Маълумот

10.5: Коркарди рибосомии РНК дар ядроҳои эукариотӣ - Биология


Дар аксари эукариотҳо, як гени калони рРНК дар аксари эукариотҳо транскрипти пешгузаштаи 45S-ро сабт мекунад, ки дорои (аз кӯтоҳтарин то дарозтарин) 5,8S rRNA, 18SrRNA ва 28S rRNA мебошад. 'S' ба маънои Сведберг, биохимик, ки онро таҳия кардааст суръати таҳшиншавӣ ultracentrifugation техникаи ҷудо кардани молекулаҳо ба монанди РНК аз рӯи андоза. Чӣ қадаре ки арзиши S баландтар бошад, молекула калонтар аст ва аз ин рӯ ҳангоми грентенти қанди часпак ҳангоми центрифуга тезтар ҳаракат мекунад. РНК Полимеразаи I рНК -ҳои 45S -ро (preRNAs) аз воҳидҳои сершумори транскрипсияи калони геном (дар зер нишон дода шудааст) транскрипсия мекунад.

Пеш аз rRNA-и 45S бо ҷудошавӣ коркард карда мешавад. Нусхаҳои зиёди (200-400!) гени 45S дар ҳуҷайраҳои эукариотӣ интизор шудан мумкин аст, зеро тавлиди сафедаҳо (ва аз ин рӯ рибосомаҳо) як фаъолияти ҳама истеъмолкунандаи ҳуҷайра хоҳад буд. Дар одамон, генҳои 45S (45S rDNA) дар байни панҷ хромосомаи акроцентрикӣ тақсим карда мешаванд (онҳое, ки центромера дар як канори хромосома хеле наздиканд). 45S rDNA дар хромосомаҳо дар ҳуҷайраҳо печонида мешавад ядро дохили ядроҳо.

Азбаски ин генҳо дар нусхаҳои зиёд мавҷуданд ва дар як минтақаи мушаххаси хроматин ташкил карда шудаанд, имконпазир аст, ки транскрипсияи 45S дар ҷараён дар микрографҳои электронӣ ба монанди генҳои дар поён буда тасаввур карда шавад.

Истилоҳот хасу шампун дар шакли транскрипсия аз шакли генҳои 45S омадааст; РНК-ҳои аз қолаби ДНК дарозшуда монанди хасуи кӯҳнае мебошанд, ки барои тоза кардани дудкаши лампаи керосин истифода мешаванд.

Нусхаҳои сершумори генҳо 5S rRNA-ро рамзгузорӣ мекунанд. Аммо, бар хилофи генҳои 45S rRNA, гени 5S rRNA метавонад дар байни бисёр хромосомаҳо паҳн шавад (ҳафт дар Нейроспора, қолаби нон). Ё дар мавриди одамон, нусхаҳои генҳои 5S РНК дар баробари хромосомаи 1 тақсим карда мешаванд. Генҳои 5S rRNA аз ҷониби РНК полимераза III бо коркарди ҳадди ақали посттранскриптӣ транскрипсия карда мешаванд. Тавре ки дар боло қайд карда шуд, таблиғгарони генҳои 5S на дар болоравии воҳидҳои транскрипсияи 5S, дар қисми транскриптсияи генҳо мебошанд.


10.5: Коркарди РНК рибосомӣ дар ядроҳои эукариотӣ - Биология

Сарфи назар аз афзоиши дониш дар бораи функсия ва сохтори рибосомаҳо ва чӣ гуна зербахшҳои рибосомаҳо дар бактерияҳо дар vitro ҷамъ мешаванд, нақши бисёр сафедаҳои рибосомӣ дар in vivo ҳам дар про- ва ҳам эукариотҳо норавшан боқӣ мемонад. Таҳлили систематикии мо аз протеинҳои рибосомавии хамиртуруш (r-сафедаҳо) -и зербахши хурд нишон дод, ки аксари сафедаҳои эукариотӣ дар биогенези рибосома нақшҳои гуногунро иҷро мекунанд ва онҳоро барои афзоиш ҳатмӣ месозанд. Протеинҳои гуногун марҳилаҳои мухталифи коркарди rRNA-и ҳастаӣ ва ситоплазмиро то 18S назорат мекунанд ва аз ин рӯ, кафолат медиҳанд, ки танҳо рибосомаҳои дуруст ҷамъшуда ба тарҷума машғул мешаванд. Таҳлили муқоисавии таҳлилҳои камолоти динамикӣ ва ҳолати устувор нишон дод, ки барои содироти самараноки ядроии rRNA-и пеш аз 18S якчанд протеинҳо лозиманд, ки онҳо платформаи мутақобиларо бо мошинҳои содиротӣ ташкил медиҳанд. Баръакс, мавҷудияти дигар протеинҳо асосан пеш аз оғози содироти ҳастаӣ талаб карда мешавад. Таҳқиқоти мо дар байни монтажи in vitro, локализатсияи сохторӣ ва функсияи in-vivo-сафедаҳо алоқамандӣ доранд.


Имконоти дастрасӣ

Дастрасии пурраи маҷалларо дар тӯли 1 сол гиред

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.
ААИ баъдтар дар кассир илова карда мешавад.
Ҳисобкунии андоз ҳангоми ҳисобкунӣ анҷом дода мешавад.

Дар ReadCube дастрасии маҳдуд ё пурра ба мақоларо дастрас кунед.

Ҳама нархҳо нархҳои NET мебошанд.


Мавод ва усул

Антиденоҳо ва зондҳои ибтидоӣ

Антиденоҳо бо хусусиятҳои зерин истифода мешуданд: хуноба аутоиммунии инсон, ки ба фибриларин нигаронида шудааст (Гаутье ва дигарон. 1994) зардоби поликлоналии харгӯш, ки ба нуклеолини инсон нигаронида шудааст (як тӯҳфаи C. C. Faucher, LBME, CNRS, Тулуза, Фаронса) як фарҳанги моноклоналӣ супернатант эътироф мекунад X. лаевис протеини нуклеолярӣ NO38, як гомологи протеини нуклеолярии B23 (No-63 Шмидт-Закманн ва дигарон. 1987) ва моеъи моноклоналии асцитҳои муш, X. лаевис Маҷмӯи RNA pol I (тӯҳфаи меҳрубононаи М. Шмидт-Закманн, DKFZ, Ҳайделберг, Олмон).

Санҷиши rDNA барои муайян кардани rRNA ба ҳама мувофиқ аст X. лаевис воҳиди транскрипсияи рибосомӣ ба pBR322 ворид карда шудааст (клони pXcr7, бо меҳрубонӣ аз ҷониби Ф. Амалди, Universito Tor Vergata, Рома, Италия пешниҳод карда шудааст). Мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда бо истифодаи биотин-14-dCTP, санҷишҳои дуқабата ДНК бо маҷмӯаи тарҷумаи ник (GIBCO BRL) нишонгузорӣ карда шуданд. Зондҳо барои муайян кардани U3 ва U8 олигонуклеотидҳои се минтақаро пурра мекунанд (мавқеъҳои 9-31 63-85 ва 101-122 барои U3 ва 33-60 72-93 ва 107-136 барои U8). Онҳо бо биотин-14-dCTP бо истифода аз интиқоли терминали 3 (Boehringer Mannheim) нишонгузорӣ карда шуданд.

Маҷлиси ядроҳо дар X. laevis иқтибос тухм

Тухм аз мода гирифта шуд X. лаевис ва иқтибосҳои тухмии интерфазии пастсуръат тавре ки қаблан тавсиф шуда буданд, омода карда шуданд (Almouzni 1998). Ин истихроҷи хомро дар ях дар тӯли 4 соат нигоҳ доштан мумкин аст, агар он ба таври назаррас коҳиш наёбад. Барҳам хӯрд X. лаевис ядроҳои нутфа бо лизолецитин омода ва гузаранда карда шуданд (Almouzni 1998). Барои ҷамъоварии ҳастаӣ, ба 100 μl иқтибоси тухм 10 5 сарҳои нутфа илова карда шуданд ва дар 23 ଌ нигоҳ дошта шуданд. Пас аз 45 дақиқа, вақте ки деконденсияи максималии ядроҳо ба амал омад, ядроҳо барои микроскопияи фотонӣ ва электронӣ коркард карда шуданд.

