Маълумот

Бо кадом қувва бактерияҳо ба қубур пошида мешаванд?

Бо кадом қувва бактерияҳо ба қубур пошида мешаванд?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ман бо C. elegans ва бактерияҳо ва ман мехоҳам аз бактерияҳое, ки онҳо мехӯранд, тавассути центрифуга кардани кирмҳо бидуни центрифуга кардани бактерияҳо халос шавам. Ман як қувваи 600-ро истифода мебарам ва бактерияҳо баъзан то ҳол центрифуга мешаванд. Кадом қувваи g-қувваи беҳтарин барои пошидани кирмҳо мувофиқ аст, аммо на бактерия? Оё ин аз намуди бактерияҳо вобаста аст?


Центрифуга

Реферат

Центрифуга як усули ҷудо кардани молекулаҳои зичии гуногун бо роҳи чарх задани онҳо дар маҳлул дар атрофи меҳвар (дар ротори центрифуга) бо суръати баланд мебошад. Ин яке аз усулҳои муфидтарин ва зуд-зуд истифодашаванда дар лабораторияи биологияи молекулавӣ мебошад. Центрифугатсия барои ҷамъоварии ҳуҷайраҳо, рехтани ДНК, тоза кардани зарраҳои вирус ва фарқ кардани фарқиятҳои нозук дар конформатсияи молекулаҳо истифода мешавад. Дар ин боб қувваи нисбии марказгурез ( г қувва), чӣ гуна табдил додан г қувва ба гардиш дар як дақиқа (rpm) ва чӣ тавр ҳисоб кардани вақти таҳшиншавии зарра ҳангоми центрифуга.


Тубҳои намунавӣ тайёр кунед

Шумо найҳои 1,5 мл-ро барои истихроҷи намунаҳои ДНК аз даҳон истифода хоҳед кард.

Барои оғоз кардан, ҳар як қубурро бо нишони доимӣ бо тамғагузорӣ омода кунед.

Ҳатто агар шумо танҳо як намуна дошта бошед ҳам, ин таҷрибаи хубест, ки найчаро равшан нишон диҳед. Масалан, агар намуна аз шахсе бошад, шумо метавонед ҳарфҳои ибтидоии онҳоро истифода баред. Инчунин фикри хубест, ки санаи намунаро қайд кунед.

Маҳлули шӯр тайёр кунед

Ба шумо оби шӯр лозим мешавад (маҳлули шӯр) ҳамчун шустушӯи даҳон барои ҷамъоварии ҳуҷайраҳои рухсораи худ.

Дар як шиша хурд ё монанд, як рози намаки ошро бо об омехта кунед. Барои ин як шиша шиша комил аст. Андозаҳо набояд дақиқ бошанд. Як рози намак барои як ҷуръаи хурди об як қоидаи хубест.

Ба шумо лозим нест, ки зиёд кунад & # 8211 як ҷуръа хурд кофӣ аст.

Чаро оби шӯр? Дар ин протокол, ҳадаф гирифтани намунаи ДНК аз ҳуҷайраҳои рухсора мебошад. Оби шумо, пас аз шустани даҳони шумо табиатан дорои ҳуҷайраҳои рухсора хоҳад буд, ки дар давоми протокол барои озод кардани ДНК кушода мешаванд. Намак, яъне хлориди натрий, барои устувор кардани ДНК, вақте ки он озод карда мешавад, истифода мешавад.

Даҳонатонро бишӯед

Оби шӯрро ба даҳони худ бирезед. Аз ҳад зиёд истифода набаред, танҳо як ҷуръаи хурд кофӣ аст. Рухсораҳои дарунии худро барои 30-60 сония бошиддат бишӯед. Вақте ки шумо кор мекунед, маҳлули шӯрро ба шишаи нав туф кунед. (ё агар шишае, ки шумо оби шӯрро омехта карда будед, холӣ бошад, шумо метавонед онро дубора истифода баред).

Мақсади ин қадам он аст, ки ҳарчи бештар ҳуҷайраҳоро аз даҳони худ озод кунед. Шумо метавонед дандонҳои худро барои хушхӯю харошидан ривоҷ ва забонатонро истифода баред, дар ҳоле ки шумо оби шӯрро дар даҳони худ чарх мезанед. Шумо инчунин метавонед бо забони худ ба рухсораҳои дарунии худ ламс кунед. Эҳтиёт бошед, ки ба худ осеб нарасонед & # 8211 ба хун лозим нест, танҳо оби даҳон бо ҳуҷайраҳои рухсораи зиёд.

Намунаи худро ба найчаи микроцентрифуга интиқол диҳед

Барои ин қадам, шумо намунаи гилро истифода мекунед (1), найчаи микроцентрифуга, ки шумо дар аввал нишон дода будед (2), ва пипетаи интиқол (3).

Барои интиқол додани намунаи гилро ба найчаи микроцентрифуга аз пипеткаи интиқол истифода баред. Онро то нишонаи 1,5 мл пур кунед.

Центрифуга

Вақти он расидааст, ки центрифугаро истифода барем. Ин барои тамаркуз кардани намуна қувваи ҷозибаро истифода мебарад.

Туби центрифугаро бо намунаи даҳонатон ба центрифуга гузоред. Боварӣ ҳосил кунед, ки центрифугаро мувозинат кунед бо намунаи дигар ё бо вазни дигари муқобил.

Агар шумо танҳо як намуна дошта бошед, роҳи осонтарини мувозинати центрифуга ин пур кардани найчаи дигар бо об ва истифода бурдани он ҳамчун найчаи мувозинат мебошад.

Истифодаи центрифуга ба таври номутаносиб хатарнок аст ва дастгоҳро мешиканад. Маслиҳатҳои моро оид ба мувозинат кардани центрифуга дар дастур дар ин ҷо иҷро кунед. Дар ин ҳолат, масалан, шумо метавонед як намунаи дуюмро ҳамчун тавозуни муқобил истифода баред ё найчаи дигарро бо об пур кунед. Қубурҳо бояд ҳамеша бо найчаи дигари вазни баробар баробар бошанд.

Пас аз мувозинат кардани найчаи намуна дар ротори сентрифуга, сарпӯшро пӯшед ва модули сентрифугаро фаъол созед. Суръатро ба 4000G муқаррар кунед ва 90 сония гардед.

Барқарор кардани пеллет

Пас аз анҷоми центрифугакунӣ найчаи намунаро тафтиш кунед. Ҳама ҳуҷайраҳои рухсора бояд дар як тӯби хурди сафед дар поёни найча ҷамъ карда шаванд (1). Инро а пеллет. Моеъи боқимонда (2), номида мешавад супернатант, бояд равшан бошад.

Дар ин қадам, шумо супернатантро хориҷ мекунед, аз ин рӯ танҳо донаи сафед боқӣ мемонад.
Тафтиш кунед, ки пелети шумо ба қаъри қубур сахт часпидааст. Агар ин тавр бошад, шумо метавонед супернатантро бодиққат бирезед.

