтарин CCRI ишора кунед.

Ҳаракати электрофоретикии шаклҳои такрорнашудаи ҳар се плазмидҳои аз ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′, ки бидуни хлорокин таҳлил карда шудаанд, ҳамон чизест, ки барои молекулаҳои тақрибан аз ҷиҳати омма ва шакл якхела буд: 4385 bp барои pBR-terE@StyI 4449 bp барои pBR-терЕ@AatII ва 4433 bp барои pBR-terE@DraI (сутуни чап дар расми 6). Ягона фарқи муҳим дар байни pBR-terE@StyI, pBR-terE@AatII ва pBR-terE@DraI макони ҷойгиршавӣ аст терЕ (Расми 3). Аз ин сабаб, ҳаракатнокии электрофорезии RIs (OCRIs) барои се плазмидҳо фарқ мекард, зеро массаи онҳо барои pBR- 5525 bp буд.terE@StyI, 7118 bp барои pBR-terE@AatII ва 7979 bp барои pBR-терЕ@DraI, мутаносибан. Дар хотир доред, ки CCRIs, ки дар сурх дар диаграммаҳои тафсирӣ ҳамчун як чанд топоизомерҳои дорои ҳаракати электрофоретикӣ дар андозагирии дуввуми наздик ба ҳаракати CCCҳои такрорнашаванда барои pBR- пайдо шудаандterE@StyI. Барои pBR-терЕ@AatII, CCRIs ҳамчун камон аз як қатор топоизомерҳо ба вуҷуд омадаанд, ки аз як нуқтаи дорои ҳаракати электрофоретикӣ дар ченаки дуввум, каме баландтар аз OCҳои такрорнашуда то OCRIs ба вуҷуд омадаанд. Ниҳоят, барои pBR-терЕ@DraI, CCRIs инчунин ҳамчун камон аз як қатор топоизомерҳо ба вуҷуд омадаанд, ки аз як нуқтаи дорои ҳаракати электрофоретикӣ дар давоми ченаки дуввум, каме пасттар аз OCҳои такрорнашуда то OCRIs пайдо шудаанд. Дар ин ҳолат, аммо, камонҳои топоизомерҳои RI тамоюлро барои охирин молекулаҳои сусти гардишшуда нишон доданд.

Ҳаракатнокии электрофорезии шаклҳои такрорнашавандаи ҳар се плазмиди аз ҳуҷайраҳои parE10 ҷудошуда, ки бе хлорохин таҳлил карда шудаанд, дар муқоиса бо ДНК-и аз ҳуҷайраҳои DH5 ҷудошуда ҳеҷ фарқияте нишон намедиҳад. Бо вуҷуди ин, дар ин иммунограммаҳо, катенҳои пурра такроршуда (CatAs, CatBs ва CatCs) ба таври равшан намоён буданд (дар паҳлӯи сутуни рост дар расми 6). Тавре ки қаблан гуфта шуд, дар сурати набудани Topo IV, �% плазмидҳо аз terE-Бастани репликатсияи Тус ва такрори пурра, аммо дуплексҳои хоҳар аз ҳам ҷудо намешаванд ва катенанҳо ҷамъ мешаванд (17, 29). Дар муқоиса бо иммунограммаҳои ДНК, ки аз ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ ҷудо карда шудаанд, дар CCRIҳои аз ҳуҷайраҳои parE10 ҷудошуда дар ҳолати pBR-терЕ@StyI ва pBR-terE@DraI. Аммо, намунаи камон ба CCRIs мувофиқ аст (дар тасвир шудааст сурх дар диаграммаи тафсирӣ) барои pBR-терЕ@AatII ба таври назаррас фарқ мекард. Гарчанде ки дар ҳарду ҳолат аксарияти топоизомерҳои RI зудтарин ҳаракати электрофоретикии намоёнро нишон доданд, танҳо якчанд топоизомерҳое, ки дар тӯли андозагирии дуввум ҳаракатҳои камтарини электрофоретикиро нишон медиҳанд, барои RI -ҳои аз ҳуҷайраҳои parE10 ҷудо кардашуда ошкор карда мешаванд. Баръакс, дар мавриди ДНК, ки аз ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ ҷудо карда шудааст, камони CCRIs қариб ба анҷом расидааст. Ин мушоҳида сахт пешниҳод кард, ки ҳадди ақал барои pBR-terE@AatII, CCRI-ҳои аз ҳуҷайраҳои parE10 ҷудошуда (дар он ҷо Topo IV ғайрифаъол аст) нисбат ба ҳуҷайраҳои DH5 & # x02032 ҷудошуда (дар он ҷо Topo IV фаъол аст) шиддатноктар буданд.

