Маълумот

Тасвирҳои воқеии ҷанин: Чӣ гуна минтақаҳои гуногун маълуманд (ташкилгари спиман, минтақаҳои канорӣ…)?

Тасвирҳои воқеии ҷанин: Чӣ гуна минтақаҳои гуногун маълуманд (ташкилгари спиман, минтақаҳои канорӣ…)?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Дар бисёр китоби дарсӣ рақамҳои ҷанин тасвир шудаанд, аммо дар асл биолог чӣ гуна медонад, ки ин яке аз ҷанинҳо дар стадиони гаструлясия аст? Ба ғайр аз лаби дорсалӣ дар ин ҷо ман чизи дигареро ҷойгир карда наметавонам.


Аркадия сигнализатсияи марбут ба узвҳоро барои ба вуҷуд овардани мезендодерма тақвият медиҳад

Аъзоёни марбут ба узвҳои омили тағирёбандаи афзоиш (TGF) -β индуксияи мезодерма, эндодерма ва мезендодермаро танзим мекунанд, ки бофтаи хоси ташкилкунандаи Spemann 1,2,3,4,5,6,7 мебошад. Чӣ гуна ин бофтаҳои гуногун дар ҷавоб ба як молекулаҳои сигнализатсия ба вуҷуд меоянд, пурра фаҳмида нашудааст. Пешниҳод карда шуд, ки эффектҳои вобастагӣ ба консентратсия, ки тавассути миёнаравии кофакторҳо ва антагонистҳои берун аз ҳуҷайра масъуланд, барои фарқиятҳо 1,8,9,10 масъуланд. Дар ин ҷо мо нишон медиҳем, ки протеини ҳастаӣ Аркадия ба таври мушаххас фаъолияти мезендодерма-ангезандаи як зергурӯҳи аъзои оилаи TGF-β-ро тақвият медиҳад. Фаъолияти якчояи Аркадия ва Ксенопус вобаста ба гиреҳ-1 кифоя аст, ки мезендодермаро ба вуҷуд оранд ва мезодермаро пахш кунанд. Аркадия бофтаҳои вентриро дорсализатсия мекунад, ки дар натиҷа экспрессияи генҳои махсуси ташкилкунанда ба вуҷуд меояд. Бастани сигнали узвӣ аз берун аз ҳуҷайра ин таъсирҳоро бозмедорад. Аркадия ҳангоми ифодаи муштарак ба фаъолияти узв таъсир мерасонад ва метавонад дар ҳуҷайраҳои шафати онҳое, ки сигнали гиреҳро истеҳсол мекунанд, фаъолият кунад. Бозёфтҳои мо дар якҷоягӣ бо мушоҳидаи он, ки мушҳои мутант Аркадия аз гиреҳ ва мезендодерми аз гиреҳ ҳосилшуда надоранд, Аркадияро ҳамчун модулятори муҳими каскади сигнализатсияи гиреҳ муайян мекунанд, ки ба индуксияи ташкилкунандаи Спеман оварда мерасонад.


Реферат

Имсол, 2019, садсолагии эмбриолог E. E. Just -ро кашф мекунад, ки он ҳамчун блоки зуд ба полиспермия маъруф аст. Мушоҳидаи тағйироти нозук, ки дар сатҳи тухм ҳангоми бордоршавӣ (ва дар партеногенези таҷрибавӣ) ба амал меояд, ӯро водор кард, ки тухм ва дар воқеъ ҳар як ҳуҷайра дорои хосиятест, ки ӯ онро асабонияти мустақил, ки қобилияти ҳуҷайраро барои вокуниш ба тарзи мувофиқи физиологӣ ба сигналҳо ё триггерҳои гуногун ифода мекунад. Дар ин мақола, ман баҳс мекунам, ки консепсияи хашмгинии мустақили Юст ба Йоханнес Холтфретери муосираш хабар дод, зеро Холтфретер кӯшиш кард, ки падидаҳои индуксия ва салоҳияти ҷанинро шарҳ диҳад ва Холтфретер, дар навбати худ, ба Марк Киршнер ва Ҷон Герҳарт дар таҳияи назарияи фасилитатсионӣ таъсир расонд. вариант. Таъсири Ҷаст махсусан дар муаррифии Герҳарт ва Киршнер дар бораи он чизе, ки онҳо меноманд, возеҳ аст алоқаи заиф- моликияти системаҳои зинда, ки имкон медиҳад равандҳо ва ҷузъҳои асосӣ бо роҳҳои гуногун барои тавлиди хислатҳои нав омехта ва мувофиқ карда шаванд. Мутаассифона, робитаи байни кори Холтфретер ва Just's пинҳон боқӣ мондааст. Дар ин мақола мисолҳои падидаҳое оварда шудаанд, ки робитаи заиф доранд ва он далелро нишон медиҳад, ки консепсияи хашмгинии мустақил тавассути Холтфретер, Герҳарт ва Киршнер ба биологияи муосири ҳуҷайра ва рушд ба таври васеъ ворид шудааст.

"Бо вуҷуди ин, пешрафтҳои бузурги охирин дар [фаҳмиши мо дар бораи аҳамияти сатҳи ҳуҷайра] аз мо талаб мекунанд, ки ба китоби Ҷаст баргардем.Биологияи сатҳи ҳуҷайра] барои аз нав баҳо додан ба аҳамияти муосири он. Эҳтимол, шояд, ӯ метавонад Мендел ё Мишери дигаре бошад, ки дар тӯли даҳсолаҳо пас аз маргаш корҳои бунёдиро иҷро кунад (Гласс, 1984).


МАВОД ВА УСУЛ

Ооситҳо ва ҷанинҳо

Ооцитҳо тавре ки пештар тавсиф шуда буданд, ба таври дастӣ дефолликатсия ва парвариш карда мешуданд (Кофрон ва дигарон, 1999). Ооцитҳо бо олигос дар муҳити фарҳангии ооцитҳо (OCM) бо истифода аз ду тазриқи экваторӣ ба як ооцит барои XTcf3 олиго ё як тазриқи растанӣ барои олигоҳои VegT ва Axin, ки дар 18 ° C парвариш карда мешаванд ва бо истифода аз техникаи интиқоли мизбон тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, сукут карда шуданд (Zuck et. ал., 1998). Таҷрибаҳои наҷотдиҳӣ тавре ки дар матн тавсиф шудааст ё тавассути тазриқи mRNA дар экваториалӣ ба ооситҳо, 24 соат пас аз олиго (расми 2F), ё тавассути сӯзандору ба ҷанинҳои марҳилаи 4-ҳуҷайра (расми 2E) гузаронида шуданд. Тухмҳо бо истифодаи суспензияи нутфа кашида ва бордор карда шуданд ва ҷанинҳо дар 0.2 × MMR нигоҳ дошта шуданд. Барои тазриқи mRNA пас аз бордоршавӣ (расми 2E), ҷанинҳо безарар карда шуданд ва ба 2% Фиколл дар 0,5 × MMR дар марҳилаи 1-ҳуҷайра интиқол дода шуданд. mRNAs бо оби тозашудаи стерилизатсияшуда ҳал карда шуданд ва ба бластомерҳо ворид карда шуданд.

Барои таҳлили сарпӯши ҳайвонот, ҷанинҳои бластулаи миёна дар зарфҳои 2% агароз дар 1 × ММР ҷойгир карда шуда буданд ва сарпӯшҳои ҳайвонот бо истифода аз фишорҳои тез бурида шуданд. Пас аз он сарпӯшҳо дар OCM парвариш карда шуданд, то он даме, ки ҷанинҳои бародар ба марҳилаи миёна то охири гаструла расиданд. Барои эксплантҳои экваторӣ, ҷанинҳо дар зарфҳои 2% агароз дар марҳилаи мобайни бластула ҷойгир карда шуда, минтақаҳои экваторӣ бо сӯзанҳои волфрам ҷудо карда шуданд (Xanthos et al., 2001) ва дар OCM парвариш карда шуданд, то он даме, ки ҷанинҳои бародар ба марҳилаи нимаи нейрула расиданд. Барои ҷудо шудан ба ду қисмҳои дорсалӣ ва вентралӣ дар марҳилаи гаструла, тарафи доралии ҷанинҳо дар марҳилаи чор ҳуҷайра бо истифода аз кристаллҳои кабуди Нил қайд карда шуд. Меҳвари дорсовентралӣ дар марҳилаи чаҳор ҳуҷайра бо фарқиятҳои пигментацияи паҳлӯҳои дорсалӣ ва вентралӣ шинохта шудааст. Вақте ки ҷанинҳои намуди ваҳшӣ ба марҳилаи 10 расиданд, ҳама партияҳо дар зарфҳои 2% агароз дар 1 × MMR pH 7.6 ҷойгир карда шуда, ба ду қисмҳои дорсалӣ ва вентралӣ тақсим карда шуда, дар гурӯҳҳои 4 ним-ҷанин дар фосилаи 2 соат тавассути гаструла ях карда мешаванд. марҳилаҳо

Олиго ва mRNAs

Олигодеоксинуклеотидҳои антисенсе, ки истифода шудаанд, олигонуклеотидҳои химерии фосфоротиоат-фосфодиэфири HPLC тозашуда (Sigma/Genosys) бо таркиби асосӣ буданд:

XTcf3 T1: 5′-C*G*A*G*GGATCCCAGTC*T*T*G*G-3 ′.

XTcf3 T2: 5′-G*A*G*ATAACTCTGA*T*G*G-3 ′.

Олигоҳои XTcf3 ба ҳама чор варианти XTcf3 комилан пурра мебошанд. Ситорачаҳо (*) пайвандҳои фосфоротиоатиро ифода мекунанд. Олигоҳо дар оби стерилизатсияшуда, филтршуда дубора суспензия карда шуданд ва ба миқдори дар матн тавсифшуда сӯзандоруҳо гузаронида шуданд. Муддати пурра XTcf3 дар вектори pGlomyc бо хатти чорй карда шуд Xbaман ва cap кардам XTcf3 mRNA бо истифода аз маҷмӯаи T7 mMessage mMachine (Ambion) синтез карда шуд. РНК -ҳо фенол истихроҷ карда шуданд, этанол чуқур карда шуд ва сипас дар тазриқи стерилшудаи тазриқ барои тазриқ дубора боздошта шуд.