Агар пеллет ба қаъри қубур сахт часпонида нашавад, кӯшиш кунед, ки намунаро дар центрифуга дубора чарх занед, то онро ба қаъри найча часпонед. Агар он фуҷур боқӣ монад, шумо метавонед микропипетро бо нӯги тару тоза истифода баред, то супернатантро аз қубур оҳиста интиқол диҳед. Шумо инчунин метавонед пипеткаи интиқолро, ки қаблан истифода карда будед, истифода баред, аммо назорат кардани он метавонад душвор бошад ва дар натиҷа пелетро халалдор созад.

Боздоштани пеллет

Ҳоло шумо бояд дар найчаи намунаи худ донаи сафед дошта бошед. Он бояд ба андозаи сари чуби гугирд бошад.

Агар донаи шумо аз сари гӯгирд хурдтар бошад, барои гирифтани намунаи консентратсияи ДНК ҳуҷайраҳои рухсора кофӣ нестанд. Дар ин ҳолат, ба қадами 2 баргардед, то ҳуҷайраҳои рухсораи иловагиро аз гилро тамаркуз кунед. Шумо метавонед як найчаи намунавиро истифода баред ва танҳо ба пелети мавҷуда намунаи бештар илова кунед.

Пас аз он ки шумо пелети кофӣ калон доред, шумо метавонед ҳуҷайраҳоро ба моеъи боқимондае, ки ҳанӯз дар қубур аст, боздоред. Шумо ҳоло намунаи консентратсияи ҳуҷайра дар ҳаҷми ками моеъ доред.
Боварӣ ҳосил кунед, ки найча баста аст, пас ҳуҷайраҳоро аз пеллет ба моеъ бо пахш кардани найча омехта кунед. Ҳуҷайраҳои пеллет ҳоло дар моеъ дубора суспензия карда мешаванд.

Интиқол

Дар ин қадами навбатӣ шумо микропипетро истифода мебаред (1) барои интиқол додани намунаи дубора боздошташуда (2) ба найчаи 0,2 мл PCR (3), то ки шумо онро дар термоцикл гарм кунед.

Аввалан, пипеткаи танзимшавандаро ба ҳаҷми максималии 20 мкл муқаррар кунед.

Боварӣ ҳосил кунед, ки пипетка нӯги пипеткаи нав дорад. Сипас пипеткаро барои интиқол додани омехтаи ҳуҷайраи намуна ба найчаи 0,2 мл ПЗР истифода баред. То он даме, ки найчаи PCR қариб пур шавад, ё то он даме, ки шумо ягон намуна намонед, давом диҳед. Ба найчаи PCR ҳарчи бештар омехтаи ҳуҷайраро илова кунед.

Нишон додани найчаи PCR

Ниҳоят, сарпӯши найчаи ПЗР-и пӯшидаро клик кунед ва найчаро барои муайян кардани намуна нишон диҳед, ба монанди найчаи центрифуга.

Дар паҳлӯи найҳои PCR тамғагузорӣ кунед, на сарпӯшро. Мошини PCR дорои сарпӯши тафсон аст, аз ин рӯ ҳама ранг дар сарпӯши қубур метавонад берун шавад.

Гарм кардани намуна

Дар ин қадам, шумо термоциклро ҳамчун блоки гармӣ истифода мебаред, то ҳуҷайраҳоро ҷӯшонед ва онҳоро кушоед ва ДНК-ро ба маҳлул озод кунед.

Туби PCR-и худро бо маҳлули намунаи ҳуҷайраи худ дар блоки термоцикл ҷойгир кунед.

Термоциклро барои гарм кардани намуна дар 99°С барои 10 дақиқа насб кунед.

Омезиши намуна

Пас аз гарм кардани намуна барои 10 дақиқа, мо онро дубора барои центрифуга омода мекунем.

Аввалан, найчаи PCR-ро аз блоки термоциклер берун кунед.

Блок ва сарпӯши тафсонда ҳанӯз гарм хоҳад буд, аз ин рӯ эҳтиёткор бошед.

Барои омехта кардани намуна, найчаи PCR-ро барои 5 сония ламс кунед.

Центрифуга кардани намуна

Дар ин қадам, шумо намунаро мегардонед, то супернатантро аз партовҳои ҳуҷайра ҷудо кунед. Акнун ҳуҷайраҳо ба шарофати қадами гармкунӣ дарида, ДНК аз ҳуҷайраҳо озод карда, дар супернатант шино мекунанд.

Вазни молекулавии ДНК нисбат ба дигар маводи ҳуҷайра, ба монанди сафедаҳо ва деворҳои ҳуҷайра сабуктар аст. Бо чархзании намуна бо центрифуга, мо маводи ҳуҷайраро аз ДНК ҷудо мекунем, ки ба мо намунаи тозатари ДНК медиҳад.

Барои чарх задани найчаи PCR бо намунаи худ (3) дар микроцентрифугаи Bento Lab ба шумо лозим меояд, ки адаптери найчаи PCR-ро истифода баред (1) ки дар найчаи микроцентрифугаи мукаррарй нишастааст (2) ва онро барои мувофиқ кардани найчаи PCR табдил медиҳад.

Дар хотир доред, ки центрифугаи худро мувозинат кунед. Ҳамин тавр, агар шумо танҳо бо як намуна кор карда истода бошед, найчаи дигари PCR бо миқдори обе, ки ба намунаи шумо баробар аст, омода кунед.

Сентрифугаро барои 90 сония дар 8кГ кор кардан таъин кунед.

Агар ба шумо барои идора кардани центрифугаи Bento Lab кӯмак лозим бошад, дастури корбарро тафтиш кунед. Вақте ки шумо сарпӯшро пӯшидаед, режими вақтро интихоб кунед (1). Пеш аз тасдиқ кардан қувва (2) ва вақтро (3) таъин кунед.

Тоза кардани намуна барои нигоҳдорӣ

Пас аз центрифугакунӣ, тамоми партовҳои ҳуҷайра ба қаъри найчаи ПТР (1) интиқол дода шуданд ва танҳо ДНК дар супернатант моеъ боқӣ мемонад (2). Оби боло бояд шаффоф бошад, мисли об.

Ниҳоят, шумо бо истифода аз микропипетка супернатантро ба PCR нав интиқол медиҳед.

Микропипетро ба 20 мкл насб кунед ва нӯги навро гузоред. 40 мкл супернатанти шаффофро ба найчаи нави PCR интиқол диҳед.

Эҳтиёт бошед, то ба қубури нав ворид нашавед. Шумо бояд танҳо моеъи шаффофро интиқол диҳед. Пешгирӣ аз ҳама гуна партовҳои ҳуҷайра имкони дахолатро бо намунаи ДНК коҳиш медиҳад.

Тамғагузорӣ ва нигоҳдорӣ

Ҳоло дар найчаи нав танҳо ДНК дар моеъ мавҷуд аст. Он номида мешавад намунаи шаблон, ва акнун метавонад минбаъд барои таҳлил бо истифода аз протоколҳо ба монанди PCR истифода шавад.