Дар кӯшиши муқоиса кардани шиддати гардиши ин RI-ҳои аз штаммҳои гуногуни ҳуҷайра ҷудошуда ба таври дигар, 5 μg/ml хлорохин танҳо дар давоми андозаи дуюми системаи гелии дученака илова карда шуд. Хлорокин як молекулаи планарист, ки байни ду риштаи спирали дугонаи ДНК intercalates аст. Ин интеркализатсия печутоби ДНК -ро тағйир медиҳад. Азбаски плазмидҳои бактериявӣ (& # x02212) - суперкирдор мебошанд, хлорохин аввал (& # x02212) - supercoiling -ро нест мекунад ва танҳо пас аз нест кардани ҳама суперкирлҳои модарӣ (& # x02212) - суперкоилинги холис (+) -ро илова мекунад (37, 51). Гузашта аз ин, борҳо нишон дода шудааст, ки дар молекулаҳои қисман такроршаванда, ки дорои ғалладонагиҳои сетарафа мебошанд, аз байн рафтани минтақаи такрорнашуда ба самти чорҷониба ба пайвандҳои чортарафа номида мешавад, ки онҳоро фардҳои баръакс ё пойҳои мурғ меноманд (37, 50, �). Молекулаҳо бо ин пайвандҳои чорҷониба, ки дарозии чорумашон дарозӣ фарқ мекунад (+) нестанд-суперпеч карда шудаанд ва ҳамон ҳаракатнокии электрофоретикиро ҳамчун RI-ҳои шикаста нишон медиҳанд.

Тавре ки қаблан зикр гардид, интизор меравад, ки танҳо интеркалатсияи хлорохин дар минтақаи такрорнашавандаи RIs ба топологияи ДНК таъсир расонад. Аз ин сабаб, он ба pBR таъсири амиқ хоҳад дошттерЕ@StyI, аммо на дар pBR-terE@DraI (29, 37). Мо 5 μg/ml хлорохинро интихоб кардем, зеро медонистем, ки барои pBR322 бо ΔЛк = 0, ин консентратсия � (+)-supercoils -ро муаррифӣ мекунад. 4 Дар ҳақиқат, натиҷаҳои бадастомада интизориҳои моро тасдиқ карданд. Барои се плазмидҳо, ки аз ҳуҷайраҳои DH5 㬟 ′ ҷудо карда шудаанд, таъсири интеркализатсияи хлорокин ба молекулаҳои такрорнашуда яксон буд (дар паҳлӯи сутуни чап дар расми 6). The effect on the shape of the arc corresponding to partially replicated molecules, however, differed for the three plasmids. For pBR-terE@StyI, the electrophoretic mobility of CCRIs during the second dimension in the presence of 5 μg/ml chloroquine changed in a way similar to the change observed for unreplicated CCCs. Taking into account that CCRIs cannot re-gain mobility after the removal of all their native (−)-supercoiling (37, 50), we may conclude that in the presence of 5 μg/ml chloroquine the modal topoisomer for pBR-terE@StyI CCRIs was close to 0 (indicated by the corresponding тирчаи сурх in Fig. 6 ). For pBR-terE@AatII, the arc of CCRIs changed its shape dramatically. It described a smooth arc without chloroquine. This arc, though, turned into an acute angle in the presence of chloroquine during the second dimension. In this case the modal topoisomer was 𢄣 (indicated by the corresponding тирчаи сурх in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was subtle. If we compare these results with those obtained for the same three plasmids isolated from parE10 cells, the differences were obvious (see the сутуни рост on Fig. 6 ). pBR-terE@StyI CCRIs were not fully relaxed, and the majority of the molecules still showed an electrophoretic mobility higher than their corresponding OCRIs. The modal topoisomer in this case was 𢄤 (indicated by the corresponding тирчаи сурх in Fig. 6 ). This means that for pBR-terE@StyI CCRIs isolated from parE10 cells, exposure to 5 μg/ml chloroquine during the second dimension was not enough to remove all the torsional tension. For pBR-terE@AatII, the shape of the arc of CCRIs was not as abrupt as in the case of the molecules isolated from DH5㬟′ cells. Indeed, here most of the CCRIs were still torsionally tensioned and the modal topoisomer was � still showing an electrophoretic mobility significantly higher than their corresponding OCRIs (indicated by the corresponding тирчаи сурх in Fig. 6 ). For pBR-terE@DraI, however, the change in the shape of the arc was once again only subtle (the modal topoisomer was � for DH5㬟′ рӯ ба рӯи � for parE10). Altogether, these observations indicated that 5 μg/ml chloroquine added during the second dimension affected the mobility of CCRIs differently. The results obtained confirmed that CCRIs isolated from parE10 cells were more torsionally tensioned than those isolated from DH5㬟′ cells. The effect of chloroquine was notable for pBR-terE@StyI, less apparent for pBR-terE@AatII, and almost negligible for pBR-terE@DraI. Unreplicated plasmids isolated from cells where Topo IV is inactive are slightly more (−)-supercoiled than those isolated from cells where Topo IV is active (44, 54). As mentioned previously, here we used the RecA − DH5㬟′ cells to avoid the formation of multimers due to recombination.