Тайёр кардани ядроҳои ҷанинӣ аз X. laevis

Ҷанинҳо тавассути бордоркунии in vitro (Алмоузни ва Вулфф 1995) истеҳсол карда шуданд ва иҷозат доданд, ки дар ҳарорати 23 ° C дар маҳлули 0,1 7 тағирёфтаи Барт (Гурдон ва Викенс 1983) барои вақтҳои гуногун пас аз бордоршавӣ инкишоф диҳанд. Дар ин ҳарорат, ҷанинҳо дар марҳилаҳои зерин ҷамъоварӣ мешуданд: бластулаи барвақт, 6 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 8) мидбластула, 7 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 8.5) бластулаи дер, 9 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 9) гаструлаи барвақт, 10 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 10) гаструла, 11 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 10.5) ва гаструлаи дер, 13 соат пас аз бордоршавӣ (марҳилаи 12), ки аз ҷониби Ниувкооп ва Фабер 1994 нишон дода шудааст. рушд. Азбаски диссоциатсияи бластомерҳо барои дастрасии маводи мухаддир лозим буд, ҷанинҳо 3 соат 30 дақиқа пас аз бордоршавӣ ба муҳити озоди Ca 2+ ва Mg 2+ интиқол дода шуданд, ки дорои 88 мм NaCl, 1 мм KCl, 2,4 мм NaHCO3ва 7.5 мм Tris HCl, pH 7.6, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд (Дувал ва дигарон. 1990). Актиномицин D (Sigma Chemical Co.) ба муҳити инкубатсия дар консентратсияи дилхоҳ аз маҳлули саҳҳомӣ дар 5 мг/мл илова карда шуд. Ҳамчун назорат, ҷанинҳо дар Ca 2+-ва Mg 2+ -и озод бе актиномицин D. инкубатсия карда мешуданд. Chemical Co.) ҳамчун ингибиторҳои транскрипсия дар X. лаевис ҷанинҳо. Вақте ки α-аманитин ба муҳити инкубатсионӣ илова карда шуд, он ба бластомерҳои ҷудошуда ворид нашуд ва DRB ба тақсимоти ҷанинҳо таъсири бад расонд. Суспензияҳои ядроҳои ҷанин аз ҷанинҳое, ки дар вақтҳои дақиқ пас аз бордоршавӣ гирифта шудаанд, тавре тавсиф карда шудаанд, омода карда шуданд (Verheggen et al. 1998).

Иммунофлуоресценция ва гибридизатсия дар ҷой

Дар in vitro ядроҳои барқароршуда ва суспензияҳои ядроҳои ҷанин бо 1 ҳаҷми 4% параформалдегид дар PBS собит карда шуданд. Суспензияҳои ядроҳои собитро метавон якчанд ҳафта дар 4 ଌ нигоҳ дошт. Барои таҳқиқоти иммунофлуоресцентӣ ва гибридизатсия дар ҷои худ, ядроҳо ба пӯшиш центрифуга карда шуданд. Пас аз шустан, пӯшишҳои гуногун дар метанол пасификс карда шуданд, дар 0,1% Triton X-100 (IBI) дар PBS гузаронанд ва шуста шуданд.

Барои тамғагузории иммунофлуоресценсия, пӯшишҳо бо антителоҳои аввалия инкубатсия карда шуданд, пас аз он антителоҳои дуввуми FITC ё TRITC-конъюгацияшуда (анти-инсон, зидди муш ё зидди харгӯш IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories) ё антителаҳои зидди муши cy3-conjugated (Sigma) Chemical Co.), шуста, бо DAPI (4 & # x02032-6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride Polysciences, Inc.) бо ранг карда шудааст ва бо маҳлули зидди пажмурдашуда (Citifluor) васл карда шудааст.

Гибридизатсияи in situ rRNAs пас аз иммунобелинг, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, анҷом дода шуд (Verheggen et al. 1998). Омехтаи гибридизатсияи rRNA дорои 40% формамид (GIBCO BRL), 10% (ваз/ҳаҷм) сулфат декстран (Sigma Chemical Co.), 50 нг/μl ДНК-и тестҳои лососои соникалӣ (Sigma Chemical Co.) ва rDNA-и биотинилшуда буд. санҷиш то консентратсияи ниҳоии 1 ng/μl дар 2 × SSC фасод карда мешавад. Барои ошкор кардани U3 ва U8, омехтаи гибридизатсия дорои 30% формамид, 10% (wt/vol) декстран сульфат, 50 ng/μl озмоишҳои лососии лососии ДНК ва 3 ′ ба олигонуклеотидҳои иловагии U3 ва U8 мебошанд то консентратсияи ниҳоии 2 нг / μl дар 2× SSC иловашуда. Ҳамчун назорат барои муайян кардани РНК, гибридизатсияро ҳазми RNase тавре ки тавсиф шудааст, пешбарӣ карда шуд (Highett et al. 1993).

Микроскопияи электронӣ

Нитрусҳои барқароршуда дар vitro бо 2% глутаральдегид дар буферии 0,1 М какодилати натрий, pH 7.4, дар 4 ଌ собит карда шуданд. Онҳо дар буферии какодилат шуста шуданд, ки дар 1% OsO ҷойгир карда шуданд4 барои 1 соат дар 4 ଌ, дар спирт хушк карда шудааст ва дар Epon 812 ҷойгир карда шудааст. Қисмҳои ултратин бо ацетати уранил дар давоми 1 соат ва цитрати сурб дар давоми 2 дақиқа муқоиса карда шуда, дар микроскопи электронии Philips EM412 муоина карда шуданд.

Таҳлили транскрипт дар Situ

Барои маҳаллисозии сайтҳои транскрипсия, воридкунии 5-бромуридин-5 ′-трифосфат (Br-UTP) ба ядроҳои ҷанинӣ тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, иҷро карда шуд (Verheggen et al. 1998). Хулоса, ядроҳои ғайримуқаррарӣ гузаранда шуданд ва дар буфери транскрипсия дар ҳузури Br-UTP барои 20 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуданд (Массон ва дигарон 1996). Пеш аз иммунолабелинг, ядроҳо бо 2% параформалдегид дар PBS собит карда шуданд ва бо 0.1% Тритон X-100 гузаранда шуданд. Як антитело моноклоналии зидди 𠄻r-deoxyuridine, ки он инчунин Br-UTP (Boehringer Mannheim) -ро эътироф мекунад, истифода шуд. Антителоҳои антифибрилярини инсон ҳамчун маркери ядроӣ истифода мешуданд. Сигналҳои транскрипсия ва фибрилярин бо истифода аз антиденаҳои бузҳои зидди FITC-и муш ва TRITC-и бузи зидди антиденаҳои инсон (Labatories ImmunoResearch Jackson) ба даст оварда шуданд.

Микроскопияи оптикӣ

Тасвирҳо бо микроскопи эпифлюоресцентии Leica, ки бо камераи дастгоҳи бо заряд пайвастшудаи CCD (Leica) муҷаҳҳаз шудааст, гирифта шудаанд. Тасвирҳои хокистарӣ дар алоҳидагӣ бо маҷмӯаҳои филтр барои FITC ва родамин/TRITC бо истифода аз линзаҳои обкашии нафт ҷамъ оварда шуданд (63 ×, нақшаи NA I.4 Apochromat). Тасвирҳои хокистарранг бо истифода аз нармафзори Adobe Photoshop 5.0 псевдокоранг ва якҷоя карда шуданд.


Ҷойгиркунии RNA

5.2 Манзараи транскриптӣ: РНК-ҳои танзимкунанда

пайдарпайии амиқ мақсаднок метавонад ба муайян кардани дақиқи молекулаҳои хурд ва калонтар РНК аз маконҳои гуногуни геномӣ дар намудҳои гуногуни ҳуҷайра оварда расонад. Шиносоии намудҳои гуногуни молекулаҳои РНК ба транскриптом дараҷаи баланди мураккабӣ медиҳад. Манзараи транскрипсияи ҳайвоноти ширхӯр бо генҳо ифода карда мешавад, ки синфҳои гуногуни молекулаҳои РНК-ро ифода мекунанд, аз ҷумла РНК-ҳои рибосомӣ, РНК-ҳои интиқол, РНК-ҳои паёмнависӣ, РНК-ҳои хурди ядроӣ, РНК-ҳои хурди ядроӣ, РНК-ҳои дарози коднашаванда, микроРНКҳо, РНК-ҳои бо ҳамтаъсири PIWI, промоутерҳо. РНКҳо, РНКҳои ташаббускори транскрипсия ва РНКҳои ҷуфтшавӣ (расми 5.1).

Расми 5.1. Намоиши графикии РНКҳои рамзгузоришаванда ва ғайримоддӣ дар манзараи транскриптологии ширхӯрон.

Таърихан молекулаҳои РНК ҳамчун молекулаҳои оддӣ, фосилавӣ байни генҳо ва сафедаҳо ҳисобида мешуданд. Messenger RNA ё mRNA молекулаи аз ҳама васеъ омӯхташудаи РНК мебошад. Он ҳамчун қолаби муваққатӣ амал мекунад ва тавассути коди генетикӣ мустақиман ба сафедаҳо тарҷума мешавад. Трансфер РНК (tRNA) ҳамчун молекулаи адаптер амал мекунад, дар ҳоле ки РНК-и рибосомӣ (rRNA, ки асосан дар ҳама ҳуҷайраҳо ифода ёфтааст) платформаро ҳангоми синтези сафедаҳо таъмин мекунад. Таҳқиқоти умумиҷаҳонӣ мавҷудияти РНКҳои танзимшавандаро берун аз ҳудуди маълуми генҳои протеиндор, ки онтогенезии одамро назорат мекунанд, нишон доданд.