Таҳлили ифодаи генҳо бо истифода аз RT-PCR дар вақти воқеӣ

РНК-и умумӣ аз ооцитҳо, ҷанинҳо ва эксплантҳо бо истифода аз протеиназаи К омода карда шуда, сипас тавре ки дар боло тавсиф шудааст, бо ДНазаи бе РНаз коркард мешавад (Чжан ва дигарон, 1998). Тақрибан шашуми эквиваленти ҷанини РНК барои синтези cDNA бо праймерҳои олиго(dT) истифода шуд ва пас аз он дар вақти воқеӣ RT-PCR ва миқдор бо истифода аз System LightCycler™ (Roche), тавре ки Кофрон ва дигарон тавсиф кардааст. (Кофрон ва дигарон, 2001). Примерҳо ва шароитҳои даврзании истифодашуда дар ҷадвали 1 оварда шудаанд. Қиматҳои ифодаи нисбӣ бо роҳи муқоиса бо каҷи стандартӣ, ки дар натиҷаи коҳиши пайдарпайи cDNA-и назоратии сӯзишворӣ тавлид шудааст, ҳисоб карда шуданд. Намунаҳо ба сатҳи муқаррарӣ карда шуданд орнитин декарбоксилаза (ODC), ки ҳамчун назорати боркунӣ истифода мешуд. Танҳо намунаҳои об ё назоратҳое, ки дар реаксияи синтези cDNA мавҷуд нестанд, дар ҳама ҳолатҳо маҳсулоти мушаххас дода натавонистанд.


ГРАДИЕНТҲО БАРОИ АКСҲОИ АСОСИИ БАДАН ДАР ВЕРТЕБРАТҲО

Ду меҳвари асосии бадан мавҷуданд, антеропостериор (AP) ва дорсовентралӣ (DV). Аммо, одатан, танҳо як ташкилкунанда мавҷуд аст-ташкилкунандаи навъи Spemann. Чӣ тавр ду системаҳои иттилоотии мавқеи ортогоналӣ зери таъсири a муҷаррад ташкилкунанда? Оё ташкилотчии дуюме ҳаст, ки то ҳол аз мадди назар дур мондааст? Далелҳои хуб мавҷуданд, ки ташкилкунандаи намунаи AP на ташкилкунандаи Spemann, балки тамоми минтақаи канорист (Meinhardt 2006). Дар ибтидои гаструла, Внт дар минтақаи канорӣ ба истиснои минтақаи ташкилкунанда истеҳсол карда мешавад (Christian and Moon 1993). Внт иттилооти мавқеъиро барои ҷудошавӣ ба мағзи пеш ва миёна таъмин мекунад (Kiecker and Niehrs 2001 Nordström et al. 2002 Dorsky et al. 2003). Ин системаи ташаккулёбандаи шакли эволютсионӣ хеле кӯҳна аст. Муқоисаи ифодаҳои генҳо дар гидра ва гаструлаи ибтидоии устухонҳо як мукотибаи ҳайратангезро нишон медиҳад ва нишон медиҳад, ки нақшагирии майна ва дилҳои устухонҳо аз системае ба вуҷуд омадааст, ки як вақтҳо барои намунаи бадани аҷдоди ба гидра монанд масъул буд (расми 2B) ) (Meinhardt 2002). Ба ин назар, ташкилкунандаи гидра ва бластопори сутунмӯҳрагон, яъне минтақаи канорӣ, ҳалқаи микробҳо ва ғайра сохторҳои гомологӣ мебошанд, ки барои намунаи AP масъуланд.

Баръакси ташкилкунандаи гидра, бластопори сутунмӯҳрадор ба як ҳалқаи азим табдил ёфт, ки ташкилкунандаи Спеман дар ин ҳалқа як часпаки хурдеро ташкил дод. Пас аз он ташкилкунандаи Spemann тахмин мезанад, ки меҳвари DV -ро тарҳрезӣ мекунад, аммо ин бавосита бо роҳи ба вуҷуд овардани хати миёнаи дорсалӣ, нотохорд ва табақи фарш - "хати баланд", на "нуқтаи баланд" барои намунаи DV. Ҳарду минтақаҳои ташкилкунанда, бластопор барои AP ва хати миёна барои меҳвари DV, як системаи координатии наздикии картезианиро ташкил медиҳанд, ки ба ҳар ду меҳвар намунаи комбинатори имкон медиҳад (расми 2С). Насли як "хати баланд" -и тӯлонии дароз барои намунаи DV як раванди нозуккунандаи шакл аст. Ҳалли устухонҳо ягона нест. Дар ҳашарот, масалан, як созмондиҳандаи дорсалӣ a саркӯб кардан таъсир, ки боиси хати миёна дар тарафи муқобили вентралӣ пайдо мешавад (Meinhardt 2004, 2008), дар муқоиса бо сутунмӯҳраҳо, ки дар он ташкилкунанда хати мобайниро ба дарозӣ оғоз ва дароз мекунад. Ин модел барои ҷойгиршавии дорсалӣ ё вентралии системаи марказии асаб мутаносибан дар сутунмӯҳраҳо ва ҳашаротҳо мувофиқат мекунад.


Модели миқёси миқёси вобаста ба Chordin/Sizzled

Мо ба наздикӣ дар бораи механизми молекулавии миқёс дар ду тақсимшуда гузориш додем Ксенопус ҷанин (Inomata ва дигарон. 2013). Ҷанини нимсолаи дорсалӣ бояд аз рӯи танзими се омил, синтез -диффузия -деградатсия, мувофиқи андозаи ҷанин градиенти дурусти Координат ташкил кунад. Аммо, агар се омил арзиши худро ба таври динамикӣ тағйир диҳанд, таҳлили системаи миқёспазир душвор хоҳад буд. Барои рафъи ин мураккабӣ, мо ба таври сунъӣ ҳуҷайраҳои манбаъро эҷод кардем, ки миқдори доимии сафедаи Чординро бидуни таъсир ба андозаи ҷанин ё фаъолияти BMP синтез карданд (таҳлили барқароркунии меҳвари D-V). Аввал ба ҷанин сӯзандору гузаронида шуд β-катин-МО ва координат/ноггин-MO (βCN-MO) барои нест кардани ҳуҷайраҳои манбаъ (ташкилкунанда) ва ифодаи омилҳои эндогении дорсализатсия мутаносибан (расми 4) (Хисман) ва дигарон. 2000 сол ва дигарон. 2003а). Баъдан, бо истифода аз ин ҷанинҳои комилан вентрализатсияшуда, ки градиент надоштанд, мо ба таври маҳаллӣ сӯзандору кардем хордин mRNA барои экзогенӣ дар ҷанин градиенти Chordin эҷод мекунад. Ин боиси ба вуҷуд омадани се минтақаи алоҳида, минтақаҳои дорсалалӣ (D), паҳлӯӣ (L) ва вентралӣ (V), ба мисли ҷанини назоратӣ. Вакте ки суръати истехсоли протеини Чордин аз хисоби пошидани чор баробар зиёд шуд хордин mRNA, ҷанинҳо тағироти мӯътадилро дар ташаккули меҳвари D-V нишон доданд. Аз ин рӯ, шакли градиенти Чордин асосан бо таназзул танзим мешуд.

Аз ин натиҷаҳо, мо ба ассотсиатсияи байни Chordin ва Sizzled, ки устувории сафедаи Чординро назорат мекунад, тамаркуз кардем (расми 2В). Барои санҷидани суръати диффузия, мо пас аз таҳлили фотоблеинг (FRAP) ё спектроскопияи коррелятсионии флюоресценсионӣ (FCS) барқарорсозии флуоресценцияро анҷом додем ва дарёфтем, ки Chordin ва Sizzled, инчунин шакли секретории mEGFP зуд паҳн мешаванд. Баръакс, суръати таназзули ҳар як сафеда ба таври возеҳ фарқ мекард. Протеини Sizzled дар ҷанин мӯътадил буд, дар ҳоле ки протеини Чордин (26,7 фмол дар як ҷанин) хеле зуд вайрон шуд ва нисфи ҳаёти тақрибан 30 дақиқа. Ин ноустувории сафедаи Chordin аз ҳисоби миқдори барзиёди Sizzled комилан баста шуд, ки нишон медиҳад, ки аксарияти таназзули Chordin аз металлопротеазҳои BMP1 ва Xlr вобаста аст. Гузашта аз ин, градиенти Chordin вобаста ба консентратсияи Sizzled шакли худро ба таври динамикӣ аз нишеб ба чуқур иваз кард, ҳатто вақте ки суръати истеҳсоли Chordin тавассути таҳлили меҳвари D -V муқаррар карда шуда буд. Ин натиҷаҳо нишон доданд, ки шакли градиенти Chordin асосан бо таназзул танзим карда мешавад, ки суръати он аз миқдори сафедаи Sizzled вобаста аст.

Дар асоси мушоҳидаҳои таҷрибавӣ, мо модели миқёси вобаста ба Chordin/Sizzled, ки дар поён зикр шудааст, пешниҳод кардем. Пеш аз гаструлятсия, bmps ва гени ҳадафи он шӯхӣ кард дар тамоми ҷанин ифода ёфтаанд (расми 5А). Аммо, вақте ки ташкилкунанда (ҳуҷайраҳои сарчашма) дар марҳилаи аввали гаструла дар ҷанин ба таври маҳаллӣ ташаккул ёфт, синтези Хордин дар фазои берун аз ҳуҷайра паҳн шуда, тадриҷан ҷилавгирӣ карда шуд. шӯхӣ кард майдони ифода тавассути пешгирии фаъолияти BMPs (расми 5A). Дар рафти ин раванд протеини Sizzled тадриҷан дар ҷанин ҷамъ мешуд, зеро сатҳи пасти таназзули он (расми 5В). Бо дарназардошти ҷанини нимдоштаи доралӣ, чарангос зад майдони ифода бо паҳншавии Чордин зуд пахш карда шуд (расми 5А поён). Ҷамъшавии Sizzled нисбат ба он дар ҷанини назоратӣ камтар шуд (расми 5Б дар поён). Дар ин ним ҷанини дорсалии паст-Sizzled таназзули Чордин такмил дода шуд ва градиенти нишеб барои ҷанини хурд мувофиқро ташкил дод (расми 5С).