It was recently shown that torsional tension reduces the probability for Topo IV to create replication knots (29, 55,�). In contrast, it is well known that the level of DNA knotting is proportional to molecular mass (40, 59). To further confirm the results obtained so far, we decided to measure DNA knotting in the replicated region of the RIs isolated from DH5㬟′ and parE10 cells. We anticipated that the number and complexity of replication knots would be higher for pBR-terE@DraI and lower for pBR-terE@StyI. To facilitate the quantitation of replication knots, we digested the RIs of the three plasmids with AlwNI. This restriction enzyme cuts the plasmids only once at the unreplicated region (see Fig. 3 ). The resulting digested molecules consisted of linear DNAs containing an internal bubble. These molecules were analyzed in two-dimensional gels allowing the identification of unknotted and knotted forms after hybridization with proper probes. Finally, the signals corresponding to unknotted рӯ ба рӯи knotted molecules were quantitated by densitometry (29, 43). The results obtained confirmed our expectations ( Fig. 7 ). For both cell strains (DH5㬟′ and parE10) the percentage of knotted bubbles increased with the size of the bubble (40). This observation suggests that torsional tension was higher for those CCRIs isolated from parE10 cells (29, 55,�).

Comparison of knotted and unknotted RIs of the three plasmids isolated from either DH5㬟′ or parE10 E. coli cells analyzed by two-dimensional agarose gel electrophoresis. DNA was isolated, digested with AlwNI, and analyzed in two-dimensional gels. The area of the immunogram where unknotted and knotted RIs migrated was scanned and analyzed by densitometry. In each case, immunograms are shown to the чап, diagrammatic interpretations are in the миёна, and densitometric profiles are to the дуруст. Дар рақамҳо дар top right corner of each profile indicate the ratio of knotted/unknotted molecules. Note that for both cell types, this ratio was higher for pBR-terE@DraI. For each plasmid, however, the ratio was always higher for the RIs isolated from DH5㬟′ cells.


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE UN-REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The situation becomes even more complicated during replication. The cartoons in Figure 2 illustrate the changes in topological sign and chirality that occur as replication progresses in a circular covalently-closed (CCC) molecule in vivo. In bacteria, un-replicated circular molecules are maintained negatively supercoiled by the combined action of DNA gyrase introducing (-) RH supercoils and topoisomerase I keeping it under control (Figure 2A).