Синфҳои нави РНК-ҳои хурди умумӣ (snRNAs) баъдтар дар ядро ​​тавассути фраксияи биохимиявӣ муайян карда шуданд. Бисёре аз ин РНКҳо ҳамчун як қисми комплексҳои рибонуклеопротеин (RNP) муайян карда мешаванд. Яке аз синфҳои snRNAs ҳамчун РНКҳои сплицеосомӣ муайян карда мешаванд, ки дар пайвастшавии РНК нақши марказиро мебозанд. Ин snRNA -ҳо U2, U4, U5 ва U6 -ро дар бар мегиранд ва маълуманд, ки дар муомилоти РНК -РНК ва РНК -сафеда иштирок мекунанд. Эътироф кардани макони пайвасти 5' ва нуқтаи шоха мутаносибан U1 ва U2, пас аз ҷалби U4, U5 ва U6, ҷойивазкунии U1 ва ҳамкорӣ бо U2 (тавассути U6), инчунин сайтҳои 5' ва 3'Splice (тавассути) U5) баъзе аз вазифаҳои калидӣ ҳангоми ҷамъшавӣ ва функсияҳои спликосомаҳо мебошанд. U11, U12, U4atac ва U6atac ҳамчун snRNA-ҳои камшумор муайян карда мешаванд ва дар баробари U5 дар як варианти "хурд" сплицеосомаи навъи U12 (Wang and Burge, 2008) нақш доранд. РНКҳои хурди нуклеолярӣ (сноРНКҳо), ки дар нуклеолус ҷойгир шудаанд, барои тағир додани кимиёвии рРНК, тРНК ва сНРНК муайян карда мешаванд. Тағироти кимиёвӣ аслан барои камолоти tRNA ва mRNA ва ҳангоми ҷудошавии пеш аз мРНК талаб карда мешаванд (тағир додани U2 snRNA талаб карда мешавад) ва ба ин васила вазифаҳои муқаррарии рибосомалӣ ва ҳуҷайраҳоро нигоҳ медоранд. Синфи snoRNAs, зеркласси қуттии H/ACA, барои роҳнамоии псевдодидилятсия тафтиш карда мешавад, дар ҳоле ки зеркласси C/D барои роҳнамоии метилизатсияи рРНКҳо, тРНКҳо ва сНРНКҳо маълум аст (Ҳенрас ва дигарон, 2004 Мейер, 2005). Вайрон кардани функсияҳои snoRNAs боиси гум шудани коркарди 5,8S, 18S ва 28S (ё 25S дар растаниҳо) rRNAs мегардад. Дигар sRNA-ҳо, ки бо номи РНК-ҳои хурди бадани Кажал (scaRNAs) маъруфанд, дар сохторҳои зери ядрои бо номи ҷасадҳои Кажал мавҷуданд, ки барои коркарди теломеразаи РНК маълуманд.

Як синфи дигари РНКҳои хурд, ки бо номи микроРНК (miRNAs) -и дарозии 20-24 нуклеотид маъруфанд, тарҷумаро бозмедорад ва таназзули мРНКҳои ҳадафро тавассути ташкили ҷуфткунии заминаи нокомил бо 3ʹUTR -ҳои мРНКҳои мақсаднок суръат мебахшад. Ин miRNA-ҳо метавонанд миқдори зиёди mRNA-ҳои мавриди ҳадафро танзим кунанд ва ба таври мутақобила, бисёре аз mRNA-ҳо сайтҳои мавриди ҳадафро барои миқдори зиёди miRNA-ҳо дар бар мегиранд ва ба ин васила бисёр равандҳои физиологӣ, рушд ва бемориро назорат/танзим мекунанд (Гарг, 2015). Мисли miRNA, РНКҳои хурди халалдоркунанда (siRNAs) РНКҳои рамзкунон нестанд, ки ба андозаи миРНК монанданд. Ҳарду синфҳои молекулаҳо ифодаи генро тавассути хомӯш кардани mRNA-ҳои мақсаднок ба таври посттранскриптӣ танзим мекунанд. Бо вуҷуди ин, siRNAҳо бо як mRNA ҳадаф хосанд, дар ҳоле ки miRNAs ҳадафҳои сершумор доранд. Дроша, Дисер ва якчанд сафедаҳои Argonaute (AGO), генҳо ва ферментҳои асосӣ дар биогенези прекурсорҳои dsRNA иштирок мекунанд. Ҷудошавии прекурсорҳои dsRNA ва содироти он аз ядро ​​ба ситоплазма тавассути Дроша ва Экспортин-5 миёнаравӣ карда, пас аз коркарди минбаъдаи он аз ҷониби Дисер ба қисмҳои хурди дуқабараи РНК сурат мегирад. Як риштаи dsRNA (21-24 нуклеотид) ба сафедаҳои AGO комплекси хомӯшии аз ҷониби РНК (RISC) боршуда бор карда мешавад. RISC бо риштаҳои хурди РНК ба ҳадафҳои иловагии РНК барои фишор/нооромии тарҷумавии он роҳнамоӣ карда мешавад (Зенг ва дигарон, 2003 Гарг, 2015). Зербанди сафедаҳои AGO бо номи PIWI (асосан дар ядро ​​мавҷуд аст) ва сафедаҳои ба PIWI монанд бо синфи дигари РНК, ки бо RNAs-ҳои мутақобилаи PIWI (piRNAs) маълуманд, алоқаманданд. piRNAs хурд (26-30-нуклеотид) РНК мебошанд ва тавассути хомӯш кардани транспозонҳо дар ҳуҷайраҳои ҳомила аз ҷиҳати эпигенетикӣ ва пас аз транскрипт нақши муҳими танзимкунанда мебозанд (Гирард ва дигарон, 2006). РНК-ҳои ибтидоии транскрипсия (tiRNAs) ва РНК-ҳои макони пайвастшавӣ (spliRNAs) дарозии 17-18 нуклеотид мебошанд ва дар ҳайвонот мавҷуданд, аммо на дар растаниҳо. Ин синфҳои РНКҳои хурд, тиРНКҳо ва сплиРНКҳо мутаносибан бо оғози сайтҳои транскрипсия ва ҷудошавӣ алоқаманданд. Пайдоиш ва вазифаҳои онҳо пурра муайян карда нашудаанд, аммо ба онҳо тавсия дода мешавад, ки дар танзими омилҳои ҳатмии CCCTC (CTCF) хроматин ва ҷойгиршавии нуклеосома нақш бозанд. Дигар синфҳои РНК-ҳои камтар фарқкунанда транскриптҳои болооб (PROMPTS), РНКҳои кӯтоҳе, ки бо промоутерҳо алоқаманданд (PASRs) ва РНКҳои бо сайт алоқамандро оғоз мекунанд (TSSa-RNAs), ки метавонанд дар хомӯш кардани генҳои транскрипционии РНК нақш дошта бошанд (Капранов) ва дигарон, 2007 Хан ва дигарон, 2007).

Як синфи дигари ҷолиби РНКҳои дарозмуддати рамзкунонӣ (lncRNAs) РНКҳои протеинро рамзкушоянд. Онҳо полипадилизатсия нашудаанд, тақрибан 200 нуклеотид доранд ва дар байни геногенҳо ҷойгиранд (инчунин бо номи РНК-и калони рамзии байнисоҳавии [lincRNA] маъруфанд), интроникӣ ва антиссенс ба генҳои протеинбандӣ (Мерсер ва дигарон, 2009). Локие, ки lncRNA-ро ифода мекунанд, сохтори индикативии хроматин, нигоҳдории промоутер ва танзимро аз ҷониби морфогенҳои анъанавӣ ва омилҳои транскрипсия нишон медиҳанд (Ҷонсон ва дигарон, 2014). Азнавсозии хроматин, танзими равандҳои эпигенетикӣ (ҷуброни вояи хромосомаи X ва чопи волидайн), назорати транскриптӣ ва коркарди пас аз трансляциявӣ вазифаҳои муҳими ба онҳо гузошташуда мебошанд. Таҳқиқоти ба фарҳанги ҳуҷайра асосёфта вазифаҳои онҳоро дар рушди ретиналӣ ва эритроид, тафриқаи эпидермалӣ, рушди сина, танзими апоптоз ва метастазҳо ва бисёр равандҳои дигар муайян мекунанд (Conesa et al., 2016).