Дар ин модели миқёс, мо пешниҳод кардем, ки андозаи ҷанин устувории сафедаи Chordin -ро тавассути ҷамъшавии сафедаи Sizzled танзим кунад. Барои ҳалли ин имкон, истеҳсоли Чордин бо истифода аз таҳлили барқарорсозии меҳвари D-V муқаррар карда шуд ва андозаи ҷанин ба таври сунъӣ бо дусексия тағир дода шуд. Сарфи назар аз истеҳсоли муқарраршуда, камшавии сафедаи Чордин дар ҷанинҳои ду тақсимшуда ошкор карда шуд. Мувофиқи модели миқёси вобаста ба Chordin/Sizzled, ин тағирот дар устувории сафедаи Chordin вақте ки Sizzled бо морфолино тамом шуд, бартараф карда шуд. Ғайр аз он, мо модели математикиро дар асоси натиҷаҳои таҷрибавӣ сохтем: (i) суръати якхелаи диффузияи Чордин ва Сиззлед (ii) сатҳи пасти таназзули Sizzled нисбат ба Чордин (iii) Танзими ба шумо вобастагии таназзули Чордин ва (iv) рафъкунӣ майдони ифодаи Sizzled аз ҷониби диффузияи Чордин. Дар ин модели математикӣ, мо тасдиқ кардем, ки се минтақаи ҷудогона, дорсалалӣ, паҳлуӣ ва вентралӣ метавонанд тавассути ҷамъшавии Sizzled ба андозаи ҷанин миқёс гиранд.


Муҳокима

Дар Ксенопус Ташкилгари Spemann барои кашфи сафедаҳои махфӣ, ки рушдро танзим мекунанд, заминаи сершумори моҳидорӣ фароҳам овардааст. Интизор мерафт, ки омилҳои нави афзоиш метавонанд ҷудо карда шаванд, аммо ба ҷои ин, муайян карда шуд, ки ташкилкунандаи Spemann тавассути секрецияи омехтаи антагонистҳои омилҳои афзоиш миёнаравӣ дар индуксияи ҷанин мебошад (4, 5). Дар таҳқиқоти мазкур, мо пайдарпайии амиқро барои таҳқиқи интихоби байни эпидермис ва бофтаи асаб истифода бурдем.

Манбаи бойи транскриптомӣ.

Транскриптом ҳуҷайраҳои сарпӯши ҳайвонот, ки дар тӯли якчанд соат ҷудо карда шуда буданд (боиси безараргардонӣ), инчунин эксплантҳои эктодермалӣ, ки бо як қатор мРНК -ҳое, ки бофтаи асабро ба вуҷуд меоранд, Кордин, Cerberus, ва FGF8, аз ҷониби RNA-seq муайян карда шуд. Мо инчунин таъсири индуктори эндомезодермро тафтиш кардем Xnr2, индуктори эпидермалӣ BMP4, ва тағирдиҳандаи салоҳияти индуксияи мезодерма xWnt8 (32). Ин маълумот, ки ҳадди ақал аз 45 × 10 9 нуклеотидҳои пайдарпайи РНК иборатанд, дар Datasets S1 -S3 оварда шудаанд, ки онро ҷомеаи тадқиқотӣ ба осонӣ истихроҷ карда метавонад. Ин як манбаи муҳими кушода барои биологҳои рушдёбанда мебошад, ки ба фарқияти қабати микробҳо манфиатдоранд.

Ҷудошавии як ингибитор Wnt.

Бо ҷустуҷӯи генҳои индуксияи асабӣ, ки бо диссоциасияи ҳуҷайра фаъол карда шудаанд (ки боиси фаъолшавии MAPK мегардад) (19) ва тавассути ҷустуҷӯи Cerberus, Чордин, ва xWnt8 mRNAs, мо як протеинро муайян кардем, ки бинобар фенотипи аз ҳад зиёд ифода кардани он ҳамчун Bighead таъин кардем. Ҳангоми омода кардани китобхонаҳои RNA-seq, ғайричашмдошт ин молекула дар эктодермаи марҳилаи охири гаструла 12 ифода карда нашудааст. Дар ин марҳила, Bighead mRNA дар энтодерма, алахусус дар ташкилкунандаи дорсалии Spemann ифода карда мешавад. Ифодаи ташкилкунанда дар эндодермаи амиқ ҷойгир аст, аммо бо эндодермаи пешқадами пешқадам (ки рӯдаи пеш ва ҷигарро ба вуҷуд меорад), ки Cerberus ва Dkk1-ро ифода мекунад, мувофиқат намекунад (24, 41). Бо назардошти талаботи Bighead барои рушди сар, чунин ба назар мерасад, ки антагонистҳои Wnt бояд инчунин аз минтақаҳои паситарин эндодерми ташкилкунанда ба вуҷуд оянд, то хосиятҳои индуксионии сарро пурра тавонанд кунанд.

Аз эҳтимол дур аст, ки ҷудошавии сарпӯшҳои ҳайвонот эндодермро ба вуҷуд меорад, зеро нишондиҳандаи пан-эндодермалӣ 17 ифода карда намешавад (Dataset S1). Чунин ба назар мерасад, ки ҷудошавии сарпӯшҳои ҳайвонот ба фаъолсозии пешакии доменҳои асабии ифодаи Bighead оварда мерасонад, ки онҳо дар ҷанини вайроннашуда дар марҳилаҳои дертари нейрула мушоҳида карда мешаванд. Шиносоии Bighead хушбахт буд, зеро он як сафедаи ҷолибро исбот кард.

Аз он вақт X. лаевис аллотетраплоид аст, Bighead бо ду ген аз шаклҳои S ва L рамзгузорӣ шудааст (20). Ҳарду протеинҳои тақрибан 270 ааро бо пептиди сигнал рамзгузорӣ мекунанд ва ҷудо мешаванд. Дар таҷрибаҳои аз ҳад зиёд, Bighead боиси фенотипҳо ба антагонисти архетипии Wnt Dkk1 [41] шуд. Каллаи калон mRNA ифодаи як қатор аломатҳои сарро васеъ карда, ифодаи " En2 Генҳои мақсадноки Wnt, пас аз як сӯзандоруи пайдоиши меҳвари дуввумро пешгирӣ карданд xWnt8 mRNA ва кам шудани индуксияи ҳадафҳои аввали Wnt Сиамоис ва Xnr3. Ғайр аз он, илова кардани протеини Bighead сигнализатсияи каноникии Wnt-ро дар таҳлилҳои генҳои хабарнигори люцифераза бозмедорад. Ҳамин тариқ, Bighead ҳамчун антагонисти сигнализатсияи Wnt каноникӣ рафтор мекунад, ки бисёре аз онҳо барои пешрафти сар мусоидат мекунанд (48).

Ҷустуҷӯҳои васеъ барои гомологҳои Bighead дар дигар организмҳо нишон доданд, ки он танҳо дар моҳӣ ва амфибияҳо мавҷуд аст. Масалан, дар зебрафиш Bighead ба LOC571755, сафедаи функсияи номаълум мувофиқат мекунад. Протеин зуд эволютсия кард, аммо шаш систеини он дар бисёр намудҳо нигоҳ дошта мешуд. Пешгӯии SWISS-MODEL нишон медиҳад, ки минтақаи C-терминали Бигхед бо сохтори булӯрии продоменаи TGF-βҳо ба монанди миостатин/GDF8 (38, 40) мувофиқ аст, шояд як қисми Bighead, ки аз домени сохторӣ дар пешравии як TGF-β қадим.

Дар хазандагон, паррандагон ва ширхӯрон гомологҳо пайдо нашудаанд. Ҳангоми эволютсия талафоти ген хеле маъмул аст. Масалан, мо як шабакаи қадимаи худтанзимкунии Chordin/BMP/Tolloid -ро тавсиф кардем, ки намунаи D/V -ро дар сутунмӯҳраҳо ва устухонҳо танзим мекунад [49]. Аммо, бо вуҷуди ин ҳифзи амиқ, баъзе ҷузъҳои шабака гум шуданд. Протеини морфогенетикии зидди дорсализатсия (ADMP) як BMP мебошад, ки дар платипус гум шуда буд (Орниторхинчус) (50). sFRPs Crescent ва Sizzled дар паррандагон ва платипус мавҷуд аст, аммо на дар ширхӯрони олӣ, ки зардии тухмро гум кардаанд. Илова бар ин, sFRPs дар ягон устухонҳо вуҷуд надоранд [51]. Чунин ба назар мерасад, ки талаботи ҷанинӣ ба сатҳи танзими аз ҷониби Bighead пешниҳодшуда дар якҷоягӣ бо ихтирои амнион гум шудааст. Бо вуҷуди ин, таҳқиқоти мо бо камшавии Bighead аз ҷониби MOs талаботи бениҳоят қавӣ барои ин генро дар ташаккули сар ҳангоми рушди қурбоққаҳо нишон медиҳанд.

Чаро ин қадар антагонистҳои Wnt?

Bighead ба рӯйхати калони антагонистҳои махфии Wnt илова мекунад. Ба онҳо сафедаҳои Dkk (48), sFRPs, омили ингибитори Wnt 1 (WIF-1) (52), SOST/Sclerostin (53), Нотум (гидролазае, ки пальмитолеолатро аз Wnt дар фазои берун аз ҳуҷайра хориҷ мекунад) дохил мешаванд (54), ва Angptl4 (6). Илова бар ин, сафедаҳои трансмембранӣ ба монанди Шиса (сафедае, ки дар интиқоли ретсепторҳои Frizzled ба сатҳи ҳуҷайра иштирок мекунад) (55), Тики (протеазае, ки терминали аминокислотаи Wnts-ро ҷудо мекунад) (56) ва Znrf3/RNF43 (лигазаи убикутин, ки ресепторҳои Frizzled ва Lrp6-ро барои таназзули лизосомалӣ ҳадаф қарор медиҳад) (57, 58) сигнализатсияи Wnt-ро танзим мекунад.

Тавре ки дар ин тадқиқот нишон дода шудааст, Bighead ба Lrp6 пайваст шуда, эндоситозҳои босуръати онро ба лизосомаҳо ба вуҷуд меорад. Дар натиҷа, Lrp6 аз сатҳи ҳуҷайра хориҷ карда, дар эндолизосомаҳо таназзул мешавад. Ин механизми молекулавӣ ба механизми антагонистҳои Wnt Dkk1 ва Angptl4 хеле монанд аст. Dkk1 ба Lrp6 ва Kremen1/2 мепайвандад ва комплекс дохил карда мешавад. Angptl4 як сафедаи ҷудошуда мебошад, ки бо нақши худ ҳамчун ингибитори липопротеин липаза (LPL), ферменти калидӣ дар хориҷ кардани триглицеридҳо аз плазмаи хун маъруф аст (59). Таҳсил дар Ксенопус нишон доданд, ки Angptl4 ба синдиканҳои сатҳи ҳуҷайра (ки протеогликанҳои трансмембранӣ мебошанд) мепайвандад ва ин ҳамкорӣ эндоцитози Lrp6 (6) -ро ба вуҷуд меорад. Дар мавриди Bighead, маълум нест, ки оё барои дохиликунонии Lrp6 як корецептор лозим аст ё не. Аммо он чизе ки возеҳ аст, ин аст, ки ин се антагонисти Wnt ба дохилшавии Lrp6 ба популятсияи эндолизосомалӣ оварда мерасонанд, ки дар тавлиди сигнал иштирок намекунанд.