Тубро дубора тамғагузорӣ кунед, то муайян кунед, ки он кадом намунаи қолаб аст.

Дар ниҳоят, агар шумо намунаи қолабро дар як протоколи дигар истифода набаред, онро дар яхдон дар тақрибан -20 ° C нигоҳ доред. Ин намунаро нигоҳ медорад.

Гарчанде ки худи ДНК хеле устувор аст, дар намуна шояд баъзе сафедаҳои дигар вуҷуд дошта бошанд, ки бо мурури замон онро вайрон мекунанд. Мақсади ин протокол тоза кардани намунаи гилро ба қадри имкон ҳангоми нигоҳ доштани ДНК мебошад. Нигоҳ доштани намуна дар яхдон ҳама гуна реаксияҳои сафедаҳои боқимондаро суст мекунад ва аз ин рӯ намунаи қолаби ДНК дарозтар нигоҳ дошта мешавад.


II. Баланд бардоштани таъсири вазнинӣ: центрифуга.

Бисёр зарраҳо ё ҳуҷайраҳо дар суспензияи моеъ, дар вақти додашуда, оқибат дар қаъри контейнер аз сабаби вазнинӣ ҷойгир мешаванд (1 x г). Бо вуҷуди ин, дарозии вақт барои чунин ҷудошавӣ ғайриимкон аст. Заррачаҳои дигар, ки ҳаҷмашон хеле хурд аст, дар маҳлул тамоман ҷудо намешаванд, ба шарте ки ба қувваи баланди марказгурезӣ дучор нашаванд. Вақте ки суспензия бо суръати муайян ё гардиш дар як дақиқа (RPM) гардиш мекунад, қувваи марказгурезӣ боиси он мегардад, ки зарраҳо аз меҳвари гардиш ба таври радиатсионӣ дур мешаванд. Қувваи зарраҳо (нисбат ба вазнинӣ) Қувваи нисбии марказгурез (RCF) номида мешавад. Масалан, RCF 500 xg нишон медиҳад, ки қувваи марказгурези татбиқшаванда аз қувваи ҷозибаи Замин 500 маротиба зиёдтар аст. Ҷадвали 1 синфҳои маъмули центрифугаҳо ва татбиқи онҳоро нишон медиҳад.

Ҷадвали 1. Синфҳои центрифугаҳо ва истифодаи онҳо

Ҷадвал ба таври уфуқӣ ҳаракат мекунад

Синфҳои центрифугаҳо
Суръати паст Суръати баланд Ультра/микро-ултра
Суръати максималӣ (rpm x10 3 ) 10 28 100/150
Максимум RCF (x10 3 ) 7 100 800/900
Барномаҳои пеллеткунӣ
Бактерияҳо
Бале Бале (ҳа)
Ҳуҷайраҳои ҳайвонот ва растаниҳо Бале Бале (ҳа)
Ядрохо Бале Бале (ҳа)
боришот Баъзехо Аксарият (ҳа)
Фраксияҳои мембрана Баъзехо Баъзехо Бале
Рибосомаҳо/Полисомаҳо - - Бале
Макромолекулаҳо - - Бале
Вирусҳо - Аксарият Бале
Вирусҳо - Аксарият Бале

() = кардан мумкин аст, аммо одатан барои ин мақсад истифода намешавад.


Асосҳо дар центрифугаатсия

Центрифуга як усулест, ки барои ҷудо кардани омехтаҳо тавассути истифодаи қувваи марказӣ кӯмак мекунад. Сентрифуга дастгоҳест, ки одатан тавассути муҳаррики электрикӣ идора карда мешавад, ки ашё, масалан, роторро дар ҳаракати гардиш дар атрофи меҳвари собит мегузорад.

Центрифуга бо истифода аз принсипи таҳшиншавӣ кор мекунад: Дар зери таъсири қувваи ҷозиба (g-қувваи) моддаҳо аз рӯи зичии худ ҷудо мешаванд. Намудҳои гуногуни ҷудокунӣ маълуманд, аз ҷумла изопикӣ, ултрафилтратсия, градиенти зичӣ, ҷудокунии фазавӣ ва пеллетатсия.

Пеллетизатсия маъмултарин барои центрифугаҳо мебошад. Дар ин ҷо, зарраҳо ҳамчун пеллет дар қаъри найчаи центрифуга ҷамъ карда мешаванд ва аз маҳлули боқимонда ҷудо карда мешаванд, ки супернатант номида мешавад. Ҳангоми ҷудокунии фаза моддаҳои кимиёвӣ аз матритса ё муҳити обӣ ба ҳалкунанда табдил меёбанд (барои таҳлили иловагии химиявӣ ё молекулавии биологӣ). Ҳангоми ултрафилтратсия, макромолекулаҳо тавассути мембрана тоза карда мешаванд, ҷудо карда мешаванд ва консентратсия карда мешаванд. Центрифугаи изопиникӣ бо истифода аз градиенти зичии "худ тавлидкунанда" анҷом дода мешавад, ки тавассути таҳшиншавии мувозинат муқаррар шудааст. Ин усул тамаркузи таҳлилро бо таҳлилҳои ҳалли атроф мутамарказ мекунад. Протоколҳо барои центрифуга одатан қувваи нисбии марказгурез (rcf) ва дараҷаи шитобро дар зарбҳои g (g-қувва) муайян мекунанд. Кор бо суръати гардиш, ба монанди гардишҳо дар як дақиқа (rpm), хеле номуайян аст.

Таърифҳои муҳим

Умуман, замимаҳо барои центрифугакунӣ дараҷаи шитобро, ки ба намуна татбиқ карда мешаванд, муайян мекунанд, на муайян кардани суръати мушаххаси гардиш, ба монанди инқилоб дар як дақиқа. Шитоб маъмулан бо ҷозиба [× g] (ё зарбҳои xg ё g-қувва) дода мешавад, ки арзиши стандартии шитоб аз ҳисоби ҷозиба дар сатҳи Замин (9,81 м/с 2). Фарқи байни чархзанӣ ва rcf муҳим аст, зеро ду ротори диаметрҳои гуногун бо суръати як гардиш (rpm) кор мекунанд, боиси шитобҳои гуногун (rcf) мешаванд.

Азбаски ҳаракати ротор даврашакл аст, қувваи шитоб ҳамчун ҳосили радиус ва квадрати суръати кунҷ ҳисоб карда мешавад. Таърихан бо номи "қувваи нисбии марказгурез" (rcf) маълум аст, ин ченкунии шитобест, ки ба намуна дар доираи ҳаракати даврӣ истифода мешавад. Ин раванд бо воҳидҳои вазнинӣ чен карда мешавад
(× г).