Блотинги шимолӣ ва PCR-и миқдорӣ усулҳои гузариши паст мебошанд ва барои муайян кардани миқдори як транскрипт маҳдуданд. Усулҳои микроарраи ба гибридизатсия асосёфта ҳарчанд маҳсулнокии баланд ва технологияҳои арзон барои миқёси геномии ифодаи генҳо мебошанд, аммо як қатор маҳдудиятҳо доранд, аз ҷумла: маълумот дар бораи пайдарпаии пурсидашаванда ва (iii) пайдоиши артефактҳои гибридизатсионӣ ҳангоми таҳлили пайдарпаии ба ҳам монанд (Shendure, 2008). Аз тарафи дигар, усулҳои пайдарпайӣ муайянкунии мустақими пайдарпайии транскриптро таъмин мекунанд. Насли китобхонаҳои барчаспҳои пайдарпай (EST) ва усули қатъи занҷири дидеокси секвенсияи Сангери ДНК -и иловагӣ (cDNA) як усули пасти интиқоли транскриптҳо мебошад. Усулҳои ба барчасб асосёфта, ба монанди таҳлили силсилавии ифодаи генҳо (SAGE) ва ифодаи генҳои таҳлили ҳадди ақал (CAGE), як қатор пайдарпаии барчаспҳоро муайян мекунанд ва дақиқиро зиёд мекунанд, аммо онҳо ифодаи изофорҳои ҷуфтшударо миқдор карда наметавонанд. Секвенсияи насли оянда (NGS) пайдарпаии гузариши баланди cDNA буда, таҳлили пурраи РНК-ро таъмин мекунад ва транскриптомикаро инқилоб кардааст (Ванг ва дигарон, 2009).


Усулҳо

Хатҳои ҳуҷайра

Медуллобластомаи инсон (DAOY HTB-186 ATCC), adenocarcinoma шуши одам (A549 тӯҳфа аз Р. Рэндалл, Донишгоҳи Сент Эндрюс, Британияи Кабир) ва Веро (Маркази биологияи гурдаи сабзи маймун, CAS, CZ) дар Миёнаи глюкозаи пасти DMEM бо 10% хуноба гови ҳомила (FBS), 1% антибиотик-антимикотикҳо (амфотерицин В 0,25 мкг/мл, пенициллин G 100 адад/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) ва 1% L-аланил-L -глутамин. Хатти ҳуҷайраи DAOY HTB-186 аз медуллобластомаи цесмопелярии десмопластикии марди 4-солаи қафқозӣ гирифта шудааст [36]. A549s аз бофтаи саратони шуш (ҳуҷайраҳои эпителиалии базалии алвеолярӣ) як марди 58-солаи қафқозӣ [37] гирифта шудааст. Ҳуҷайраҳои веро аз ҳуҷайраҳои эпителиалии гурда аз маймуни сабзи африқоӣ (Этиопияи Cercopithecus). Ҳуҷайраҳои PS (гурдаи хуки устувор) дар муҳити L15 бо 3% хунобаи гӯсолаи навзод (NCS), 1% антибиотикҳо-антимикотикҳо ва 1% L-аланил-L-глутамин парвариш карда шуданд [38]. Хатти ҳуҷайраҳои остеосаркомаи инсон MG-63 (Sigma-Aldrich) дар муҳити RPMI 1640 парвариш карда шуд, ки бо 10% FBS, 1% антибиотикҳо-антимикотикҳо, 1% L-аланил-L-глутамин ва 50 нМ β-меркаптоэтанол илова карда шудааст. Инҳо аз як ҷавони 14-солаи қафқозӣ шарҳ дода шудаанд [39].

Барои таҷрибаҳои тамғагузории метаболикӣ, ҳама хатҳои ҳуҷайра дар муҳити RPMI 1640 парвариш карда шуданд, ки бо 10% FBS, 1% антибиотикҳо-антимикотикҳо, 1% L-аланил-L-глутамин ва 50 nM β-меркаптоэтанол илова карда шудаанд. Ҳама хатҳои ҳуҷайра дар 37 ° C ва 5% CO парвариш карда шуданд2 ба истиснои ҳуҷайраҳои PS (37 ° C бе CO -и иловагӣ2).

Трансфексия ва плазмидҳо

PolyJet Дар Vitro Реагенти трансфексионӣ (SignaGen #SL100688) барои интиқол истифода шудааст. Тартиб тибқи протоколи истеҳсолкунанда сурат гирифтааст. Барои GFP ва Ренилла ифодаи люцифераза, мутаносибан векторҳои ифодаи ширхӯрон phMGFP (Promega) ва pRL-CMV (Promega) истифода шуданд. Вектори ифодаи ширхӯрон wt viperin як тӯҳфаи меҳрубон аз Лиза Ф.П. Ng (Шабакаи иммунологии Сингапур, Агентии илм, технология ва тадқиқот (A* STAR), Сингапур), ки дар он гени виперин бо теги C-терминали c-myc таҳти назорати промоутер CMV транскрипт карда мешавад [40].

Вирусҳо ва сироятҳо

Ду намояндаи зернавбати TBEV-и Ғарбӣ-Европаи дорои дараҷаҳои гуногуни вирулентӣ истифода шуданд – миёна (Neudoerfl) ва вазнин (Hypr). Ҳарду штамм аз рӯи пайдарпайии рамзгузории худ танҳо бо 12 ивазкунандаи аминокислотаҳои ғайриконсервативӣ [41] ва дарозӣ ва сохтори 3´UTR [42] фарқ мекунанд. Вақте ки мушҳо ба таври периферӣ сироят ёфтанд, штамми Hypr нейроинвазивии возеҳ нишон дод ва зинда мондани кӯтоҳтар аз штамми Neudoerfl [41] -ро ба вуҷуд овард. Штамми пасти TBEV, Neudoerfl (гузаргоҳи чаҳорум дар мағзи мушҳои ширхӯрда мағзи ҳамроҳшавии GenBank рақами TEU27495), аз ҷониби профессор F.X. Ҳайнц (Донишгоҳи тиббии Вена, Австрия) [43]. Гузариши пасти TBEV, Hypr (гузаргоҳи чорум дар мағзи мушҳои ширхӯрдаи мағзи сар дар GenBank, рақами TEU39292), дар Институти Паразитология, Маркази Биологияи CAS, Ческе Будёжовичи Ҷумҳурии Чех дастрас аст [44]. Вирусҳо дар шароити бехатарии биологии дараҷаи 3 коркард карда шуданд.

TBEV ба ҳуҷайраҳо як рӯз пас аз кишт илова карда шуд. Пас аз он ҳуҷайраҳо дар давоми 2 соат инкубатсия карда мешуданд, бо PBS шуста мешуданд ва ниҳоят муҳити нави пешакӣ гармшуда илова карда мешуд. Таваққуфи майна аз мушҳои ширхӯрдаи сироятнашуда ҳамчун назорати манфӣ истифода шудааст.

Титркунии вирусҳо

Титрҳои вирусӣ тавассути таҳлили лавҳа, тавре ки тавсиф шудааст [45], бо тағиротҳои хурд муайян карда шуданд. Хулоса, якқабатаи ҳуҷайраҳои PS (9х10 4 ячейка дар як чоҳ) дар зарринҳои 24-чоҳ парвариш карда шуданд ва бо 10x разрядҳои силсилавии намунаҳои сироятӣ дар давоми 4 соат дар 37 ° C инкубатсия карда шуданд. Пас аз он намунаҳо бо омехтаи қабати 1: 1 (v/v) (карбоксиметил целлюлоза ва муҳити 2х L15, аз ҷумла 6% NCS, 2% антибиотикҳо-антимикотикҳо ва 2% L-глутамин) пӯшонида шуданд. Пас аз панҷ рӯз, миёнарав бо қабати боло бардошта шуд, ҳуҷайраҳо бо маҳлули физиологӣ шуста, баъдан собит карда шуданд ва (0,1% сиёҳи нафталин дар маҳлули 6% кислотаи сирко) барои 45 дақиқа ранг карда шуданд. Плиткаҳои тавлидшудаи вирус ҳисоб карда шуданд ва титрҳо ҳамчун PFU/мл нишон дода шудаанд.

Антиденоҳо ва реагентҳо

Антиденоҳои аввалияи зерин истифода шуданд: антитело поликлоналии зидди TBEV C (дар дохили хона истеҳсолшуда), антителои поликлоналии зидди TBEV NS3 (тӯҳфаи хайрхоҳона аз доктор М. Блум, NIAID, ИМА), антителои поликлоналии зидди HPRT1 (Thermo Fisher) Илмӣ #PA5-22281), Антителоҳои зидди GAPDH [EPR16891] (Abcam #ab181602), Антиденои моноклоналӣ ба Виперини муш (Hycult Biotech #HM1016), зидди NPM1 антителоҳои моноклоналӣ FC-61991 (Thermo Fisher #601), ва зидди POLR1A Антидено (Abcam #ab222065). Антиденаҳои дуюмдараҷа/сеюмҳои зерин истифода шуданд: HRP Бузи зидди Гвинея (Novex #A18769), HRP харгӯш зидди мурғ IgY (H+L) антитело дуюмдараҷа (Thermo Fisher Scientific #A16130), HRP Антиденаи зидди муш IgG ( VectorLabs #PI-2000), Антиденои зидди харгӯш IgG HRP буз (VectorLabs #PI-1000), Антиденои биотинилшудаи зидди стрептавидин (VectorLabs #BA-0500), Стрептавидини AP-конъюгацияшуда (VectorLabs #SA-5100), Streptavidin-DyLight 549 (VectorLabs Cat#SA-5549), Буз зидди харгӯш IgG-DyLight 594 (Abcam #ab96897), Буз зидди Гвинеяи хуки DyLight 594 (Abcam #ab150188) ва буз зидди Chicken IgY (IgY H&Lightcam #) ab96947).