Мавҷудияти ин қадар танзимгарон мураккабии ғании роҳи сигнализатсияи Wnt-ро таъкид мекунад. Мо одатан Wnt-и каноникиро ҳамчун сигнале меҳисобем, ки танҳо сатҳи β-катенинҳои ҳастаиро барои танзими транскрипт бо омили Т-ҳуҷайра/омили тақвиятдиҳандаи лимфоидҳо (TCF/LEF) афзоиш медиҳад. Бо вуҷуди ин, Wnt таъсири иловагӣ дорад. Масалан, дар стабилизатсияи вобаста ба Wnt сафедаҳо, садҳо протеини ҳуҷайра устувор мешаванд, ки боиси афзоиши ҳуҷайра мегардад (60, 61). Ин аз ҳисоби секвестри GSK3 дар дохили эндосомаҳои дер/ҷисмҳои бисёрвақтаӣ (MVBs) [62, 63] ба амал омада, фосфоризатсияи фосфодегронҳоро дар сафедаҳои цитозоликӣ коҳиш медиҳад, ки одатан ба таназзули онҳо дар протеасомаҳо оварда мерасонад. Илова ба GSK3, дигар ферментҳои муҳими ситозоликӣ, протинин аргинин метилтрансфераза 1 (PRMT1), дар дохили MVBs ҷудо карда мешаванд, вақте ки корецепторҳои Wnt дар якҷоягӣ бо лиганди Wnt -и худ [64]. Дарккунии ба наздикӣ он, ки Wnt3a эндоцитозро, ки тавассути миёнаравии ретсепторӣ нест, BSA-DQ аз муҳити берун аз ҳуҷайра бармеангезад (64) нишон медиҳад, ки Wnt як танзимгари асосии қочоқи мембранаҳо мебошад. Мо пешниҳод менамоем, ки Lrp5/6 танзимгари асосии на танҳо қочоқи Wnts, балки инчунин азхудкунии умумии моеъи ҳуҷайра ва маводи ғизоӣ мебошад. Эндоцитоз як амволи универсалии мобилӣ мебошад, ки онро Dkk1, Angptl4 ва Bighead танзим кардан мумкин аст. Дар бораи физиологияи роҳи аҷиби сигнализатсия Wnt бисёр чизҳоро омӯхтан лозим аст (65, 66).


Эътирофҳо

Мо ба F. Cong барои пешниҳоди сохторҳои ZNRF3 ташаккур мегӯям D. Koinuma барои таъмини сохторҳои ALK C. Janda барои таъмин намудани сохтори суррогати WNT R. Томас барои ҳуҷайраҳои H1581. Мо ба G. Roth ва Aska Pharmaceuticals Tokyo барои пешниҳоди саховатмандонаи hCG изҳори миннатдорӣ мекунем. Мо ба NXR (RRID: SCR_013731), Xenbase (RRID: SCR_004337) ва EXRC барои Ксенопус захирахо. Мо ба Фабио да Силва барои хондани интиқодии дастнавис миннатдорем. Дастгирии коршиносони техникӣ аз ҷониби иншооти асосии DKFZ барои микроскопияи сабук ва лабораторияи марказии ҳайвоноти DKFZ миннатдор аст. Ин кор аз ҷониби Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Foundation Research German) - SFB1324 - рақами лоиҳа 331351713 маблағгузорӣ шудааст.


ВИЛОЯТИ ДАСТОР (ГИПОБЛАСТИ ДУЮМ)

Эндобласти ғалладона як қабати якҳуҷайравии дуру дарозро ташкил медиҳад, ки аз ҳошияи миёнавии дос ё эндобласти пайвандгари Раубер дар самти марказӣ ва краниалӣ ҳангоми инкубатсияи барвақтӣ паҳн мешавад (Callebaut ва Van Nueten, 1994 Callebaut et al., 1999 Расми 13). Асосан, он γ ооплазма дорад.

Эндобласти сермасраф ба насли як ҳуҷайра монанд аст, ки дар он орди Раубер мавҷуд аст ва рафтори ба ин монанд дорад, аммо аз ҷониби орди Раубер бартарӣ дорад

Агар дар минтақаи зидди дос аз бластодермаи мурғи бидуни инкубатсия пораи эндобласти бедӣ ҷойгир карда шавад, ки аз он доси Раубер ба таври интихобӣ харошида шуда бошад, он гоҳ як ҷанин бо PS, энтодермаи ниҳоӣ, гиреҳи Ҳенсен ва табақи асабӣ инкишоф меёбад. самти комилан муқобил, аз минтақаи зидди дос (Callebaut et al., 2003a, b). Ҳамин ҳолат вақте рух медиҳад, ки пораи эндобласти доси бедона дар қисми ҷудошудаи марказии бластодерми мурғи бедодерма ҷойгир карда мешавад (Callebaut et al., 2002c). Ооплазмаи марказии зеризаминӣ, ки ба таври сунъӣ бо ашёи доси Rauber ё эндобласти дос дар фарҳанг ҷойгир карда шудааст, метавонад ҳамчун субстрат барои паҳншавии ҳуҷайра бо иқтидорҳои дубора тавлидкунанда ва/ё тавлидкунанда дар қабати болоии ҳамсоя фаъолият кунад (Callebaut et al., 2000c). Ҳатто фаъолшавии ташаккулёбии ҷанин метавонад аз ҷониби бластодискҳои бепарвои бедон сурат гирад (Callebaut et al., 2000d).

Ҳангоме ки эндобласти доси бедӣ дар минтақаи ҷудошудаи зидди доси бластодермаи мурғии инкубатсиянашуда дар фарҳанг гузошта мешавад, як табақи асаби ибтидоӣ ба вуҷуд меояд. Баръакс, вақте ки як пораи доси эндобласти бедола дар минтақаи зидди доси як мурғи кулланнашуда дар фарҳанг ҷойгир карда мешавад, он таъсири индуксионӣ надорад. Ин бозёфт аз он шаҳодат медиҳад, ки доси Раубер эндобласти доғи ба таври ectopically ҷойгиршударо, ки аз ҳамон насли ҳуҷайра гирифта шудааст, бартарӣ медиҳад ё ингибит мекунад. Ин эндобласти дос, агар аз таъсири доси Раубер хориҷ карда шавад, дар қабати болоии бластодерми беинкубатӣ дорои потенсиали гаструляция ва/ё неврулятсия мебошад, аммо ба ташаккули ҷазираи хун таъсир намерасонад. Генҳои гомеобокс cHex дар эндобласти дос ва доси Раубер ифода ёфтааст (Яцкиевич ва дигарон, 1997). Транскриптҳои cHex инчунин дар дохили ҷазираҳои хун дар марҳилаи 4 (Гамбургер ва Гамильтон, 1951) ва дар ҳуҷайраҳои эндотелияи рагҳои ҷанинӣ ва дохилиҷанин ошкор карда шуданд. Азбаски мо нишон додем, ки дос ва эндобласти Раубер ба ташаккули ҷазираи хун таъсири индуктивӣ мерасонад, мо метавонем бо генҳои cHex муносибати номаълумро пешбарӣ кунем.

Таъсири Endoblast Sickle ба Neurulation ва Gastruulation

Асоси молекулавии индуксияи асабӣ ба таври васеъ омӯхта шудааст Xenopus laevis, ва муайян карда шуд, ки бо таъсиси меҳвари dorsoventral зич алоқаманд аст (De Robertis and Sasai, 1996 Hemmati-Brivanlou and Thomsen, 1995 Hemmati-Brivanlou and Melton, 1997). Дар қурбоққаҳо эктодермаи ояндадор аз ҷониби BMPs ба вуҷуд меоянд. Баръакси ин, рушди нейралӣ ғайрифаъолкунии BMP-ҳоро талаб мекунад ва тавассути ташаккули мустақими мураккаб байни BMPs ва омилҳои ба вуҷуд овардани асабҳо ба монанди хордин, ноггин ё фоллистатин ба даст оварда мешавад (Пикколо ва дигарон, 1996 Зиммерман ва дигарон, 1996). Дар бластодерми чӯҷа дар марҳилаҳои ибтидоӣ, эпидермиси ояндадор бо ифодаи гени гомеобокс DLX5 тавсиф мешавад, ки дар вақти гаструляция ва невруляция як аломати эпидермалӣ боқӣ мемонад ва имкон медиҳад, ки онро аз пластинкаи марказии асаб фарқ кунад (Пера ва дигарон, 1999). ). Ин сигналҳои амудӣ аз қабати поёнӣ барои таъсиси плитаи нейронӣ аз ҷониби муаллифони охирин бо такрори такрории эндобласти зер нишон дода шудаанд. Дар сурати набудани қабатҳои поёнии ҳомила, эпидермис ба минтақае васеъ шуд, ки одатан плитаи асабро ташкил медиҳад.

Кноетген ва дигарон. (1999а, б) таҳлили GANF (Галлус қабати нейронии пеш) -потенсиали бофтаҳои гуногунро дар марҳилаҳои гуногун ҳангоми инкишофи чӯҷа тавассути трансплантатсия ба канори берунии минтақаи pellucida, ки ҳуҷайраҳои эпибласт ба эпидерма табдил ёфтаанд (Spratt, 1952 Rosenquist, 1966 Schoenwolf and Sheard, 1990 Bortier ва Вакает, 1992 Гарсия-Мартинес ва дигарон, 1993). Трансплантатсияи гиреҳи Ҳенсен (HH3+/HH4) дар тамоми бластодермаҳо боиси индуксияи сохтори нейроэктодермалӣ бо ифодаи қавии GANF дар канори крании он гардид. Пайванди раванди сари ҷавон (HH4) ба минтақаи паҳлуии краниалии пеллукида боиси ғафсии эпибласт ва индуксияи ифодаи GANF дар ҳуҷайраҳои ҳамҷавор гардид.