Мисол*

Ротор А Ротор Б
Суръат 14,000 чархзанӣ 14,000 чархзанӣ
Радиус 5,98 см9,50 см
Гравитация 13,100 × г20,817 × г

Тавре зикр гардид, ҳангоми истифода
роторҳо бо радиусҳои гуногун барои центрифуга, ҳамон rcf
(g-force) бояд истифода шавад.

Ҳарду центрифуга метавонанд роторро бо қубурҳои 1,5/2 мл бо суръати якхела (14,000 чархзанӣ) чарх зананд, аммо шитобе, ки ба намунаҳо истифода мешавад, хеле фарқ мекунад: 13,100 × г нисбат ба 20,817 × г, ки дар натиҷа натиҷаҳои гуногун ба даст меоранд. Барои осон кардани ҳаёт ва беҳтар тавлид кардани маълумот, баъзе центрифугаҳо тугмаҳои мустақим дар панели амалиётӣ барои табдили автоматӣ байни гардиш ва rcf доранд. Агар сентрифугаи шумо табдилдиҳандаи rpm-rcf надошта бошад, шумо метавонед формулаи табдилдиҳандаи rpm-rcf-ро, ки дар саҳифаҳои хонагии таъминкунандагони сентрифуга мавҷуд аст ё номограмма барои табдилдиҳӣ истифода баред. k-омили параметр барои масофаи таҳшиншавӣ дар найчаи озмоишӣ мебошад. Ин омилро омили клиринг низ меноманд ва самаранокии нисбии пеллеткунии системаи центрифугаро бо суръати максималии гардиш нишон медиҳад. Умуман, арзиши омили k барои баҳодиҳии вақт, t (бо соат), ки барои таҳшиншавии пурраи фраксияи намуна бо коэффисиенти маълуми таҳшиншавӣ дар s (сведберг) чен карда мешавад, истифода мешавад.

К-омили хурд ҷудошавии зудтарро ифода мекунад. Арзиши омили k пеш аз ҳама бо диаметри ротор муайян карда мешавад. Дар муқоиса бо rpm/rcf, истифодаи k-омили барои равандҳои умумии центрифугакунӣ аҳамияти камтар пайдо кардааст. Махсусан барои ултрацентрифугакунӣ, омили k то ҳол аҳамият дорад.

Чӣ тавр интихоб кардани центрифугаи дуруст барои барномаи шумо

Агар шумо протоколи додашударо риоя кунед, боварӣ ҳосил кунед, ки ҳамон навъи роторро истифода баред ва қувваи нисбии марказгурези додашударо (RCF) ва инчунин ҳарорат ва вақти корро истифода баред. Умуман, барои бомуваффақияти центрифугакунӣ параметрҳои асосии зерин бояд муайян карда шаванд:

E: Муайян кардани қувваи нисбии марказгурези дилхоҳ

F: Ҳарорати муайяншуда ҳангоми центрифуга

Роторҳои кунҷи собит ё сатилро

Роторҳои маъмултарин дар центрифугаи лабораторӣ роторҳои кунҷи собит ё сатил мебошанд. Танҳо якчанд барномаҳо роторҳои махсусро талаб мекунанд, ба монанди роторҳои ҷараён, роторҳои барабан ва ғайра. Роторҳои ҷорӣ имкон медиҳанд, ки ҷараёни муттасили боришот ҷамъоварӣ карда шаванд. Ин системаҳо, масалан, дар ҷамъоварии ферментаторҳо ё истеҳсоли афшура дар саноати хӯрокворӣ истифода мешаванд. Версияҳои махсуси фармоишӣ, ки барои барномаи мушаххас оптимизатсия шудаанд, заруранд.

Ротори кунҷи собит

Бартарии ошкоро набудани қисмҳои ҳаракаткунанда дар ротор мебошад. Ин боиси коҳиши фишори металлӣ (дарозтар шудани умр) мегардад, қувваи максималии баландтари g имконпазир аст ва барои бисёр барномаҳо, вақтҳои тезтар центрифугаро амалӣ кардан мумкин аст. Иқтидори маҳдуди (камтарии чандирии) ротори кунҷи собит ягона нуқсон аст. Мавқеи пеллет аз кунҷи най сахт вобаста аст, он ҳангоми чархзанӣ аз паҳлӯ то поёни найча ҷойгир аст. Аксари роторҳо барои қубурҳо кунҷи 45° доранд. Ҳар қадаре, ки кунҷи қубурҳо калонтар бошад, пеллет ҳамон қадар сахттар мешавад. Кунҷҳои хурдтари ротор боиси паҳншавии бештари майдонҳои пеллет мешаванд.

Ротори сатил

Ин навъи ротор барои истифодаи форматҳои гуногуни қубурҳо, аз ҷумла плитаҳои формати SBS, дар асоси доираи васеи системаҳои адаптер ва иқтидори баланди намунавӣ хеле чандир аст. Қисмҳои ҳаракаткунандаи сатил боиси зиёд шудани фишори металлӣ барои ротор ва сатилҳо мешаванд, зеро вазни сатил ба ду чарх ва чуқуриҳо бор мекунад. Аз ин рӯ, дар муқоиса бо ротори кунҷи собит, ротори сатил бо як қувваи максималии камтари g маҳдуд аст, ки ин боиси тӯлонии вақтҳои центрифугакунӣ мегардад. Дар асоси принсипи сатил-сатил, пеллет дар поёни найча ҷойгир аст (ҷойи уфуқии қубур ҳангоми давидан). Барқарор кардани корбар дар муқоиса бо донаҳое, ки дар паҳлӯи қубур ҷойгиранд, осонтар аст.


Усулҳое, ки барои ҷудо кардани зарраҳо дар центрифуга истифода мешаванд: 3 усул

Ин мақола се усулеро, ки барои ҷудо кардани зарраҳо дар центрифуга истифода мешаванд, равшан мекунад.

Се усул инҳоянд: (1) центрифугаи дифференсиалӣ (2) элютриатсияи марказӣ ва (3) центрифугаи градиентии зич. Усули центрифугакунии зичии градиент аз ду усул иборат аст. Ду усул инҳоянд: (1) Технологияи минтақавӣ ва (2) Усули центрифугаси изопиникӣ.

Усули № 1. Сентрифугасияи дифференсиалӣ:

Ин ба суръати таҳшиншавии зарраҳои андоза ва зичии гуногун вобаста аст. Центрифугаҳо дар аввал зарраҳои калонтаринро таҳшин мекунанд.

Барои заррачаҳои массаашон якхела, вале зичии гуногун, заррае, ки зичии баландтарин аст, аввал таҳшин мешавад. Заррачаҳое, ки зичии якхела доранд, одатан метавонанд бо центрифугаи дифференсиалӣ ё усули минтақавии суръати ба таври самаранок аз якдигар ҷудо карда шаванд, ба шарте ки дар массаҳои онҳо ҳадди аққал 10 маротиба фарқият вуҷуд дошта бошад.