L-azidohomoalanine (Click Chemistry Tools #1066–25) ва 5-этинил-уридин (Click Chemistry Tools #1261-25) мутаносибан барои тамғагузории метаболикии сафедаҳои пайдошуда ё РНК истифода шуданд. Biotin-PEG4-Alkyne (Click Chemistry Tools #TA105-25) ва Biotin Picolyl Azide (Click Chemistry Tools #1167–25) мутаносибан барои ошкор кардани L-азидохомоаланин ё 5-этинил-уридин дохил карда шуданд. Циклогексид аз Sigma-Oldrich (# 01810-1G) харида шудааст.

Таҳлили ситометрияи ҷараён

Ҳуҷайраҳои DAOY як рӯз пеш аз сироят дар зарфи 12 чоҳ дар зичии 2,5 × 10 5 ҳуҷайра/чоҳ кошта шуданд. Дар фосилаҳои вақти нишондодашуда пас аз сирояти TBEV, ҳуҷайраҳо бо PBS шуста, трипсинизатсия карда шуданд ва бо 4% параформальдегид дар PBS (Рот) собит карда шуданд. Пас аз гузарониш (0.1% Triton X-100), ҳуҷайраҳо бо истифода аз антителоҳои хуки гвинеяи зидди TBEV C (1: 1500 разм) ва антигвиниаи хуки DyLight 594 (1: 500 разбива) антителоҳои дуввум ранг карда шуданд. Цитометрияи ҷараён дар як цитометраи FACS Canto II гузаронида шуд ва маълумот бо истифода аз нармафзори FACS DIVA v. 5.0 (BD Bioscience) таҳлил карда шуд.

Изолятсияи РНК

РНК-и умумии ҳуҷайравӣ бо истифода аз реагенти RNA Blue дар асоси Trizol (Top-Bio #R013) мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда ҷудо карда шуд. Пеллетҳои РНК дар оби тозашудаи DEPC гудохта шуда, бевосита дар вақти воқеии ПТР ё таҳлил дар гели денатуратори РНК истифода мешуданд.

Миқдори rRNA

Миқдор ва беайбии rRNA дар намунаҳои умумии РНК дар як биоанализатор 2100 бо истифода аз маҷмӯаи Agilent RNA 6000 Nano (Agilent Technologies #5067-1511) таҳлил карда шуд. Консентратсияи ҳар як намуна пеш аз андозагирии биоанализер ба таври спектрофотометрӣ муайян карда шуд ва намунаҳо мувофиқи таносуби шумораи ҳуҷайраҳо (консентратсияи натиҷа дар байни 10-20 нг/мкл) ҳал карда шуданд. 1 мкл намунаҳои ҳалшудаи РНК ба чипи Bioanalyzer бор карда шуда, мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда санҷиши электрофоретикӣ анҷом дода шуд. Ҳама намунаҳо дар се нусхаи техникӣ таҳлил карда шуданд. Барои фраксияи РНК-и ҷудошуда 1.2% гели денатуратсияи агарозаи MOPS-буферӣ (бо 6,7% формальдегид) истифода шудааст. РНК бо илова кардани рангҳои GelRed (Biotium) ба гел тасаввур карда шуд. Сигнал баъдан бо истифода аз нармафзори Фиҷи миқдори муайян карда шуд.

Намунаи стандартизатсия

Мо мушоҳида кардем, ки қобилияти ҳаёти ҳуҷайраҳои сироятшудаи TBEV Hypr дар 36 ва 48 соати p.i. таъсири манфӣ расонидааст. (расми 1D). Аз ин рӯ, бо мақсади коҳиш додани таъсири ин падида ба маълумоти мо, мо тасмим гирифтем, ки дар таҷрибаҳои худ ҳисобкунии ҳуҷайраҳоро стандартӣ кунем.

Ҳуҷайраҳои DAOY бо TBEV Neudoerfl ё штамми Hypr (MOI 5) сироят ёфтаанд. (A) Титрҳои вирусӣ (дар хатҳои тамоюл нишон дода шудаанд), ки бо таҳлили лавҳаи ҳуҷайраҳои PS ва суръати сироят (дар сутунҳо нишон дода шудаанд), ки бо муайянкунии ҷараёни ситометрии ҳуҷайраҳои доғдоршудаи TBEV C дар 12, 18, 24, 36, 48 муайян карда шудаанд соат пи Хулосаи графикии се таҷрибаҳои мустақил бо арзишҳо ҳамчун миёна бо SEM нишон дода шудааст. $B) Њамагї РНК дар 24 ва 48 соати p.i ҷудо карда шуд. ва миқдории нисбии qPCR -и TBEV gRNA бо истифода аз Δ-cт усули бо нормализатсияи рақами ҳуҷайра анҷом дода шуд. Маълумот ҷамъбасти се таҷрибаҳои мустақил мебошанд ва арзишҳо дар графикҳо ҳамчун миёна бо SEM ифода карда мешаванд. (C) Сатҳи сафедаҳои TBEV NS3 ва C дар ҳуҷайраҳои сироятшудаи DAOY тавассути иммуноблоттинг дар соатҳои 12, 18, 24, 36, 48 муайян карда шуданд. Маълумот хулосаи се таҷрибаи мустақил мебошанд. (D) Зиндагии ҳуҷайраҳои сироятёфта бо ёрии реагенти аламарБлюз, дар фосилаи вақти нишондодашуда муайян карда шуд. Маълумот хулосаи се таҷрибаи мустақил аст ва арзишҳо ҳамчун SEM ифода карда мешаванд, ки барои масхара кардани ҳуҷайраҳои сироятшуда муқаррар карда шудаанд, фарқияти назаррас аз назорат тавассути t-озмоиши ҷудошудаи донишҷӯ ҳисоб карда шудааст (** P & lt0.01 *** P & lt0.001).

Нормализатсия ба рақамҳои ҳуҷайра барои таҳлили вақти воқеии ПТР, блоттинги ғарбӣ, блоттинги шимолӣ ва метаболизм гузаронида шуд. Барои ин, мо бо истифода аз реагенти alamarBlue як усули ба ҳаёт асосёфтаро таъсис додем (Thermo Fisher Scientific #DAL1025). Маълумоти мо нишон медиҳад, ки ченкунии қобилият ба рақами ячейка мустақиман мутаносиб аст ва аз ин рӯ ин усул барои ба эътидол овардани рақами ячейка комилан мувофиқ аст (Расми S1). Тартиб мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда анҷом дода шуд. Ба таври мухтасар, ҳуҷайраҳо бо PBS шуста шуданд ва муҳити тару тозаи пеш аз гармшуда бо реагенти иловакардаи alamarBlue илова карда шуд (таносуби 1:10 ҳаҷм). Ҳуҷайраҳо барои 2-2,5 соат инкубатсия карда шуданд ва флуорессенсияи маҳсулоти камшуда дар хонандаи плитаи BioTek (λ) чен карда шуд.собиқ = 550 нм λэм = 590 нм). Миёнаи афзоиш бо alamarBlue бе ҳуҷайраҳо ҳамчун варақ истифода шудааст. Ҳама намунаҳо дар се нусхаи техникӣ таҳлил карда шуданд. Арзишҳои миёнаи флуоресценсия барои намунаи бо TBEV муолиҷашуда ба ҳуҷайраҳои назорати масхара дахлдор муқаррар карда шуданд. Омили қобилиятнокӣ (f) баъдан ҳамчун омили нормализатсия барои ҳисобкунии вуруди РНК/протеин дар асоси вуруди назорати пешакӣ сохта шуда буд.

QPCR дар вақти воқеӣ

Барои таҳлили qPCR дар вақти воқеӣ, KAPA SYBR FAST Universal Universal One-Step qRT-PCR тибқи протоколи истеҳсолкунанда истифода шудааст. Маълумоти гирифташуда тавассути миқдории нисбӣ бо истифода аз дельта в коркард карда шудт (Δ-cт) усул миқдори РНК ба ҷои рақами ҳуҷайра танзим карда шудт арзишҳои гени истинод ба хона. Ҳама намунаҳо бо dsDNase коркард карда шуданд ва баъдан 5 × пеш аз таҳлили вақти воқеии ПТР дар оби бидуни РНК тоза карда шуданд. Ҳама намунаҳо дар се нусхаи техникӣ таҳлил карда шуданд. Рӯйхати праймерҳои истифодашударо дар ҷадвали S1 пайдо кардан мумкин аст.