Молекулаи махфӣ бо номи "Cerberus", ки дар эндодермаи пешина ифода ёфтааст, дорои хосиятест, ки ҳангоми микроинъекция ба минтақаҳои вентралии Ксенопус ҷанин (Bouwmeester et al., 1996 Bouwmeester, 1997). Тарҳрезии анлали мағзи пеши пешини чӯбро аз зарфи пешакӣ аз ҷониби Пера ва Кессел (1997) тавсиф кардааст. Мувофиқи ин муаллифон, табақи нейронии парранда пеш аз ворид шудани аввалин ҳуҷайраҳои мезодермалӣ ё аксиалӣ ба назар мерасад, ба истиснои плитаи прехордалӣ ва нотохорд ҳамчун манбаъҳои асосии индуксияи асаб. Ҳангоми гаструляцияи барвақт, ҳуҷайраҳо тавассути нӯги рахи афзоянда ворид мешаванд ва ба таври радиатсионӣ паҳн шуда, эндодермаи ниҳоӣ (рӯда)-ро ташкил медиҳанд (Вакает, 1970). Ҳангоми ин васеъшавии радиалӣ, эндодермаи охирини ниҳоӣ эндобласти досро низ радиатсионӣ тела медиҳад (Callebaut and Van Nueten, 1994 Расми 13). Эндобласти доси даврашакли краниалӣ дар зери ҳуҷайраҳои қабати болоӣ меғелад, ки ба анлажи табақи нимкурраи нейронӣ табдил меёбанд (Бортиер ва Вакает, 1992). Ҳуҷайраҳои охирин дар наздикии минтақаи собиқи зидди дос ҷойгир карда шудаанд, маҳз дар каҷравии нимҳилоли эндофилии краналӣ. Эндобласти боқимондаи доси каудалӣ дар қабати боло ҷойгир карда шудааст, ки он боиси минтақаи марказии PS-ташаккулёбанда мегардад. Ин таҳаввулоти гуногун дар минтақаи краналӣ (зидди дос) ва минтақаи марказӣ (centralis) эҳтимолан мумкин аст бо реактивии гуногун дар ин ду минтақаи қабати болоӣ шарҳ дода шавад (Callebaut et al., 2002c).

Набудани индуксияи асаб пас аз таҷрибаҳои пайвандкунӣ бо қабати амиқ дар тамоми бластодермаҳо аз ҷониби Галлера ва Николет (1969) ва Кноетген ва дигарон. (1999а, б) шояд бо мавҷудияти пурраи маводи досили Раубер шарҳ дода шавад. Ин бозёфт инчунин нишон медиҳад, ки хулосаҳои қаблӣ аз таҷрибаҳои пайвандсозӣ дар бластодермаҳои тамоман ношинос (дорои доси Раубер, ташкилкунандаи асосии асосӣ ё дар бластодермаҳои PS, ки гиреҳи Ҳенсен, ташкилкунандаи дуввумдараҷа доранд) бояд аз нав баррасӣ карда шаванд. Аз ин рӯ, мо наметавонем бо ҳеҷ як хулосаи Кноетген ва дигарон розӣ шавем. (1999b), ки эндобласт худ аз худ тағироти ошкоршавандаро дар эктобласти мизбони ҳамсоя пас аз трансплантатсия ба вуҷуд меорад ё ташкилкунандаи парранда танҳо ба гиреҳи Ҳенсен маҳдуд аст. Фоли ва дигарон. (2000) нақши ниҳоии қабати чуқури барвақт (эндофилл ва/ё эндобласти дос) -ро дар ифодаи аломатҳои молекулавии Sox3 (Uwanogho et al., 1995) ва Otx2 (Bally-Cuif et al., 1995) дар қабати болоӣ. Аз Гамбургер ва Гамильтон марҳилаи 6-7, Sox3 махсусан дар тамоми плитаи асаби мурғ ифода карда мешавад ва Otx2 дар тамоми майнаи пеш ва мобайн ифода карда мешавад. Фоли ва дигарон. (2000) дарёфт кард, ки қабати чуқури барвақт марҳилаи гузариши барвақти ифодаи Otx2 ва Sox3 -ро дар қабати болоии ҳамсоя танзим мекунад. Аз ин рӯ, онҳо ба хулосае омаданд, ки қабати амиқи барвақт бофтаи асаб ё майнаи пешро ба таври қатъӣ ба вуҷуд намеорад. Бо вуҷуди ин, таҷрибаҳои трансплантатсияи онҳо на дар доси Раубер - ё порчаҳои бластодерми бе эндобласт, балки дар тамоми бластодермаҳо гузаронида шуданд. Ба наздикӣ, Кнезевич ва Маккем (2001) далелҳоеро пайдо карданд, ки ду ген, ки баъдтар бо ташкилкунандаи гаструла (Gnot-1 ва Gnot-2) алоқаманданд, тавассути сигналҳои қабати амиқ дар ҷанинҳои пешакӣ ба вуҷуд омадаанд. Мувофиқи муаллифони охирин, ин генҳо шояд ташаккули меҳварро дар ҷанини барвақт танзим карда тавонанд, ки он метавонад боиси пайдоиши рах дар қисми ҷудошудаи маркази центис бо эндобласти дос бошад (Callebaut et al., 2003b).