Дар центрифугаи дифференсиалӣ маводи ҷудошаванда ба таври марказӣ ба миқдори фраксияҳо бо зиёд кардани майдони центрифугаи татбиқшаванда тақсим карда мешавад. Майдони центрифуга дар ҳар як қадам ба тавре интихоб карда мешавад, ки намуди махсуси таҳшинҳои моддӣ. Ҳама намуди зарраҳои дар гомогенат мавҷудбуда метавонанд дар пеллет ё супернатант ё ҳарду фраксияҳо вобаста ба вақт ва суръати центрифуга, ҳаҷм ва зичии зарраҳо пайдо шаванд. Дар охири ҳар як марҳила пеллет ва супернатант ҷудо карда мешаванд ва пеллет якчанд маротиба тавассути суспензия ва аз нав центрифугакунӣ дар муҳити гомогенизатсия шуста мешавад.

Дар аввал ҳама зарраҳои гомогенат дар тамоми найчаи центрифуга якхела тақсим мешаванд. Ҳангоми центрифугакунӣ заррачаҳо аз қубурҳои центрифуга бо суръати таҳшиншавии мувофиқи худ ба поён ҳаракат мекунанд ва дар қаъри найчаи центрифуга ба ташаккули донача шурӯъ мекунанд. Идеалӣ, центрифугакунӣ ба қадри кофӣ идома дода мешавад, ки ҳама синфи бузургтарини зарраҳоро пошида, супернатант дар натиҷа бо суръати баландтар барои ҷудо кардани зарраҳои миёнаҳаҷм ва ғайра центрифуга карда мешавад.

Бо вуҷуди ин, азбаски зарраҳои андоза ва зичии гуногун дар оғози центрифуга ба таври якхела тақсим карда шуданд, маълум аст, ки пеллет якхела нахоҳад буд, балки омехтаи ҳама ҷузъҳои таҳшиншударо дар бар мегирад, ки бо зарраҳои таҳшиншавандаи тезтар бой мешаванд. Дар вақти зарурӣ барои таҳшиншавии пурраи зарраҳои вазнинтар, баъзе зарраҳои сабуктар ва миёнаҳаҷм, ки дар аввал дар қаъри қубур овезон буданд, низ таҳшин мешаванд ва ба ин васила фраксияро олуда мекунанд.

Аз ин рӯ, дар як қадами центрифугатсия омодагии холиси донаи зарраҳои вазнинтаринро ба даст овардан мумкин нест. Ин танҳо ҷузъи оҳиста таҳшиншавандаи омехта аст, ки пас аз таҳшин кардани ҳама зарраҳои калонтар дар супернатант боқӣ мемонад, ки онро бо як қадами центрифугакунӣ тоза кардан мумкин аст.

Ҷудокуние, ки тавассути центрифугаи дифференсиалӣ ба даст оварда мешавад, мумкин аст тавассути таваққуфи такрорӣ ва аз нав центрифугакунӣ дар ҳолати шабеҳ беҳтар карда шавад. Сентрифугаи минбаъдаи супернатант бо тадриҷан афзоиш ёфтани майдонҳои марказгурез боиси таҳшиншавии зарраҳои мобайнӣ ва ниҳоят хурдтарин ва камтарин зич мегардад. Сарфи назар аз маҳдудиятҳои хоси худ, центрифугасияи дифференсиалӣ эҳтимолан усули маъмултарин барои ҷудо кардани органеллҳои ҳуҷайра аз бофтаи гомогенизатсияшуда мебошад.

Усули № 2. Элютриатсияи марказгурез:

Дар ин техника ’ҷудокунӣ ва тоза кардани навъҳои зиёди ҳуҷайраҳоро аз бофтаҳо ва намудҳои гуногун тавассути амали нарм “шустан” бо истифода аз ротори элютриатор ба даст овардан мумкин аст. Техника ба фарқиятҳо дар танзим дар камераи ҷудокунии ротор, байни ҷараёни муқобили моеъи марказӣ ва майдони истифодашавандаи марказгурез барои ҷудо кардани зарраҳо асосан дар асоси фарқияти андозаи онҳо асос ёфтааст.

Техника градиенти зичро истифода намебарад ва бартарият дорад, ки ҳама гуна муҳити комилан мувофиқ бо зарраҳо истифода шавад. Бо ин ҷудокунӣ метавонад хеле зуд ба даст оварда шавад, ки консентратсияи баланди ҳуҷайраҳо ва ҳосили барқарорсозии хеле хуб медиҳад.

Усули № 3. Центрифугатсияи градиентии зич:

Ду усули центрифугакунии градиенти зичӣ, техникаи минтақавии суръат ва техникаи изопиникӣ (зичии изофӣ ё зичии баробар) вуҷуд дорад ва ҳардуро ҳангоми зарурати ҷудокунии миқдории ҳамаи ҷузъҳои омехтаи зарраҳо истифода бурдан мумкин аст. Онҳо инчунин барои муайян кардани зичии оббозӣ ва баҳодиҳии коэффисиенти таҳшин истифода мешаванд.

(а) Усули минтаќавии нархгузорӣ:

Ҷудокунии зарраҳо бо усули суръати минтақавӣ ба фарқиятҳо дар ҳаҷм, шакл ва зичии зарраҳо, зичӣ ва часпакии муҳити атроф ва майдони центрифугаи татбиқшаванда асос ёфтааст. Органеллҳои зерҳуҷайра, ки зичии гуногун доранд, вале андозаашон якхелаанд, бо истифода аз ин усул самаранок ҷудо намешаванд, аммо ҷудо кардани сафедаҳои зичии якхела ва аз рӯи массаи нисбии молекулавӣ ҳамагӣ 3 маротиба фарқ кардан мумкин аст.

Ин техника бодиққат қабат кардани маҳлули намунаро дар болои градиенти зичии моеъ дар бар мегирад, ки зичии баландтарини он аз зичтарин зарраҳои ҷудошаванда зиёд нест. Вазифаи градиент пеш аз ҳама мӯътадил кардани сутуни моеъ дар най бар зидди ҳаракатҳое, ки аз ҷараёнҳои муқаррарӣ ба вуҷуд меоянд ва дуюмдараҷа тавлид кардани градиентест, ки ба беҳтар шудани ҳалли градиент мусоидат мекунад.

Сипас намуна то ба даст овардани дараҷаи дилхоҳи ҷудошавӣ центрифуга карда мешавад. Азбаски техника аз вақт вобаста аст, центрифуга бояд пеш аз ҳама гуна донаҳои минтақаи ҷудошуда дар поёни қубур қатъ карда шавад. Техника барои ҷудо кардани ферментҳо, гибридҳои РНК-ДНК, зербахши рибосомӣ, органеллҳои зерҳуҷайра ва ғайра истифода мешавад.