Блотинги ғарбӣ

Ҳуҷайраҳо бо PBS ва буфери RIPA шуста шуданд (25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% дезоксихолати натрий) бо ингибиторҳои протеаз (Thermo Fisher Scientific № 783) илова карда шуданд. Лизиси ҳуҷайраҳо дар тӯли 15 дақиқа дар ях ҳангоми мулоим ларзиш анҷом дода шуд. Лизатҳои протеини sonicated ва тозашуда дар буферии RIPA дар 12% денатуратсиякунакҳои полиакриламид ҷудо карда шуда, ба мембранаҳои PVDF пошида мешаванд. Миқдори сафедаҳо ба рақами ҳуҷайра муқаррар карда шуд. Мембранаҳо баста шуданд (5% шири сӯзонидашуда дар PBS-T) ва бо антителоҳои аввалия, дуввум ва алтернативии сеюм дар байни ҳар як марҳилаи рангкунӣ инкубатсия карда шуданд, мембранаҳо дар PBS-T се маротиба шуста шуданд. Антиденоҳои ибтидоии истифодашуда хуки гвинеяи зидди C (дар дохили хона истеҳсол карда мешаванд 1:1500), мурғ зидди NS3 (лабораторияи М. Блум 1:5000), харгӯш зидди GAPDH (Abcam 1:1000), зидди HPRT1 (Термо Фишер) буданд. Илмӣ 1: 500), зидди виперин (Hycult Biotech 1: 500). Антиденоҳои дуввум/сеюм истифодашаванда HRP зидди харгӯшҳои буз (VectorLabs 1: 1000), HRP зидди мурғ (Thermo Fisher Scientific 1: 1000) ва HRP зидди муши асп (VectorLabs 1: 1000) буданд. Сигнали химилюминесцент бо истифода аз маҷмӯаи Novex CDP-Star барои фосфатазаи сілтӣ (Thermo Fisher Scientific) ё маҷмӯаи WesternBright Quantum барои пероксидази асп (Advansta #K-12042-D20) таҳия карда шуд. Сипас сигнал бо истифода аз нармафзори Фиджи миқдор карда шуд [46]. Барои ҷудо кардани антителоҳо, мембранаҳо бо маҳлули рахнакунӣ (62,5 mM Tris HCl pH 6,8, 2% SDS, 0,8% β-меркаптоэтанол) барои 45 дақиқа дар 50 ° C инкуб карда шуданд. Баъдан, мембранаҳо шаш маротиба бо PBS ба таври васеъ шуста шуданд. Пас аз ин, мембранаҳо баста шуданд ва иммуностаинг боз тавре ки дар боло тавсиф карда шуд, гузаронида шуд.

Таҳлили люцифераза

Барои таҳлилҳои Ренилла фаъолияти люцифераза дар ҳуҷайраҳои табобати CHX, Ренилла Люсиферазаи таҳлили маҷмӯа аз Promega (#E2810) мувофиқи дастури истеҳсолкунанда истифода шудааст. Хулоса, 5 × 10 4 ҳуҷайраҳои DAOY дар як чоҳ дар табақи 96-чоҳ тухмипошак карда шуданд. Ҳуҷайраҳоро бо 100 нг вектори pRL-CMV дар як чоҳ бо истифода аз реагенти трансфексияи PolyJet трансфексия карда, бо сиклогексимид (50-300 мкг/мл) дар давоми 2, 4, 6, 14 ва 24 соат инкубатсия карданд. At 24 hours post-transfection, the viability of cells was measured using alamarBlue. Subsequently, cells were lysed and Renilla luciferase activity was determined.

Metabolic labelling of де нав synthesised proteins

Cells were seeded in 6-well plates at a density of 1×10 6 (Vero, A549) or 5×10 5 (DAOY, MG-63) cells per well. At indicated time intervals p.i., cells were washed with PBS and starved for 1 hour by addition of complete methionine-free RPMI medium (methionine-free RPMI medium containing 10% FBS, 1% L-alanyl-L-glutamine, 1% antibiotics/antimycotics, and 0.27 mM L-cystine). Subsequently, fresh complete methionine-free RPMI medium was added with 50 μM L-azidohomoalanine (AHA) and 1× AlamarBlue reagent. Metabolic labelling with AHA was performed for 2 hours. Afterwards, cell viability was measured as described earlier. Cells were then washed with PBS and lysed on ice for 15 minutes in 200 μl RIPA buffer with protease inhibitors (Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail Thermo Fisher Scientific). Lysates were separated on 12% polyacrylamide gels and transferred by electroblotting onto the PVDF membrane. The quantity of proteins loaded onto the gel was normalised to the cell numbers. Subsequently, the modified detection method Click-on-membrane was performed according to Kočová et al. (in preparation). Briefly, membranes were washed in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 and the Click reaction was performed as follows: membranes were incubated in Click reaction buffer (0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 with 0.25 mM sodium ascorbate, 0.5 mM THPTA, 0.1 mM CuSO4, and 10 μM biotin-alkyne) for 1 hour in the dark at room temperature. Membranes were washed three times with PBS, blocked (5% skimmed milk in PBS-T) and incubated with primary (AP-streptavidin VectorLabs 1:500), secondary (biotinylated anti-streptavidin VectorLabs 1:1000) and tertiary antibodies (AP-streptavidin VectorLabs 1:2000). Between each staining step, membranes were washed three times in PBS-T. Chemiluminescence signal was developed using Novex CDP-Star kit (Invitrogen #WP20002). Signal was subsequently quantified using Fiji software [46].

Metabolic labelling of де нав synthesised RNA

DAOY cells were seeded in 6-well plates at a density of 5×10 5 cells per well. At the indicated time intervals p.i., 5-ethynyl uridine (5-EU) was added to the cells (final concentration of 5-EU was 1 mM) as well as alamarBlue reagent. Metabolic labelling with 5-EU was performed for 2 hours. Cell viability was measured as described earlier. Cells were then washed with PBS and lysed using RNA Blue reagent. Total RNA was isolated according to the manufacturer’s instructions. Next, RNA was separated in MOPS-buffered denaturing gel, as described above. The quantity of RNA was normalised to the cell number. Capillary blotting of RNA to the PVDF membrane (GE Healthcare) using 20× SSC buffering system was performed afterwards. Subsequently, the modified detection method Click-on-membrane was performed according to the method described by Kočová et. ал. (in preparation). Briefly, the UV-fixed membrane was washed in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 and the Click reaction on membrane was performed as follows: membranes were incubated in Click reaction buffer (0.1 M potassium phosphate buffer pH 7.0 with 0.25 mM sodium ascorbate, 0.5 mM THPTA, 0.1 mM CuSO4, and 10 μM picolyl biotin azide) for 1 hour in the dark at room temperature. Blocking and triple labelling using biotin-streptavidin system was performed as described above. The chemiluminescence signal was developed using Novex CDP-Star kit (Invitrogen #WP20002), and signal was subsequently quantified using Fiji software [46].

Иммунофлуоресцент

DAOY cells were seeded in chamber slides (0,3 cm 2 /well 5×10 3 cells/well) and at the indicated time intervals p.i. processed as previously described [47]. Rabbit anti-POLR1A (Abcam 1:200) and chicken anti-NS3 (a kind gift from Dr. M. Bloom, NIAID, NIH 1:5000) antibodies were used. As the secondary antibodies, anti-rabbit DyLight 594 (Abcam 1:500) and anti-chicken DyLight 488 (Abcam 1:500), were used. In the case of metabolic labelling of nascent RNA, the Click reaction was performed дар ҷой before the blocking step. 10 μM Picolyl biotin azide was used for the detection of incorporated 5-EU. For subsequent fluorescent labelling, streptavidin conjugated with DyLight 549 was used (VectorLabs 1:500). Slides were eventually mounted in Vectashield mounting medium (VectorLabs). The Olympus Fluoview FV10i confocal microscope was used for imaging and subsequent export of images was done in FV10-ASW software (v.1.7).

Statistical analyses

All statistical analyses were performed in MS Excel using one-sample two-tailed Studentʼs t-test. Only in case of qPCR analysis of over-expressed viperin and GFP, an unpaired two-tailed Student’s t-test was used. In this case, datasets were first tested for the equality of variances by F-test. If the experiment was performed in technical replicates, the statistics was performed using the means of the independent biological replicates.


Иқтибосҳо

Kennedy, S., Wang, D. & Ruvkun, G. A conserved siRNA-degrading RNase negatively regulates RNA interference in C. elegans. Табиат 427, 645–649 (2004).

Buhler, M., Mohn, F., Stalder, L. & Muhlemann, O. Transcriptional silencing of nonsense codon-containing immunoglobulin minigenes. Мол. Ҳуҷайра 18, 307–317 (2005).

Buhler, M., Verdel, A. & Moazed, D. Tethering RITS to a nascent transcript initiates RNAi- and heterochromatin-dependent gene silencing. Ҳуҷайра 125, 873–886 (2006).

Iida, T., Kawaguchi, R. & Nakayama, J. Conserved ribonuclease, Eri1, negatively regulates heterochromatin assembly in fission yeast. Курр. Биол. 16, 1459–1464 (2006).

Cheng, Y. & Patel, D.J. Crystallographic structure of the nuclease domain of 3′hExo, a DEDDh family member, bound to rAMP. J. Mol. Биол. 343, 305–312 (2004).

Dominski, Z., Yang, X.C., Kaygun, H., Dadlez, M. & Marzluff, W.F. A 3′ exonuclease that specifically interacts with the 3′ end of histone mRNA. Mol. Ҳуҷайра 12, 295–305 (2003).