As replication starts, the advance of replication forks generates (+) supercoiling (over-winding of the DNA duplex) that transiently accumulates only immediately ahead of the forks (Figure 2B). RH (-) crossings and LH (+) ones cancel each other because they cannot co-exist in the same topological domain. Topo IV removes some of the LH (+) supercoils that form as a result of the advance of replication forks, and DNA gyrase introduces RH (-) supercoils to keep the un-replicated region negatively supercoiled. Note that in the cartoon represented in Figure 2B the upper part of the un-replicated region appears positively supercoiled while the lower part is negatively supercoiled. As mentioned above, this situation is inconsistent and it is presented here only for didactical reasons. The advancing rate of the DNA helicase far exceeds the capacity of Topo IV and DNA gyrase to completely eliminate all the overwound LH (+) supercoiling that transiently accumulates immediately ahead of the advancing forks. [ 12 ] To solve this conundrum, Champoux & Been proposed that fork swiveling allows some of these LH (+) supercoils to migrate from the un-replicated to the replicated region. [ 12 ] This causes intertwining of the newly made sister duplexes. The nodes between sister duplexes in the replicated region are called pre-catenanes. [ 13 ] Migration of each crossing from the un-replicated region to the replicated one generates two pre-catenane crossings (Figure 2C).

It is important to note that replication intermediates contain two regions that in vivo behave as independent topological domains: the un-replicated and the replicated regions. The combined action of Topo IV, DNA gyrase and swiveling of the forks guarantee that the un-replicated region is always kept negatively supercoiled (Figure 2C).


TOPOLOGICAL DYNAMICS IN THE REPLICATED REGION OF REPLICATION INTERMEDIATES

The sister duplexes in the replicated region cannot be supercoiled because rotation of the free ends of the nascent strands of the duplex dissipates all the torsional tension that might form in vivo as well as in vitro. In replication intermediates, it is energetically favorable for supercoils of the un-replicated region to diffuse to the replicated one, and vice-versa, with opposite handedness. [ 4 ] For this reason, the LH supercoil crossings that transiently accumulate immediately ahead of the forks (Figure 2B) migrate to the replicated region as RH pre-catenane crossings. As crossing DNA duplexes run in opposite directions in the un-replicated region, whilst they run in the same direction in the replicated one, the (+) sign of the crossings is maintained after their diffusion to the replicated region (Figure 2C). Hence, replication intermediates in vivo comprise RH (-) crossings in the un-replicated region and RH (+) pre-catenane crossings in the replicated one (Figure 2C). As replication forks keep advancing, the un-replicated region becomes progressively smaller, with fewer (-) supercoils, while the replicated region becomes larger, with more and more RH (+) pre-catenanes (Figure 2C). Finally, once replication is completed, the fully replicated sister duplexes end-up heavily catenated (Figure 2F). Topo IV is responsible for the elimination of all catenane crossings leading to the segregation of the newly made sister molecules. [ 14 ] At the same time, DNA gyrase progressively introduces (-) supercoiling in the daughter CCCs [ 15 ] to start the cycle again (Figure 2G).


DNA topoisomerase II

DNA topoisomerase II is ATP dependent enzyme which required 2 ATP molecule per reaction. It acts of entire double-stranded DNA, cut it and rejoin it. Topo II relaxes positive supercoiling in eukaryotic DNA.

One special type of DNA topoisomerase II found in prokaryote named “DNA gyrase” which introduces supercoiling in bacterial DNA. DNA gyrase performs both functions of releasing as well as introducing negative supercoiling in bacterial DNA.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. The image represents how topoisomerase II cut dsDNA and relax it.

Another important function is performed by topoII, are catenation and de-catenation. Imagine two linked rings. DNA molecules are catenated in the same manner. Here, topoisomerase cut the dsDNA and decatenate it for relaxing. Further, it catenates the decatenated DNA for supercoiling.

Image credit: “Molecular biology of the gene”, 7th edition by Watson. the Image represents catenation and decatenation.

The process of decatenation is a very important process as it allows separation of the DNA molecule into two daughter cells, after replication.


Реферат

The replication of chromosomal DNA is a fundamental event in the life cycle of every cell. The first step of replication, initiation, is controlled by multiple factors to ensure only one round of replication per cell cycle. The process of initiation has been described most thoroughly for bacteria, especially Escherichia coli, and involves many regulatory proteins that vary considerably between different species. These proteins control the activity of the two key players of initiation in bacteria: the initiator protein DnaA and the origin of chromosome replication (ориЦ). Factors involved in the control of the availability, activity, or oligomerization of DnaA during initiation are generally regarded as the most important and thus have been thoroughly characterized. Other aspects of the initiation process, such as origin accessibility and susceptibility to unwinding, have been less explored. However, recent findings indicate that these factors have a significant role. This review focuses on DNA topology, conformation, and methylation as important factors that regulate the initiation process in bacteria. We present a comprehensive summary of the factors involved in the modulation of DNA topology, both locally at ориЦ and more globally at the level of the entire chromosome. We show clearly that the conformation of ориЦ dynamically changes, and control of this conformation constitutes another, important factor in the regulation of bacterial replication initiation. Furthermore, the process of initiation appears to be associated with the dynamics of the entire chromosome and this association is an important but largely unexplored phenomenon.