(б) Техникаи центрифугакунии изопиникӣ:

Сентрифугаи изопиникӣ танҳо аз зичии харид вобаста аст, на аз шакл, андоза ва вақти он, андозаи зарра танҳо ба суръати расидани он дар градиент ба мавқеи изопиникӣ таъсир мерасонад. Ин техника барои ҷудо кардани зарраҳои андозаи якхела, вале зичии гуногун истифода мешавад. Аз ин рӯ, сафедаҳои ҳалшавандаро, ки зичии хеле шабеҳ доранд, одатан бо ин усул ҷудо кардан мумкин нест, зеро дар он ҷо органеллҳои зерҳуҷайраро самаранок ҷудо кардан мумкин аст.

Усулҳо маҷмӯи таҳшин ва флотатсия мебошанд ва қабати намунаро дар болои градиенти зичӣ дар бар мегиранд, ки тамоми диапазони зичии зарраҳоро, ки бояд ҷудо карда шаванд, фаро мегирад. Аз ин рӯ, зичии максималии градиент бояд ҳамеша аз зичии заррачаи зичтарин зиёд бошад. Ҳангоми центрифугакунӣ таҳшиншавии зарра то баробар шудани зичии шинокунандаи зарра ва зичии градиент ба амал меояд.

Дар ин нуқтаи изоденсиатӣ, новобаста аз он ки центрифуга чӣ қадар давом мекунад, таҳшиншавии минбаъда ба амал намеояд, зеро зарраҳо дар болини маводе шино мекунанд, ки зичии онҳо аз зичии худ зиёдтар аст. Сентрифугаи изопиникӣ, бар хилофи техникаи суръати минтақавӣ, як усули мувозинатест, ки бандбандии зарраҳо барои ташкили минтақаҳои ҳар кадоми онҳо дар зичии хоси шинокунандаи худ мебошад.

Дар ҳолате, ки на ҳама ҷузъҳои омехтаи зарраҳо талаб карда намешаванд, диапазони градиентиро интихоб кардан мумкин аст, ки дар он маводҳои номатлуб дар қаъри қубур таҳшин хоҳанд шуд ва тамоми зарраҳои мавриди таваҷҷӯҳ дар мавқеъҳои изопинии худ шино мекунанд. Чунин техника омезиши ҳам равишҳои минтақавӣ ва изопиниро дар бар мегирад.

Хусусиятҳои маводи градиентӣ:

Маводи идеалии градиентии ҳама мақсаднок вуҷуд надорад, ки интихоби моддаи маҳлул аз табиати зарраҳои фраксияшаванда вобаста аст.

Маводи градиентӣ бояд:

i. Ба намуди дилхоҳи ҷудошавӣ иҷозат диҳед

iii. Нисбат ба маводи биологӣ бетараф бошед ва бо центрифуга, ротор, қубурҳо ё сарпӯшҳо вокуниш накунед:

iv. Нурро дар дарозии мавҷҳо, ки барои мониторинги спектрофотометрӣ мувофиқ аст (диапазони намоён ё ултрабунафш) ҷабб накунед ё ба тартиби дигар халал нарасонед.

v. Безараршаванда, заҳролуд ё оташгиранда бошад

vi. Фишори осмотикии ночиз дошта бошед ва дар қувваи ионӣ, рН ва часпак тағйироти ҳадди ақалро ба вуҷуд оред

vii. Арзон ва дар шакли холис дастрас буда, қодир аст, ки маҳлули фарогирии диапазони зичии барои як барномаи мушаххасро бидуни фишори аз ҳад зиёди ротор фароҳам оварад

viii. Ба осонӣ ҷудо кардани маводи намуна аз муҳити градиентӣ бо гум шудани намуна ё фаъолияти он иҷозат диҳед.

Маводҳои градиентии маъмулан истифодашаванда намакҳои металлҳои сілтӣ (масалан, цезий ва хлориди рубидий), молекулаҳои органикии хурди гидрофилии бетараф (масалан, сахароза), макромолекулаҳои гидрофиликӣ (масалан, сафедаҳо ва полисахаридҳо) ва як қатор пайвастагиҳои гуногун ба монанди кремнийи коллоидӣ мебошанд. масалан, перколл ва людокс) ва пайвастагиҳои хушбӯйи йодноки ғайриионӣ (масалан, метризамид, никоденз ва ренографин).

Маҳлули сахароза дар ҳоле ки аз нуқсонҳои хеле часпак будан дар зичии аз 1,1 то 1,2 г см-3 ва таъсири хеле баланди осмотикӣ ҳатто дар консентратсияи хеле паст дорад, маводи градиентии қулай барои ҷудокунии суръати минтақавӣ дониста шудааст. Глицерол инчунин ҳамчун маводи градиентӣ махсусан барои ҷудо кардани ферментҳо истифода мешавад ё васоити алтернативӣ ба монанди фиколл, метризамид ё градиентҳои перколл метавонанд истифода шаванд.

Воситаҳои ғайриионикӣ, аз қабили сахароза, глицерин, метризамид, фиколл ва перколл одатан нисбат ба намакҳои ионӣ ба монанди хлориди сезий ва бромиди калий гендерӣ ҳисобида мешаванд ва барои ба даст овардани ҷудошавии муносиби зарраҳо майдонҳои центрифугаи камтарро талаб мекунанд. Дар ҳолати ҷудошавии изопиникӣ, ҳеҷ як муҳит барои ҷудокунии ҳама намуди заррачаҳои биологӣ қаноатбахш набуд.

Фиколл барои ҷудо кардани тамоми ҳуҷайраҳо ва органеллҳои зерҳуҷайра бо суръати центрифугаҳои минтақавӣ ва изопикӣ бомуваффақият истифода кардааст. Намакҳои цезий ва рубидий танҳо барои ҷудокунии изопиникӣ истифода мешаванд ва бештар барои ҷудо кардани маҳлулҳои зичии баланд ба монанди кислотаҳои нуклеинӣ истифода мешаванд.

Бо вуҷуди ин, дар консентратсияи баланд қувваи баланди ионӣ ва осмолярии онҳо ба вайрон кардани алоқаҳои дохили молекулавӣ ва байнимолекулаҳо майл мекунанд. Умуман, ВАО-и ионӣ барои ҷудо кардани кислотаҳои нуклеинӣ, сафедаҳо ва вирусҳо ва пайвастагиҳои хушбӯйи йоднашавандаи ионӣ истифода мешуданд, аз сабаби васеъ будани онҳо, барои доираи васеи барномаҳо истифода мешаванд.


Чӣ тавр мурдан кор мекунад

Баъди аз таппиши дил бадан якбора хунук шудан мегирад. Ин марҳила ҳамчун маълум аст марговар, ё сардии марг. Ҳар соат ҳарорати бадан тақрибан 1,5 дараҷа Фаренгейт (0,83 дараҷа) паст мешавад, то ба ҳарорати хонагӣ мерасад. Дар айни замон, бидуни гардиш барои нигоҳ доштани ҳаракати он дар бадан, хун ба ҷамъшавӣ ва ҷойгиршавӣ оғоз мекунад. Марди сахт, ё сахтшавии бадан, пас аз ду то шаш соат пас аз марг муқаррар карда мешавад [манбаъ: Марчант, Миддлтон].