Timmons, L. Endogenous inhibitors of RNA interference in Элегантҳои Caenorhabditis. Bioessays 26, 715–718 (2004).

Duchaine, T.F. ва дигарон. Functional proteomics reveals the biochemical niche of C. elegans DCR-1 in multiple small-RNA-mediated pathways. Ҳуҷайра 124, 343–354 (2006).

Lee, R.C., Hammell, C.M. & Ambros, V. Interacting endogenous and exogenous RNAi pathways in Элегантҳои Caenorhabditis. RNA 12, 589–597 (2006).

Gabel, H.W. & Ruvkun, G. The exonuclease ERI-1 has a conserved dual role in 5.8S rRNA processing and RNAi. Нат. Сохтор. Мол. Биол. advance online publication, doi:10.1038/nsmb.1411 (27 April 2008).

Yang, X.C., Purdy, M., Marzluff, W.F. & Dominski, Z. Characterization of 3′hExo, a 3′ exonuclease specifically interacting with the 3′ end of histone mRNA. J. Biol. Chem. 281, 30447–30454 (2006).

Moore, P.B. & Steitz, T.A. The involvement of RNA in ribosome function. Табиат 418, 229–235 (2002).

Lecompte, O., Ripp, R., Thierry, J.C., Moras, D. & Poch, O. Comparative analysis of ribosomal proteins in complete genomes: an example of reductive evolution at the domain scale. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 30, 5382–5390 (2002).

Cote, C.A., Greer, C.L. & Peculis, B.A. Dynamic conformational model for the role of ITS2 in pre-rRNA processing in yeast. RNA 8, 786–797 (2002).

Joseph, N., Krauskopf, E., Vera, M.I. & Michot, B. Ribosomal internal transcribed spacer 2 (ITS2) exhibits a common core of secondary structure in vertebrates and yeast. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 27, 4533–4540 (1999).

Yeh, L.C. & Lee, J.C. Structural analysis of the internal transcribed spacer 2 of the precursor ribosomal RNA from Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Биол. 211, 699–712 (1990).

Chen, F.W. & Ioannou, Y.A. Ribosomal proteins in cell proliferation and apoptosis. Int. Rev. Immunol. 18, 429–448 (1999).

Lambertsson, A. The minute genes in Дрозофила and their molecular functions. Adv. Генет. 38, 69–134 (1998).

Fukuda, T. et al. DEAD-box RNA helicase subunits of the Drosha complex are required for processing of rRNA and a subset of microRNAs. Нат. Ҳуҷайраҳои биол. 9, 604–611 (2007).

Oliver, E.R., Saunders, T.L., Tarle, S.A. & Glaser, T. Ribosomal protein L24 defect in belly spot and tail (Bst), a mouse Minute. Инкишоф 131, 3907–3920 (2004).

Draptchinskaia, N. et al. The gene encoding ribosomal protein S19 is mutated in Diamond-Blackfan anaemia. Нат. Генет. 21, 169–175 (1999).

Fatica, A. & Tollervey, D. Making ribosomes. Курр. Андеша. Ҳуҷайраҳои биол. 14, 313–318 (2002).

Pillai, R.S. ва дигарон. Inhibition of translational initiation by Let-7 microRNA in human cells. Илм 309, 1573–1576 (2005).

Thermann, R. & Hentze, M.W. Дрозофила miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation. Табиат 447, 875–878 (2007).

Faber, A.W., Van Dijk, M., Raue, H.A. & Vos, J.C. Ngl2p is a Ccr4p-like RNA nuclease essential for the final step in 3′-end processing of 5.8S rRNA in Saccharomyces cerevisiae. RNA 8, 1095–1101 (2002).

Mitchell, P., Petfalski, E., Shevchenko, A., Mann, M. & Tollervey, D. The exosome: a conserved eukaryotic RNA processing complex containing multiple 3′ → 5′ exoribonucleases. Ҳуҷайра 91, 457–466 (1997).

Allmang, C. et al. The yeast exosome and human PM-Scl are related complexes of 3′ → 5′ exonucleases. Genes Dev. 13, 2148–2158 (1999).

Briggs, M.W., Burkard, K.T. & Butler, J.S. Rrp6p, the yeast homologue of the human PM-Scl 100-kDa autoantigen, is essential for efficient 5.8 S rRNA 3′ end formation. J. Biol. Chem. 273, 13255–13263 (1998).

van Hoof, A., Lennertz, P. & Parker, R. Three conserved members of the RNase D family have unique and overlapping functions in the processing of 5S, 5.8S, U4, U5, RNase MRP and RNase P RNAs in yeast. EMBO Ҷ. 19, 1357–1365 (2000).

Denli, A.M., Tops, B.B., Plasterk, R.H., Ketting, R.F. & Hannon, G.J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Табиат 432, 231–235 (2004).

Gregory, R.I. et al. The Microprocessor complex mediates the genesis of microRNAs. Табиат 432, 235–240 (2004).

Wu, H., Xu, H., Miraglia, L.J. & Crooke, S.T. Human RNase III is a 160-kDa protein involved in preribosomal RNA processing. J. Biol. Chem. 275, 36957–36965 (2000).

Jalal, C., Uhlmann-Schiffler, H. & Stahl, H. Redundant role of DEAD box proteins p68 (Ddx5) and p72/p82 (Ddx17) in ribosome biogenesis and cell proliferation. Кислотаҳои нуклеинӣ Res. 35, 3590–3601 (2007).

Lau, N.C., Lim, L.P., Weinstein, E.G. & Bartel, D.P. An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Элегантҳои Caenorhabditis. Илм 294, 858–862 (2001).


Extended Data Fig. 1 Tor2 promotes MTREC-dependent facultative heterochromatin assembly and gametogenic gene silencing.

а ва б, ChIP-chip analyses of H3K9me2 at MTREC-dependent (а) and MTREC-independent (б) heterochromatin islands. в, ChIP-chip analysis of H3K9me2 distribution at cen1. г, RNA-seq analyses of pir1, red1, ва mtl1 expression in the indicated strains at 30 °C. д, RNA-seq expression profiles of gametogenic gene transcripts at 30 °C. е, Composite plot showing the median expression level of a common set of 327 upregulated genes in WT and red1∆ cells grown in rich media at 30 °C. For ChIP-chip and RNA-seq, data representative of two independent experiments are presented.

Extended Data Fig. 2 Phosphorylation by Tor2/TORC1 stabilizes Pir1.

а, Immunopurified fractions from cells expressing untagged or GFP-tagged Pir1 (left) and FLAG-tagged Tor2 (right) were subjected to mass spectrometry. The total PSM and coverage for the identified proteins is shown. б, Multiple sequence alignment of С. помбе proteins Pir1 and Red1 against human ZFC3H1 was performed using Macaw sequence alignment workbench. Pir1 aligns with ZFC3H1 in their shared serine/proline rich region. Thick rectangles indicate segments of best alignment and dotted lines indicate gaps. Alignments for two conserved regions are shown in detail. The serines that are phosphorylated in Pir1 are labelled with orange triangles. S285 is in a conserved motif which is underlined in red. Mass spectrometry results are from a single experiment. в, Phosphorylation of Xpress-tagged recombinant WT Pir1 and mutant Pir1 with 12 serines (S215, S233, S237, S248, S265, S285, S299, S303, S325, S334, S434, S503) substituted with alanine by the FLAG–Tor2 complex was detected using anti-thiophosphate-ester antibody. г, Western blot analysis of GFP–Pir1 in the indicated strains at 30 °C. 12 SD, 12 serines replaced by aspartic acid. д, Western blot analysis of Red1 in the indicated strains at 30 °C. SD, serine285 replaced by aspartic acid. Барои в-д, two independent experiments were performed with similar results. Source data are provided.

Extended Data Fig. 3 Pir1 degradation by Ubi4 and Cul4–Ddb1 impacts gene silencing.

а, Western blot analysis of GFP–Pir1 in tor2 + cells carrying pir1-WT, pir1-SD ё pir1-SA аллел Cells were cultured in rich medium at 30 °C SD, serine285 replaced by aspartic acid SA, serine285 replaced by alanine. б, Western blot analysis of Pir1 in strains grown at 30 °C with or without nitrogen (+N/–N). в, IF of Pir1 in the indicated strains at 30 °C. г, Serial dilutions of the indicated strains were spotted onto rich medium (YEA) and low adenine (YE) plates, and then incubated at 30 °C for 3 days. Дар spd1∆ was introduced to suppress the growth defect of cul4∆ ва ddb1∆ мутантҳо. д, RNA-seq expression profiles of sme2 ва mei2 transcripts in the indicated strains at 30 °C. е, Serial dilutions of the indicated strains were spotted and incubated as described in г. g, RNA-seq analysis of MTREC regulon gene expression in the indicated homothallic strains at 30 °C. Барои а-g, data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.

Extended Data Fig. 4 Defects in the assembly of MTREC-dependent heterochromatin islands observed in tor2-ts6 can be suppressed by ubi4∆ ё ddb1∆.