Қисми 3: Рушди барвақти қурбоққа: Чӣ гуна бояд қубур ё дугоникро созад

00: 00: 0708 Ман Ричард Ҳарланд ҳастам.
00: 00: 0808 Ман дар UC Berkeley ҳастам.
00:00:0926 And today I'm going to tell you about the signaling activities that give rise to
00:00:1322 the neural plate, the forerunner of the spinal cord and brain in vertebrate embryos.
00:00:1914 In previous talks, I've talked about the introduction to the Xenopus embryo, why it has some advantages
00:00:2509 for experiments.
00:00:2609 And I've talked about the cell shape changes that have happened in the. in the embryo
00:00:3015 that lead to the three-layered ectoderm/mesoderm/endoderm structure that is the case, the.
00:00:3625 the state at which neural tissue formation happens.
00:00:4120 Let's initially start by just reviewing the classic experiment, the organizer experiment
00:00:4520 done by Hilde Mangold and Hans Spemann.
00:00:4819 And this is the one that really set the stage for what I'm going to talk about.
00:00:5304 In this experiment, they used marked embryos.
00:00:5607 They used newts of different colors: a dark-colored, pigmented newt, and a light-colored newt.
00:01:0104 And what they were. asking the question, what happens if we move pieces of the embryo around?
00:01:0814 Do they differentiate according to how they normally were set up in the embryo?
00:01:1209 It's self-differentiating according to their original fate?
00:01:1502 Or do they adopt the fate of their surroundings?
00:01:1728 Are they told to become the fate of their surroundings?
00:01:2017 Well, there was one particular experiment that was quite spectacular,
00:01:2426 where not only did the cells self-differentiate, but they recruited cells from the rest of the embryo
00:01:3025 to make new structures, the phenomenon of embryonic induction.
00:01:3604 So here, what they did was to take this embryo, here. the dark embryo is the host, and there's
00:01:4212 this paler donor.
00:01:4328 And what they did was to cut out this dorsal lip region from the pale embryo, flip it around,
00:01:5013 and graft it in to the ventral side of the host.
00:01:5318 So, not only does this have its normal organizer side but it has a new piece of dorsal mesoderm
00:01:5904 stuck in the ventral side.
00:02:0028 And what they found was that this was enough to make the embryo twin.
00:02:0602 And that's shown down here in a representation, this particular one done by Andrea Wills,
00:02:1014 who was a student with me.
00:02:1204 So, you can see that there's a normal primary axis with a head with two eyes.
00:02:1619 Then down here, there's a secondary axis, which is fused down at the tail, but it's
00:02:2116 a complete, proper, organized secondary axis.
00:02:2524 Now, the important thing was, since they were using marked issues, they could tell
00:02:3006 what is the contribution of the graft and the host.
00:02:3228 And so here's a. a representation of the section that was made by Hilde Mangold.
00:02:3702 Here's the primary axis, with the tissues that should be familiar to us by now:
00:02:4121 the nervous system, the notochord, and the muscle.
00:02:4510 And here's the secondary axis.
00:02:4626 And there's the pale graft.
00:02:4801 The pale graft invariably contributes just to the midline tissues.
00:02:5215 Here, it's contributing to the notochord and a little bit of the somites.
00:02:5707 Sometimes it would contribute to a bit of the spinal cord.
00:02:5926 But the consistent observation is that it contributes to the midline tissues,
00:03:0420 whereas the bulk of these tissues are recruited from the host: most of the nervous system,
00:03:0810 the muscle, and so on.
00:03:1202 So this graft really must be instructing the surroundings to make this second axis and
00:03:1620 organize it properly.
00:03:1805 Here's a modern equivalent of the experiment, also done by Andrea Wills, where she's
00:03:2216 labeled the donor embryo with a red stain.
00:03:2515 And you can see in this twin, where the two axes have arranged themselves conveniently
00:03:3013 next to each other.
00:03:3117 Here is the red-labelled graft.
00:03:3308 And you can see above it the induced neural tissue.
00:03:3613 So, it's not a phenomenon just of the 1920s, but can be done in the current times.
00:03:4221 Now, I'm really going to emphasize that this induction mechanism was not obvious.
00:03:4714 And in fact, Warren Lewis, who is not as famous as Spemann and Mangold, tried a similar experiment
00:03:5313 earlier than they did.
00:03:5504 But what he concluded -- largely because the embryos were not marked --
00:03:5915 was that the result he was getting was exclusively the result of self-differentiation of the grafted tissue.
00:04:0521 And he couldn't see any induction, because the tissues were not marked.
00:04:0922 And so the bottom line is that he'd. because of this assumption of self-differentiation,
00:04:1506 he missed on the phenomenon of induction.
00:04:1800 And so we remember Spemann and Mangold, and less so Lewis.
00:04:2201 Okay, let's go back to the whole embryo and remind ourselves what we're looking at.
00:04:2713 So, we know from molecular mapping that the organizer is gonna be the top of this
00:04:3323 when it loops around again.
00:04:3428 We're going through gastrulation and neurulation.
00:04:3804 And when we loop around again. here's the organizer up here.
00:04:4013 It's going inside the embryo and is opposed to this neural plate, and is able to
00:04:4615 instruct it to make the neural tissue.
00:04:4907 So again, if we look at this MRI movie, we can see that dorsal mesoderm moving up
00:04:5604 against this overlying neural plate.
00:04:5811 And during this process, where it's opposed to the neural plate, it's in the right place
00:05:0207 to be inducing the neural tissue.
00:05:0407 So, that's the normal organizer that's going up there and is thought to be signaling
00:05:1005 to induce the neural plate.
00:05:1113 Okay, so we're going to discuss this more.
00:05:1501 But we first need to understand how we get to that position.
00:05:1724 And I'm not going to go through this in detail, but I'm going to give a brief summary of the
00:05:2126 initial events that happen to set up the organizer.
00:05:2517 And it comes down largely to the activity of two different signaling pathways: the Nodal/Smad2 pathway
00:05:3221 and the Wnt/beta-catenin pathway.
00:05:3512 We don't need to know about these pathways in detail, but what we do know is the way
00:05:4018 they're turned on in the embryo.
00:05:4224 So initially, when the egg is laid, it's got this axis from animal to vegetal,
00:05:4822 from the pigmented to the yolky side.
00:05:5122 And subsequently it was found that there are a number of pre-localized components in that
00:05:5515 polarized egg.
00:05:5717 And I'm going to talk about this red mRNA, messenger RNA, that's pre-localized,
00:06:0300 called vegt, first described by Mary Lou King's group.
00:06:0612 And there's also, slightly less well-characterized, activators of the Wnt/beta-catenin pathway
00:06:1119 down here.
00:06:1303 So initially, this is cylindrically symmetrical about the animal-vegetal axis.
00:06:1618 And an important process here, as is widespread in embryology, is the symmetry breaking.
00:06:2118 So, you have to go from a cylinder to a bilaterally symmetrical egg.
00:06:2523 And this is achieved during normal development because the sperm is going to enter on one side.
00:06:3213 That makes this giant aster.
00:06:3504 So, these astral microtubules extend throughout the egg cytoplasm during the first cell cycle.
00:06:4115 And not only do they serve to pull the maternal pronucleus towards it, but they also
00:06:4603 serve to bias the way that microtubules polymerize. polymerize in the outside cortex,
00:06:5101 the outer ten-micron layer.
00:06:5313 So as a result of this bias, there's an oriented array of microtubules that go around the embryo,
00:06:5928 here.
00:07:0028 And they act as tracks for carriage via kinesins of some of these purple components.
00:07:0622 There's a selectivity.
00:07:0822 The purple components that activate the Wnt/beta-catenin pathway get smeared out along the
00:07:1413 entire dorsal side of the embryo, whereas the red do not do this.
00:07:1826 They're sort of passively released from the vegetal cortex and spread in a graded way
00:07:2417 through the egg.
00:07:2517 So, we now have a broken symmetry, where we have the red going from vegetal to animal
00:07:2926 and the Wnt/beta-catenin concentrated from dorsal to ventral.
00:07:3504 Now, these two molecules get together and turn on the. the Nodal genes.
00:07:4000 The Nodal genes are signaling proteins in the TGF-beta superfamily.
00:07:4307 And they're turned on in the margin.
00:07:4515 And in normal development, there's a cooperativity between the purple Wnt signal and, now,
00:07:5026 this yellow protein produced from the vegt RNA.
00:07:5409 So, they get together and turn on these Nodal genes.
00:07:5802 And they turn them on at a higher level on the dorsal side and the ventral side.
00:08:0216 But they do turn them on everywhere.
00:08:0500 And these Nodal genes induce mesoderm.
00:08:0710 So, the cells that are initially naive get told, in this marginal zone, to become
00:08:1310 the prospective mesoderm.
00:08:1504 But where this interaction is the strongest -- the strongest interaction of beta-catenin
00:08:1922 and the Nodal gene expression -- that converges on the promoters of organizer gene and
00:08:2512 turns them on, especially in this dorsal region here.
00:08:2822 So, the marginal zone. the mesoderm goes all the way across in the equator,
00:08:3224 but the organizer is special in that it's only turned on at the convergence, the strongest convergence
00:08:3702 of these signals.
00:08:3804 Okay, so we've discussed that.
00:08:4024 And let's just contrast that with what happens if this cortical rotation doesn't occur.
00:08:4701 And so you can see here what. there are various tricks to. to cause this to happen.
00:08:5024 One is to irradiate the vegetal side of the embryo with ultraviolet light.
00:08:5413 And that prevents the polymerization of microtubules.
00:08:5726 The alternative is to eliminate beta-catenin production by using a reagent that
00:09:0209 blocks beta-catenin production.
00:09:0324 We'll come back to that.
00:09:0611 Either way, what happens is that we get the release of the vegt and we get the
00:09:1014 graded vegt protein, which turns on Nodal, but, in the case of the lack of cortical rotation,
00:09:1626 then this purple signal stays down here.
00:09:2001 And so as a result, there is no synergy on this side.
00:09:2225 There's no overlap between the signals.
00:09:2522 And so this whole marginal zone behaves like the ventral marginal zone.
00:09:3008 You get a. a ventralized type of embryo with no organizer.
00:09:3506 Okay, so that symmetry-breaking event back here was important.
00:09:3902 But we're gonna use this trick in the next experiment, that proves that we need organizer signal
00:09:4327 to get the neural plate to be formed.
00:09:4905 Before we go into that, we're just gonna discuss a little bit more about the graded Nodal signaling.
00:09:5327 Because there. a quite widespread view in the field is that this graded Nodal signaling
00:09:5823 is important in setting out the pattern of the marginal zone.
00:10:0217 It seems quite obvious that if there's going to be a graded signal with more on this side
00:10:0620 than that side, it should be used for something.
00:10:0922 So, we're going to get a graded response, and the phospho-Smad2 is the intracellular effector,
00:10:1515 which is known to be distributed like this.
00:10:1804 There really is graded expression of Smad2 going from dorsal to ventral.
00:10:2226 And then this proceeds as a wave across the embryo.
00:10:2505 So, it seems perfectly reasonable to think that in normal development what ought to be
00:10:3002 happening is that that signal will tell the embryo to make different kinds of mesoderm.
00:10:3618 And indeed, that whole idea is supported by this experiment, where we can take,
00:10:4127 from the blastula stage, naive ectoderm from this so-called animal cap and put it in culture.
00:10:4822 By itself, it will self-differentiate into epidermis.
00:10:5125 But if we add a signal, and we can use either Nodal or more conveniently, Activin,
00:10:5619 another member of the TGF-beta superfamily.
00:10:5908 If one adds increasing doses of that Activin signal, the mesoderm-inducing signal,
00:11:0416 one can get caps that develop in a more ventral way, making mesenchyme, whereas as one
00:11:0923 doses in the signal, more and more dorsal tissues, like muscle and ultimately a lot of notochord.
00:11:1519 So, those kinds of experiments, the description of the graded expression, as well as
00:11:2107 this result, where one's reconstructing what may be going on in the embryo, suggest that
00:11:2502 that graded signal may cause pattern.
00:11:2616 But I'm going to argue that's not true.
00:11:2913 So, just to sum up, this normal pattern in the marginal zone -- from notochord through
00:11:3502 muscle, kidney, and blood -- could in principle be set up by that graded Nodal signaling.