2 Ҷавоб 2

This article (DNA Topology: Fundamentals by Mirkin SM) probably defines and describes linking number better than I ever could:

The fundamental topological parameter of a covalently closed circular DNA is called the linking number (Lk). Assume that one DNA strand is the edge of an imaginary surface and count the number of times that the other DNA strand crosses this surface (Figure 3). The algebraic sum of all intersections (which accounts for a sign of every intersection) is the Lk. Two important features of the Lk are evident from Figure 3. First, Lk is always an integer. Second, Lk cannot be changed by any deformation of the DNA strands, i.e. it is topologically invariant. The only way to change Lk is to introduce a break in one or both DNA strands, rotate the two DNA strands relative to each other and seal the break. Another characteristic of a circular DNA is called twist, or Tw. Tw is the total number of helical turns in circular DNA under given conditions. Since DNA is a right handed helix with 10.5 base pairs (bp) per turn, Tw is a large positive number for any natural DNA. Take a planar, circular DNA and try to locally separate the two DNA strands, i.e. to decrease the Tw. Since Lk cannot change, a decrease in Tw will be compensated by several positive writhes of the double helix (Figure 4). Writhing (Wr) is the third important characteristic of circular DNA, describing the spatial pass of the double helix axis, i.e. the shape of the DNA molecule as a whole. Wr can be of any sign, and usually its absolute value is much smaller than that of Tw. The above consideration can be formalized by the following equation: Lk = Tw + Wr. Note, that while Lk is an integer, neither Tw nor Wr should be such. Also, neither Tw nor Wr are topological invariants and their values easily change.

Linking number is simply the number of times one strand of DNA passes over the other. Compare this to:

You can, perhaps, think of twist as the passing over of strands within the helix and writhe as the passing over of strands when the entire helix crosses itself. Both twist and writhe involve strands of DNA passing over the other and so both contribute to the linking number. In the absence of writhe, linking number and twist are equal and both describe the same thing: the number of helical turns. However, in the presence of writhe, twist alone is insufficient to describe the topology of DNA because it doesn't account for the passing of the entire helix over itself.

Since twist is the number of helical turns, actually counting it in your image is not necessarily difficult, just time consuming. The image already has the twists numbered, and I've put a red do at every turn of the double helix. I've also circled, in blue, every point where the double helix passes over itself (writhe):

In that image, in may be difficult to visualize (and even understand!) that the strands only cross over each other 36 times (Lk), even though there are 42 helical turns (Tw). While twist and writhe are different modes of strand crossing, it is important to realize that they are interchangeable without breaking the strands. Let's consider a simpler example, where Lk = -1 (Wikipedia: DNA Supercoil):

In the lower image, the strands do not form a helical structure (Tw = 0) but they do both pass over each other together (Wr = -1). Can you imagine that if you were to "unfold" the superhelix (Wr = 0), the two individual strands would still be linked together in a helical structure (Tw = -1)? Neither could I, so I made a video with my shoelaces:

I hope that answers your question. Let me know if I misunderstood what you were asking or if anything needs clarification. You may also find my shoelace video on the topology of helicase-mediated DNA unwinding informative.


Видеоро тамошо кунед: Антипаралелльность ДНК. Видеоуроки биологии на (Сентябр 2022).


Шарҳҳо:

  1. Amad

    I apologize, but not fit enough.

  2. Josias

    Охираш хуб аст!!!!!!!!!!!!!!!!!

  3. Voodoozil

    сухан нест, хуб аст

  4. Edwald

    Мебахшед, ки ман халал мерасонам... Дар ман хам чунин вазъият. мухокима кардан мумкин аст.



Паём нависед