а, ChIP-chip analysis of H3K9me2 distribution at MTREC-dependent islands in the indicated strains. б, ChIP-chip analysis of H3K9me2 at MTREC-dependent heterochromatin islands in WT, tor2-ts6, tor2-ts6 ubi4∆, ва tor2-ts6 ddb1∆ cells at 30 °C. Heterochromatin island numbers correspond to those described previously 15 . The number of plus signs (+) indicates the relative level of detected H3K9me2. The minus sign (–) denotes a lack of detectable H3K9me2. Genomic coordinates correspond to the С. помбе genome assembly v2.29. Data representative of two independent ChIP-chip experiments are shown.

Extended Data Fig. 5 Pir1 prevents untimely gene expression in suboptimal conditions.

а, Genes within the ‘meiotic coding’ and ‘non-meiotic coding’ groups in Fig. 4c were categorized separately based on GO biological process. б, Growth curves of WT and pir1∆ cells cultured in rich or minimal medium at 26 °C. Optical density (OD) at 595 nm wavelength is plotted. Data representative of two independent experiments are shown. в, Percent cell death was determined by methylene blue staining of cells grown on minimal medium at 26 °C. Two independent experiments were performed with similar results. г, Heatmap of log2 fold changes in expression in WT and pir1∆ cells grown in minimal or rich medium relative to WT cells grown in rich medium at 30 °C. Transcripts were clustered based on their function. ‘n’ indicates number of loci in each category. Data representative of two independent experiments are presented. д, Schematic depicting how fluctuations in gametogenic gene expression, which occur upon changes in growth conditions, are controlled by MTREC–Pir1. е, Serial dilutions of the indicated strains were spotted onto rich medium and incubated at the indicated temperature for 3-4 days. Two independent experiments were performed with similar results. Source data are provided.

Extended Data Fig. 6 Synchronized meiosis system.

а, Flowchart of pat1-as2 induced synchronized meiosis. б, Progression of meiosis was monitored by fluorescence microscopy to determine the number of nuclei per cell in samples collected at the indicated time points after the addition of 1-NM-PP1. Two independent experiments were performed with similar results. в, RT–qPCR analysis of meiotic gene expression. Samples were collected at the indicated time points. Two independent experiments were performed with similar results. г, Heatmap of log2 fold changes in expression relative to vegetative cells for synchronized meiotic cells, as determined by RNA-seq analyses. Clusters are grouped by expression pattern and only transcripts with peak log2 fold changes that were ≥1.5 were assigned to a group. Data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.

Extended Data Fig. 7 Temporal control of gene expression by Pir1 and MTREC during meiotic progression.

а, The MTREC regulon genes grouped according to their function in meiosis. The expression peak was determined from RNA-seq analysis of the synchronized meiosis system. See also Supplementary Table 7. б, RNA-seq analysis of MTREC regulon gene expression in the indicated strains. Data representative of two independent experiments are shown. в, ChIP-chip analysis of meiotic DSBs (Rec12–DNA linkages) across chromosome 1 and 3 in cells expressing WT Pir1 or Pir1-SD protein. Data representative of two independent ChIP-chip experiments are shown.

Extended Data Fig. 8 Tor2 targets RNA elimination machinery to sustain cell proliferation and gametogenesis.

а, Line plots showing the mean log2 fold change in expression of MTREC regulon transcripts in WT, pir1Δ, ва red1Δ мутантҳо. б, Heatmap of log2 fold changes in expression of additional MTREC regulon genes relative to WT vegetative cells in WT, pir1∆, ва red1∆. Data representative of two independent experiments are shown. Source data are provided.


Муқаддима

Recent technological developments have enabled single cell studies at the level of genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics (1,2). For example, next generation sequencing technology allows unbiased and comprehensive sequencing of RNA from single cells (3𠄵). These pioneering studies have revealed cellular heterogeneity and stochastic gene expression at the single-cell level, which are overseen in analyses on cell populations. Such single cell variations can be caused by differences in cell-cycle phase, developmental stage, local signaling concentrations, transcriptional bursting or genetic alterations.

The first single-cell proteomics studies were performed using fluorescent reporter proteins. These studies all reported noise in the expression of the reporters (6𠄸). In a more recent pioneering study, a library of yeast strains containing over 2500 endogenously green fluorescent protein (GFP)-tagged proteins (9) was used to measure single-cell protein abundance of these genes. This study revealed that stochastic protein expression upon environmental changes is specific to particular gene classes (10). However, generating comprehensive libraries of endogenously tagged proteins is very labor intensive and impractical for higher eukaryotes. Recently, mass cytometry emerged as a novel technology to study the absolute abundance of proteins in single cells without the need to tag proteins but using endogenous antibodies to which heavy metals are coupled. This method currently allows quantifying up to 32 cellular proteins at the single-cell level in a single experiment (11,12). During the last decade, mass spectrometry-based proteomics emerged as a powerful tool to study the cellular proteome in an unbiased and comprehensive manner (13,14). The current state-of-the-art allows characterizing proteomes to substantial depth from as little as 10.000 mammalian somatic cells. Comprehensive mass spectrometry-based analyses of single mammalian cells is not yet feasible with current instrumentation and methods. Certain cells types, however, contain much more protein. Examples include oocytes or eggs which are several orders of magnitude larger than somatic cells.

Солҳои зиёд, Xenopus embryos have been used to study early vertebrate development, elucidating key principles of gene regulation, cellular signaling, patterning and morphogenesis (15). Sequencing and assembly of the Xenopus tropicalis genome revealed a very good synteny with the human genome and has allowed characterizing chromatin state and transcription factor binding associated with the maternal to zygotic transition, mesoderm induction and gastrulation (16�). It also allowed to uncover embryonic transcriptome dynamics and identify patterns of transcript adenylation and deadenylation (20�). Due to the less complete genome annotation of Xenopus laevis, genome-wide transcriptome analyses have been more difficult (23,24). Coincidently, single X. laevis eggs contain enough protein for global mass spectrometry-based proteomic analyses.

Developmental processes are known to be tightly controlled, but it is currently unknown to what extent stochastic gene expression plays a role from the beginning of embryogenesis. Here, we present a comprehensive absolute proteome of multiple fertilized X. laevis eggs and compare it to both single egg transcriptomes and single gastrula stage embryonic proteomes. The single egg and single gastrula proteomes are both tightly controlled, thus revealing a reduced role for stochastic effects at the beginning of vertebrate development. Developmental dynamics at the protein level are not reflected well by changes at the mRNA level, thus emphasizing the importance of using mass spectrometry-based proteomics to study early embryogenesis.


Хулосахо

The above data support the formation of multifaceted initiation complexes for executing co-transcriptional processing of tRNA in human cells (Fig. 2). But why it matters to coordinate and couple processing with transcription for biosynthesis of tRNA? The human genome has > 500 tRNA genes, the majority of which are mapped in six chromosomes [ [158] ]. More than half of these genes are arranged in repeats on chromosomes 1 and 6. The tRNA gene cluster in chromosome 6 resides in a genetic region that constitutes a transcription hotspot opposing the extended major histocompatibility class I locus [ [158] ]. Remarkably, the tRNA gene cluster in chromosome 1 is transcribed as individual short transcripts and not as long polycistronic transcripts [ [159] ]. Therefore, the arrangement of tRNA genes in the human genome is nonrandom and necessitates a tethering regulatory mechanism in the nucleus. In this regard, it has been shown that there are

2000 foci of Pol III in the nucleus of a dividing HeLa cell and that each focus has

5 active polymerases [ [99] ]. Since these polymerases are supposed to act through facilitated recycling mode (one gene–one committed polymerase), it is plausible that several tRNA genes be clustered and transcribed in a focus, in which enzymes tethered to each other by assembling massive transcription complexes [ [99] ], possibly like the one described in Fig. 2. A similar clustering of rRNA gene repeats positioned in distinct chromosomes takes place in nucleolar organizer regions that aid in coordinating transcription and processing of the new transcripts [ [160] ]. In the budding yeast, tRNA genes are not arranged in tandem repeats, but they do cluster in the nucleolus that hosts RNase P and Pol III [ [88, 89] ]. But can Pol III carry out co-transcriptional processing, as this polymerase lacks a motif similar to the CTD shown to enable Pol II to recruit processing factors? In fact, the presence of a domain such as the CTD is not a prerequisite for coordinated transcription and processing of all RNAs. Thus, Pol I, which lacks this domain, facilitates partial co-transcriptional cleavages of precursor rRNA in the nucleolus, as described above. Additionally, the length of a precursor transcript is not a limiting factor for having co-transcriptional processing at one or more sites. Two classes of short RNAs, small nuclear RNAs and small nucleolar RNAs, are transcribed by Pol II and processed via co-transcriptional cleavage at the 3′ and 5′ end, respectively [ [161-164] ]. Accordingly, co-transcriptional processing of tRNA is possible and it matters for having high enzyme specificity and productivity in order to supply the cell with large amounts of mature tRNAs needed for growth and proliferation.


Видеоро тамошо кунед: Синтез белка: трансляция. самое простое объяснение (Январ 2022).