00:11:4204 But this was explicitly tested in a series of experiments by Ron Stewart and John Gerhard,
00:11:4724 and other very similar experiments by Jonathan Slack.
00:11:5102 And so what I want to review briefly is this experiment that shows that there's not enough
00:11:5617 information imparted by that early signal to give substantial pattern in the marginal zone.
00:12:0228 Now, what they did. they wanted to assess the effectiveness of organizer grafts.
00:12:0815 And they did this at the late blastula stage.
00:12:1021 So, this is a really early stage, before gastrulation goes on and before there's much to. Он ҷо.
00:12:1522 there certainly is pattern is the marginal zone later on.
00:12:1822 So, they took normal embryos and cut them in half, vertically, so they got two hemispheres.
00:12:2418 And they used that UV irradiation trick.
00:12:2607 So, they had a graft. they were able to graft these -- labeled grafts, of course --
00:12:3220 onto UV-irradiated hosts.
00:12:3320 So, they made this recombinant.
00:12:3611 In this case, the organizer is schematically illustrated in red.
00:12:4005 So, you've got a half organizer here.
00:12:4214 One of their first questions was, if you only put in a right organizer, do you only get
00:12:4612 a right embryo?
00:12:4714 And there are. the answer was no.
00:12:4822 You get a bilaterally symmetrical embryo.
00:12:5101 But also, in many cases this graft will give you a normal tadpole.
00:12:5517 So, you rescue development also, as shown by the lineage tracing experiment,
00:13:0009 from this ventralized half.
00:13:0215 But this is really the key one in my exper. in my view.
00:13:0615 So here, they've cut just 30 degrees off the dorsal midline axis, so they've cut the organizer
00:13:1228 into the right piece, and this piece has no organizer.
00:13:1607 Now, by the model I was discussing earlier, there should be some graded Activin signaling
00:13:2212 or graded. graded Nodal signaling in here that's inducing things like muscle.
00:13:2707 Well, we're gonna ask that question.
00:13:2819 We're gonna take this side and, again, fuse it to a naive ventralized piece,
00:13:3418 put them together, and ask what happens.
00:13:3806 And the result in most cases is there's absolutely no dorsal pattern in the embryo.
00:13:4411 And just to nail this home, I want to stress that.
00:13:4713 So, they're taking this ventralized piece and putting on this piece from a normal embryo
00:13:5305 that lacks just the organizer, but still has that dorsolateral prospective mesoderm
00:13:5714 that would make muscle if it were left alone.
00:14:0002 But in the context of this recombinant, you just get this completely ventralized embryo,
00:14:0518 as opposed to something that would make a little muscle and so on.
00:14:0819 So, this experiment shows I think quite well that the pattern that's induced by
00:14:1423 that graded Activin/Nodal signaling is not enough to have any permanent effect on this tissue.
00:14:2021 And that you actually need the organizer signaling.
00:14:2226 So, that sort of loss of organizer function proves that you need organizer signaling
00:14:2901 in normal development.
00:14:3219 Another is a sort of descriptive view, where we've looked at gene expression at different phases.
00:14:3715 And here's a case where we see two. expression of two different genes.
00:14:4016 This is noggin expressed in the organizer -- we'll come back to that -- and this
00:14:4422 prospective muscle gene, myod, that's expressed in a complementary way, in the non-organizer tissue.
00:14:5020 When it's first turned on, it's turned on fairly uniformly around the rest of the marginal zone.
00:14:5508 Later on, this expression turns off, and this gets enhanced by signaling from the organizer.
00:15:0022 But when it first turns on, it looks like the marginal zone is organized in a binary way.
00:15:0513 Now, this very rapidly changes.
00:15:0625 So, we see expression of genes such as this one, lhx1, that's high in the dorsal marginal zone
00:15:1127 and then graded off to the side.
00:15:1408 So, that's a later stage.
00:15:1524 We also see that with this split, where the blue and the brown genes are expressed
00:15:2010 in complementary domains at the end of the blastula stage, but very quickly become elaborated
00:15:2600 so that the brown gene, Wnt8, is restricted away from the organizer and just in the marginal zone.
00:15:3027 So, things are very dynamic.
00:15:3228 And one really has to look at this early stage to see this binary difference.
00:15:3624 By this stage, this tissue has already been instructed by the organizer to make muscle.
00:15:4125 But anyway, this descriptive experiment does support the idea that initially the marginal zone
00:15:4715 is split in a binary way and is not graded in this induction.
00:15:5017 So again, arguing that you need a signal from the organizer and it's not enough to have
00:15:5500 that graded Nodal signaling.
00:15:5824 This just reinforces that.
00:16:0106 And as that slides up, I'll say that we need. need now to figure out, what are these other signals?
00:16:0801 And at the time, there were a lot of experiments that were done using both cell biology,
00:16:1223 using secreted signals from cells and assaying them in embryos, and many of these signals do have
00:16:1716 important embryonic functions: fibroblast growth factors Nodals, Activins, and so on.
00:16:2318 But the dorsalizing molecules that are made from the organizer were not understood.
00:16:2816 So, how do we find those?
00:16:3027 And here I give much credit to Bill Smith, who's now a professor at UC Santa Barbara,
00:16:3418 who in the early '90s joined me and decided to use an expression cloning approach
00:16:4013 to try to find these molecules.
00:16:4122 And again, he used this trick of ventralizing embryos.
00:16:4513 But at the four-cell stage, he then took synthetic messenger RNAs made from a library.
00:16:5112 This library was a library of gastrula-specific RNAs in a plasmid that could be transcribed
00:16:5618 with this synthetic phage polymerase, SP6 polymerase, so that we could get a library of,
00:17:0204 in the first instance, 100,000 colonies, extract the DNA, and then transcribe
00:17:0820 that whole library of plasmids to make a complex mixture of synthetic RNA that we hoped mimicked
00:17:1315 what was in the embryo.
00:17:1524 Remarkably, that first injection of the synthetic RNA, when it was injected back at the four-cell stage,
00:17:2107 instead of these embryos looking like this -- complete belly pieces as Spemann would
00:17:2525 have called them -- they looked more like this.
00:17:2723 They had some tail structures, some muscle, and spinal cord.
00:17:3107 So, that RNA conferred a morphological rescue.
00:17:3421 At that point, we knew there was an active ingredient in the library, and it was
00:17:3909 just a question of sub-selection, where we would split the library into smaller and smaller pools,
00:17:4400 assaying those pools as we go along, and ask, is there a pool in there that
00:17:4908 confers this ability to dorsalize embryos?
00:17:5219 And sure enough, we. he did this a couple of times.
00:17:5502 The first time, he isolated a Wnt signal, which I won't discuss but is thought to mimic
00:17:5907 that early Wnt signal in dorsalizing the embryos.
00:18:0128 But for the purposes of this presentation, the second one he isolated was really exciting
00:18:0623 because it was completely new.
00:18:0824 And as a single RNA, as you can see in this picture, with increasing dose of the gene
00:18:1324 we called noggin RNA, you get this progressive rescue of structures to the normal state.
00:18:1917 And then when one overdoses the embryo, ultimately you end up with these little noggins,
00:18:2420 these little heads alone.
00:18:2520 So, that. that single RNA is able to transform, from the four-cell stage, a ventralized embryo.
00:18:3023 And if it's put in at enough dose, you get just a big head.
00:18:3604 This has been a very useful assay to isolate a number of other embryological activities,
00:18:4006 but that's the one I want to concentrate on, noggin.
00:18:4310 And so this is an in situ hybridization where we're looking at the messenger RNA
00:18:4810 that's expressed from the noggin gene in early development.
00:18:5100 And so let's look at this stage.
00:18:5319 This is a late blastula.
00:18:5504 Noggin has already turned on.
00:18:5613 And as you can see, it's turned on in just one side of the embryo.
00:18:5909 And we know this is the dorsal side.
00:19:0109 So, this gene is expressed. it not only has the right activity in these messenger
00:19:0614 RNA injections, but it's also expressed in the right place -- here's a vegetal pole view,
00:19:1025 remarkably it's a 60-degree sector, just the same as the sector that Ron Stewart identified
00:19:1622 in his activity assay -- and then in the gastrula stage it continues to be expressed
00:19:2408 in the dorsal marginal zone, in this involuting dorsal mesoderm that is lying just underneath
00:19:2915 the neural plate, and in the right place to induce the neural plate.
00:19:3218 Now, here's a neural. neurula stage where it continues to be expressed in the head,
00:19:3626 mesoderm, and notochord, again, in the right place to continue inducing the neural plate.
00:19:4304 So, the activity is promising, the extra expression is promising, but could we show that it
00:19:4817 had the right properties?
00:19:4924 So, we initially used a protein that we made in CHO cells that Teresa Lamb had transformed
00:19:5523 with noggin plasmids.
00:19:5624 But later in the collaboration with Regeneron Pharmaceuticals, they made a human noggin,
00:20:0210 particularly, Aris Economides, and gave us that recombinant human noggin for our experiments.
00:20:0706 So we were able to ask, now, can noggin protein mimic what we know are the embryological effects
00:20:1317 of grafting this tissue?
00:20:1705 So, again, this is the normal case, where noggin is expressed in this red dorsal mesoderm,
00:20:2218 and potentially instructing this overlying ectoderm to become neural plate.
00:20:2606 But how do we assay that activity?
00:20:2809 Well, again, we turned to our animal cap assay.
00:20:3021 And actually, we can turn to that assay in the gastrula stage, where the sensitivity
00:20:3616 of these cells up here has changed, and they're no longer responsive to the Activin/Nodal signal.
00:20:4402 But we know from recombination experiments that if we graft an organizer onto here
00:20:4903 neural induction will occur.
00:20:5111 So now we can replace the graft of organizer by soaking this tissue in noggin protein.
00:20:5720 And so this is a schematic, which we can do in the late blastula or the gastrula,
00:21:0124 where we take this prospective ectoderm off into culture.
00:21:0503 Normally, just makes a hollow ball of epidermis when left alone.
00:21:0825 As I mentioned before, with. with Activin or Nodal, you get a complex induction of
00:21:1504 dorsal mesodermal cell types.
00:21:1717 And those in turn can secondarily induce neural tissue.
00:21:1926 But the induction is not direct.
00:21:2120 The important thing for our purposes is that, when we treat this just with recombinant noggin,
00:21:2707 we get a clean neural induction.
00:21:2820 There's a little epidermis that's on the outside and an epithelial layer that's not so responsive,
00:21:3405 but all of the underlying cells, here, are trans. transformed into neural cells.
00:21:3809 So, we get a cleaner. clean neural tissue, and that can't be induced by any mesoderm
00:21:4300 because there's no mesoderm in this explant.
00:21:4611 We can also do this as at a time when the mesoderm can no longer be induced.
00:21:5004 So, if we do this at the gastrula stage instead of the late blastula stage, this experiment
00:21:5511 wouldn't work.
00:21:5611 Activin would have no effect.
00:21:5714 And yet noggin can still induce neural tissue.
00:22:0002 So this, then, really identified noggin as an authentic neural inducer, that it's expressed
00:22:0421 in the right place and time, and has the right activity to be doing the job in the normal embryo.
00:22:1117 Here are some pictures of the kind of results that we get.
00:22:1417 These are the works of. these are done by Anne Knecht in the lab.
00:22:1722 And so, here we have a molecular assay for neural tissue.
00:22:2022 This is a gene that's expressed throughout the nervous system.
00:22:2413 And here are some of these explants, the explants that lack noggin, and they don't stain
00:22:2922 for this gene.
00:22:3022 But the parallel explants that were soaked in noggin protein, as you can see, are robustly
00:22:3514 induced to make this marker gene, and so we can say they're neural.
00:22:3805 And that contrasts. again, I'll draw the contrast with the Activin mesoderm inducer.
00:22:4413 Here, we're looking down on the top of the embryo with the muscle and notochord in the middle.
00:22:4819 These are mesodermal structures that we've lit up with this collagen probe.
00:22:5226 If we take explants just like these ones, but treat them with Activin at the late blastula stage,
00:22:5714 we get lots of this mesoderm induced.