Гарчанде ки бадан дар маҷмӯъ метавонад мурда бошад, чизҳои хурд дар бадан ҳанӯз зиндаанд. Масалан, ҳуҷайраҳои пӯст метавонанд то 24 соат пас аз марг ҳосил шаванд [манбаъ: Мимс]. Аммо баъзе чизҳое, ки ҳанӯз зиндаанд, боиси пӯсида, ё таҷзияи бадан -- мо дар бораи организмҳои хурде, ки дар рӯдаҳо зиндагӣ мекунанд, гап мезанем.

Чанд рӯз пас аз марг, ин бактерияҳо ва ферментҳо раванди шикастани мизбони худро оғоз мекунанд. Панкреас пур аз бактерияҳои зиёде аст, ки аслан худро ҳазм мекунад [манбаъ: Macnair]. Вақте ки ин организмҳо ба узвҳои дигар ҳаракат мекунанд, бадан ранг карда, аввал сабз, баъд бунафш ва сипас сиёҳ мешавад. Агар шумо тағиротро дида натавонед, шумо ба зудӣ бӯи онро хоҳед дид, зеро бактерияҳо гази бадбӯй эҷод мекунанд. Он газ ба ҷуз аз бӯи бӯи ҳуҷра, боиси варам шудани бадан мегардад, чашмҳо аз ҷӯйборҳо берун мешаванд ва забон варам карда, берун мебарояд. (Дар ҳолатҳои нодир, ин газ пас аз чанд ҳафта фишори кофӣ ба вуҷуд овардааст, ки занони ҳомила пӯсидаро ба хориҷ кардани ҳомила дар раванде маълуманд таваллуди тобут.)

Як ҳафта пас аз марг, пӯст луоб пайдо мекунад ва каме ламс метавонад боиси афтодани он гардад. Як моҳ пас аз марг мӯй, нохунҳо ва дандонҳо мерезанд. Дар омади гап, мӯй ва нохунҳо, дар ҳоле ки овозаҳои тӯлонӣ пас аз марг афзоиш меёбанд, ягон хосияти афзоиши ҷодугарӣ надоранд. Онҳо танҳо вақте ки пӯст хушк мешавад, калонтар ба назар мерасанд. узвҳо ва бофтаҳои дарунӣ моеъ шудаанд, ки бадан варам мекунад, то он даме, ки он кушода шавад. Дар он вақт як скелет боқӣ мемонад.

Ҳоло, аксарияти мо ин равандро намебинем, зеро қонун талаб мекунад, ки мо бо бадан коре кунем. Имкониятҳои беохир вуҷуд доранд: Мо метавонем барои бадани худ тобут ё қубурро барои хокистарамон интихоб кунем. Моро мумиё кардан, мумиё кардан ё ях кардан мумкин аст. Баъзе фарҳангҳо овозаҳо буданд, ки ба расму оинҳои каннибалистии истеъмоли мурда машғуланд, дар ҳоле ки дигарон мурдагони худро дар зери таъсири унсурҳо гузошта, ҳайвонҳоро ба ароба бурданд. Шумо метавонед ҷисми худро ба илм ҳадя кунед ё дар баҳр дафн карданро талаб кунед. Аммо агар мумиёшуда ё нигоҳ дошта нашавад, ҷасадҳо дар раванди дар боло тавсифшуда пароканда мешаванд. Бо вуҷуди ин, дафн дар тобут равандро хеле суст мекунад, ҳатто навъи хоке, ки шумо дар он дафн кардаед, метавонад фарқиятро ба вуҷуд орад.

Пардохти ҷасади мурда асосан аз ҷониби эътиқодҳои фарҳангӣ ва динӣ танзим карда мешавад. Фарҳангҳои пешин мурдагонро бо дороиҳои дӯстдоштаи худ (ва баъзан одамони дӯстдоштаи худ) барои ҳаёти баъдӣ дафн мекарданд. Баъзан ҷанговарон ё хизматгоронро рост истода дафн мекарданд, ки абадан барои амал омодаанд. Яҳудиёни православӣ мурдаҳои худро кафан мекунанд ва онҳоро дар ҳамон рӯз ба хок месупоранд, дар ҳоле ки буддистҳо боварӣ доранд, ки шуур дар бадан се рӯз боқӣ мемонад [манбаъ: Мимс]. Ҳиндуҳо сӯзонда мешаванд, зеро боварӣ доранд, ки сӯхтан рӯҳро аз бадан озод мекунад, дар ҳоле ки католикҳои румӣ ба хотири эҳтиром ба бадан ҳамчун рамзи ҳаёти инсон ба сӯзондан рӯй мехӯранд [манбаъҳо: Мимс Касселл ва дигарон].

Дин ва фарҳанг ҳамеша бо марг алоқаманд хоҳанд буд ва як минтақаи бузурги таъсир ба саволҳои ахлоқии марбут ба раванди марг марбут аст. Дар саҳифаи оянда мо баъзе масъалаҳоро баррасӣ хоҳем кард.


Корҳои амалӣ барои омӯзиш

Синфи амалӣ

Дар омӯзиши ибтидоии биология, мо аксар вақт ба ферментҳои ҳозима тамаркуз мекунем. Ин метавонад донишҷӯёнро водор кунад, ки ферментҳо танҳо барои ҷудо кардани кимиёвӣ кор мекунанд. Ин синтези катализшуда реаксияи алтернативии ферментро пешниҳод мекунад, ки дар натиҷа молекулаи нав ба вуҷуд меояд.

The aim of the investigation is to prepare an extract of potato tuber, remove starch from it, and then check for its ability to catalyse the synthesis of starch from different substrates.

Ташкили дарс

The enzyme extraction takes about half an hour. The extract can be stored overnight at 4 °C, but it will turn brown. To complete the investigation in one session, prepare the substrate solutions and set up the colorimeter while making the enzyme extract. Different groups could be responsible for different parts of the experiment.

Таҷҳизот ва кимиёвӣ

Барои ҳар як гурӯҳи донишҷӯён:

Access to a water bath at 25 °C

Centrifuge, 3000 rpm/ RCF 1000 g (Эзоҳ 3)

2 medium-sized potatoes (Эзоҳ 4)

Барои синф – аз ҷониби техник/муаллим таъсис дода шудааст:

50 cm 3 of 1% glucose-1-phosphate, for up to 8 groups (Эзоҳ 1)

50 cm 3 of 1% glucose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% maltose, for up to 8 groups

50 cm 3 of 1% sucrose, for up to 8 groups

Iodine solution (Эзоҳ 2)

Қайдҳои саломатӣ ва бехатарӣ ва техникӣ

1 Glucose-1-phosphate: Make up the solution by dissolving 0.5 g of glucose-1-phosphate in 50 cm 3 of distilled water (a 1% solution). The compound is unstable in solution, hydrolysing quite rapidly to glucose and phosphoric acid at room temperature. Prepare just before use, or store in a refrigerator (at 4 °C) for up to 24 hours. This, and the other sugar solutions, are described on the CLEAPSS Hazcard as LOW HAZARD.