00:22:5909 But down here, we see that noggin induces no mesoderm.
00:23:0220 So, we do get neural tissue in the absence of mesoderm, and hence a clean neural induction.
00:23:0804 Just as an interesting side point -- I won't be discussing this much today -- that we
00:23:1315 also have to account for production of the entire neural plate from brain to spinal cord.
00:23:1811 So, what kind of tissue does noggin induce?
00:23:2111 Here we can use regional markers like this cement gland, this very anterior marker,
00:23:2612 or this forebrain-midbrain marker, otx2, and then this engrailed-2 is expressed just
00:23:3123 at the border of the hindbrain.
00:23:3326 And the noggin-treated explants will make these very anterior marker genes.
00:23:3904 they'll turn them on, but they don't turn on the more posterior ones.
00:23:4304 And so noggin, exclusively in this explant situation, induces anterior brain-like tissue.
00:23:5114 So, we have a molecule that works very well, but of course we then had to figure out how it works.
00:23:5820 And so, for this experiment, we for a long time labored under the delusion that
00:24:0220 we may have invented a new kind of signal transducer.
00:24:0600 At the time, it wasn't really appreciated that development gets by with a remarkably
00:24:0914 limited number of pathways.
00:24:1125 And so, here, what eventually turned out, with some very useful information from
00:24:1627 Chip Ferguson's lab, it was suggested that it may be impacting the BMP pathway.
00:24:2201 And Lyle Zimmerman was able to show that, because we had all these reagents in the lab
00:24:2523 at the. at the time.
00:24:2725 And the way that noggin actually works is not by activating any new signal transduction pathway,
00:24:3304 but rather by interfering with the BMP signaling pathway.
00:24:3611 Normally, BMP binds to its two receptors, brings them together, and that has the consequence
00:24:4117 of ventralizing the embryo.
00:24:4325 In this case, when noggin is present, it binds tightly to BMP, prevents this interaction,
00:24:5009 and then by default, instead of being ventralized, the embryo is dorsalized.
00:24:5513 So I'll stress that, that it's the absence of this BMP signal that is instructive to the embryo
00:25:0104 and allows the embryonic structures to make dorsal structures rather than BMP-induced
00:25:0712 ventral structures.
00:25:0901 And satisfyingly, this crystal structure from Jay Groppe shows that noggin, as a dimer,
00:25:1423 sort of embraces the dimer of BMP.
00:25:1626 So, it's not surprising that it, as Lyle Zimmerman showed, prevents the BMP from binding their receptors.
00:25:2606 It's a very high-affinity reaction, as was shown here by this competition experiment.
00:25:2913 And this was done again by Lyle Zimmerman.
00:25:3126 Here took iodinated BMP4 and was able to bind it to a chimeric human noggin, which has an
00:25:3926 immunoglobulin tail which makes it easy to precipitate.
00:25:4303 And so if one simply mixes these together, you get a very active binding and precipitation.
00:25:4916 But by mixing in different doses of different kinds of other TGF-betas, we could work out
00:25:5510 the affinity of this interaction.
00:25:5708 And so, notably, if we take BMP4, the red one, and plot how that interferes
00:26:0214 with binding of iodinated BMP4, we get this nice curve.
00:26:0714 And if we plot the half-maximal inhibition, it comes out that the interaction there is.
00:26:1202 it has a remarkably tight Kd of about 20 picomolar.
00:26:1626 Other BMPs, like BMP7, in blue here, have a lower affinity.
00:26:2305 And then yet other TGF-beta family members, like TGF-beta itself, have no measurable affinity.
00:26:2820 So, there is a variation in affinity, but very tight affinity for the BMP2 and -4 class.
00:26:3500 So, we come up with this general model that in normal development you set up the mesoderm
00:26:4026 with a special dorsal territory, this naive and fairly uniform ventral-lateral territory,
00:26:4626 and the rest of the patterning is mediated during gastrulation by dorsalizing signals
00:26:5128 like noggin that come from the dorsal-marginal zone, instruct the overlying epidermis
00:26:5713 to instead become nervous system, and instruct this ventral mesoderm to become things like muscle.
00:27:0222 So, is that it?
00:27:0420 Really, we've done this by add-back, but what about loss of function?
00:27:0900 And in the interim, a large number of other antagonists were discovered.
00:27:1213 And a lot of these were discovered by Eddy De Robertis' lab, so chordin and cerberus.
00:27:1916 Noggin, we discovered, Bill Smith discovered, as well as this Nodal-3 molecule.
00:27:2422 And follistatin had already been known about, but its activity as a dorsalizing molecule
00:27:2928 was worked out by Ali Brivanlou in Doug Melton's lab.
00:27:3302 So, looking at all these, they're all expressed in the organizer, and they all have some similar
00:27:3911 anti-BMP activities.
00:27:4113 You can see that they turn on at different times.
00:27:4316 This is the early stage, so some are turned on very early.
00:27:4718 And then some are turned on in slightly different territories.
00:27:5004 And perhaps that's important in how they work in detail, but so far, as far as we can tell,
00:27:5424 they all work essentially the same way.
00:27:5617 But there are a lot of them, and they probably have overlapping activity.
00:28:0108 And so if we try to knock down their activity, do we. can we knock down one and get a result,
00:28:0517 or do we have to knock down many?
00:28:0824 To do this experiment, we use morpholino oligonucleotides.
00:28:1114 These are synthetic, uncharged, and very stable oligonucleotides that can hybridize
00:28:1526 to the messenger RNA and interfere with translation, in this case.
00:28:2000 So, we can specifically use the information from base pairing to specifically knock down
00:28:2602 these individual RNAs.
00:28:2720 So, Mustafa Khokha, when he was in the lab, did this experiment using mixtures of morpholinos
00:28:3227 against follistatin, chordin, and noggin.
00:28:3517 And just as a side note, to make this simpler, we did it in the related species to Xenopus laevis,
00:28:4020 Xenopus tropicalis, which now had a sequenced genome, and so we could identify
00:28:4514 and design these oligonucleotides easily to target just single genes rather than two genes
00:28:5003 in the paleotetraploid, Xenopus laevis, genome.
00:28:5419 So, we can inject these morpholinos and then ask what happens.
00:28:5925 And we're going to use, for example, in the neurula stage, this neural marker, which at
00:29:0323 the mid-neurula stage has this nice ability to light up the neural plate.
00:29:1008 Because of worries about specificity of these reagents, which always become toxic if you
00:29:1404 put enough of them in, we do a specificity assay of rescuing.
00:29:1716 So, by cloning the pufferfish noggin, we could use that different sequence to put back BMP-antagonist activity,
00:29:2417 as we'll find out, and rescue the whole process.
00:29:2728 So, these are the kinds of results.
00:29:3009 So, we're going to do single, double, and triple knockdowns.
00:29:3410 And the results are pretty simple.
00:29:3527 When comparing the uninjected to the morpholino-injected, when we knocked down noggin we see no effect.
00:29:4203 Essentially no effect with follistatin.
00:29:4402 Some mild effect, as reported by De Robertis' group, for chordin.
00:29:4716 But then, when we knocked down two -- follistatin/noggin, chordin/noggin, chordin/follistatin --
00:29:5220 we see a more extreme effect.
00:29:5324 There's a smaller neural plate.
00:29:5511 Well, when we knocked down all three, there's a spectacular result, where now, instead of
00:29:5919 making the neural plate, the neural plate is eliminate. eliminated.
00:30:0328 Not only is the neural plate eliminated, but the underlying muscle is almost completely gone.
00:30:0908 And by this hedgehog control, the notochord and the floor plate are also gone.
00:30:1428 So, this is important to rescue.
00:30:1627 We can rescue it with this mixture of morpholinos, rescuing it with the pufferfish noggin.
00:30:2303 And as you see, we get back all of these tissues, demonstrating specificity.
00:30:2817 We can also rescue it by knocking down additional BMPs.
00:30:3206 So, instead of this horrendously high mixture of morpholinos, we're putting in
00:30:3614 even more morpholinos, but also knocking down BMPs.
00:30:3925 And again, you can see that rescue.
00:30:4102 So, we're pretty satisfied that this is a specific manipulation.
00:30:4421 So, knocking down the BMP antagonists eliminates the neural plate.
00:30:4921 You need the antagonists to make the neural plate.
00:30:5327 As we would expect, as you can see on the right of this picture, the loss of those
00:30:5814 dorsal structures is accompanied by a gain in ventrolateral structures.
00:31:0302 So here, for instance, let's. let's look at msx1.
00:31:0522 It's expressed just in the flank.
00:31:0802 But in this manipulated embryo, there's just a narrow stripe left of nonexpressing tissue.
00:31:1306 So, all these ventral tissues are expanded.
00:31:1708 We can also ask, when does this dorsal identity fail?
00:31:2010 When we knock down those antagonists, we clearly lose dorsal structures, but at what step does
00:31:2417 this happen?
00:31:2517 And of course, we would predict that it should fail at the time that normal genes are expressed,
00:31:2906 at the late blastula stage.
00:31:3128 We can start to look at that, and contrast the situation where we interfere with antagonist function
00:31:3802 in normal development, with what happens when we ventralize the embryo from
00:31:4212 the get-go, either with UV light or by depleting beta-catenin, actually also with a beta-catenin
00:31:4727 specific morpholino.
00:31:4902 So, in that case, we lose the beta-catenin purple signal, and we get just this ventralized embryo.
00:31:5611 Okay.
00:31:5711 So, in looking at those, we can see that in the. in the. in the morpholino-knockdown cases,
00:32:0515 where we've knocked down follistatin, chordin, and noggin, we have normal mesoderm,
00:32:0905 as marked by this brachyury gene, but in the case where we look for dorsal identity
00:32:1521 with the goosecoid marker -- here's the control, here's the follistatin/chordin/noggin knockdown --
00:32:2013 there's still dorsal identity.
00:32:2322 Whereas if we contrast that with the beta-catenin knockdown, where we've knocked down
00:32:2705 the early dorsal signal, then of course we never get a dorsal identity.
00:32:3023 So, there's a contrast here, showing that in the absence of the antagonists
00:32:3528 we still get a dorsal identity.
00:32:3713 But then that dorsal identity fails to execute. execute its function.
00:32:4404 And indeed, we can also look at these embryos to ask what happens to BMP signaling.
00:32:4818 And in particular, we can use this useful mark, vent2, because that's normally expressed
00:32:5313 everywhere except the organizer.
00:32:5515 And we also know it's a direct target of BMP signaling.
00:32:5921 So again, when we knock down the follistatin, chordin, and noggin, we see that that gap
00:33:0323 is filled in.
00:33:0508 So in other words, in the absence of the antagonists, there's a sign pretty early on of excess BMP signaling,
00:33:1100 which is going to mess up dorsal developments and lead to a ventralized embryo.
00:33:1519 And again, we get the similar effect, as we would expect, if we eliminate the organizer
00:33:2000 completely with beta-catenin.
00:33:2104 The same result is found with this early muscle marker, which.
00:33:2528 muscle development used to be thought to be development mostly on the graded signal
00:33:2911 from Nodal.
00:33:3011 But you can see here, clearly, that we need that BMP antagonist in order to amplify the
00:33:3506 expression of this muscle determinant in the early embryo.
00:33:3928 So overall, we conclude now that this pathway, of knockdown of BMP activity by these BMP antagonists,
00:33:4726 by a cocktail of BMP antagonists, is crucial to get dorsal development,
00:33:5224 and in order to get neural induction to occur.
00:33:5508 We can show that these molecules by themselves, as protein, induce neural tissue.
00:33:5826 We can show that the combination is essential.
00:34:0127 And they are expressed in the right time and the right place to be ex. executing this function.
00:34:0704 So all in all, it's a comprehensive statement that these are crucial for neural induction
00:34:1303 and dorsal development.
00:34:1513 We can add on the additional observation from the end, that even in the absence of.
00:34:2200 well, in the absence of these antagonists, the early events go by perfectly normal. normally,
00:34:2725 and we get dorsal specification in the marginal zone.
00:34:3108 But in the absence of the antagonists, that organizer can no longer execute its function.
00:34:3621 So all in all, we can conclude then that BMP antagonists are essential for
00:34:4202 the Spemann organizer phenomenon.
00:34:4327 Thank you.

  • Part 1: Early Frog Development: How to Make a Tadpole


Видеоро тамошо кунед: Эмбрион. (Феврал 2023).