2 Iodine solution: Iodine is only sparingly soluble in water (0.3 g per litre). It is usual to dissolve iodine in potassium iodide solution (KI) to make a 0.01 M solution (by tenfold dilution of a 0.1 M solution) to use as a starch test reagent. Refer to CLEAPSS Recipe card 33. For 100 cm 3 of 0.1 M solution, measure 3.0 g of potassium iodide (KI) into an appropriate beaker. Moisten the potassium iodide with a few drops of water. Measure out 2.54 g of iodine (see Hazcard 54: iodine is harmful) and add to the moistened potassium iodide. Add a small volume of water and stir. When no more iodine appears to dissolve, add some more water and stir. Repeat until all the iodine has dissolved. Pour the solution into a measuring cylinder and dilute to the final volume. If there are any bits of iodine remaining, return the solution to the beaker and leave it on a magnetic stirrer for several minutes. Add the solution to a labelled bottle and mix well.

3 Centrifuge: You need enough ‘centrifuge space’ to produce around 25 cm 3 of potato extract for each working group. A speed of just under 3000 revolutions per minute, corresponding to a relative centrifugal force (RCF, ‘g-force’) of just under 1000 g is enough to spin down starch grains.

SAFETY: The CLEAPSS Laboratory Handbook gives detailed information about the requirements of the British and International Standard (BS EN 61010-2-020) for centrifuges. Use this information to assess your school’s centrifuges if your documentation does not clearly state that they conform to this standard. The DfEE has stated that: ”Existing centrifuges not conforming to the safety requirements of this standard should not be used after 1 January 1997.” (From Safety in Science Education, HMSO, 1996, ISBN 011270915X). CLEAPSS advise that centrifuges which do not cut off the power to the rotor when the lid is raised, or have an exposed rotor, should be taken out of service. If using any centrifuge without a lock, users should not raise the lid until they can шунидан that the rotor has stopped.

4 Potatoes: Medium-sized potatoes are best. Large potatoes often have a poor yield of phosphorylase enzyme. Small new potatoes have such small grains of starch that they are difficult (or impossible) to spin down.

Тартиб

SAFETY: Ensure your centrifuge is safe to use and that students are briefed to use it correctly. Make eye protection available when iodine solution is dispensed.

Тайёрӣ

а Make up a 1% solution of glucose-1-phosphate in distilled water (Эзоҳ 1).

б Make up iodine solution (Эзоҳ 2).

в Prepare the colorimeter by putting a known volume of water (say 3 cm 3 ) into your colorimeter cuvettes or bottle. Add 0.5 cm 3 or 1 cm 3 of iodine solution (Эзоҳ 2) and swirl to mix well. Make sure this liquid is deep enough in the vessel to provide an accurate reading in your colorimeter (by comparing with a full colorimeter vessel of the same solution). Use a yellow filter, as we will be following the formation of a blue starch-iodide complex (peak of absorption 580-600 nm). Record the reading from the iodine solution as the ‘zero’ reading for this procedure. Set up ‘clean’ cuvettes to follow the reaction with 2 cm 3 of water and 0.5 or 1.0 cm 3 of iodine solution. You will add 1.0 cm 3 of starchy solution to each of these.

Тафтишот

г Take two medium-sized potatoes, peel and cut into small pieces (Эзоҳ 4). Crush with a pestle and mortar or use a blender. Add water sparingly so that the resulting mash is just liquid enough to be poured from the container.

д Pour the crushed potato quickly through a single layer of muslin or nylon stocking.

f Transfer the extract to centrifuge tubes. Spin in a bench centrifuge for 5 minutes at the highest speed to separate the starch granules (Эзоҳ 3).

г After spinning, take one drop of clear liquid from the top of each tube. Test each drop on a white tile with iodine solution. If the blue colour characteristic of starch appears, centrifuge for a further 5 minutes.

ч Repeat the iodine test and, if necessary, continue to centrifuge until no starch is detectable in the samples of clear liquid. Once the liquid is free of starch, carefully pour the clear liquid from each centrifuge tube into a single container. If this is to be kept overnight, stopper and refrigerate the container.

i Label 4 test tubes. Use a syringe to put 5 cm 3 of glucose-1-phosphate into a test tube. Place it in a water-bath at 25 °C. Use fresh syringes to measure 5 cm 3 of the other substrates into the other test tubes in the same water-bath. Record which substrate is in which tube.

j Use a syringe to measure four 5 cm 3 samples of the clear potato extract into each of four more test tubes, and place in the water bath at 25 °C.

к Add 5 cm 3 of potato extract from a tube in the water bath to each tube of substrate solution. Start the stopclock.

л After two minutes, take a single drop of the potato extract/ glucose-1-phosphate mixture. Mix it with a drop of iodine in one of the wells of a spotting tile. Look for a very slight colour change. If there is none, repeat at 2-minute intervals as recorded by the stopclock.

м As soon as the slightest trace of blue or grey colour appears on the tile, remove 1.0 cm 3 from the mixture into your colorimeter vessel containing 2 cm 3 of water and 0.5 cm 3 or 1.0 cm 3 of iodine solution. Хуб омехта кунед. Record the colorimeter reading and the time.

н Using fresh iodine solution, carry out similar measurements with the other three extract/ substrate mixtures.

о Check the amount of enzyme extract/ substrate mixture left. Arrange to take more samples at regular intervals. Try to take at least 8 readings for each extract/ substrate mix. If colorimeter readings are changing rapidly from one sample to the next with a particular substrate, concentrate on that mixture and take samples as often as possible. Then return to the other extract/ substrate mixtures.

саҳ For each measurement, record the substrate, time, apparent colour (to your eye) and colorimeter reading.

q Convert the meter readings into starch concentrations using a calibration curve. (See associated practical on this site.)

Қайдҳои таълимӣ

After dealing with the digestion of starch, it is appropriate to ask how starch is formed in the first place. The tissue of potato tubes is a good source of the enzyme(s) responsible for the synthesis of starch.

Digestion of starch yields first maltose and then glucose, so synthesis could be a simple reversal of this process. Alternatively, the best substrate could be one of the compounds inside cells which is closely related to simple sugars an example is glucose-1-phosphate. This demonstration shows that an anabolic pathway need not be the simple reversal of the catabolic pathway. The hydrolysis of the glucose-1-phosphate provides the energy necessary to synthesise the starch.

The starch in potato tubers is stored inside cells in large granules which sediment on centrifugation. If you examine a drop of the glucose-1-phosphate/ enzyme mixture under a microscope at the end of the investigation, you may see starch granules 4 to 10 ?m in diameter.

The ‘lag phase’ at the beginning of the process suggests that the reaction is autocatalytic. CS Hanes (1940) demonstrated this by including small amounts of soluble starch to the reaction mixture this reduced the length of the lag phase. Your students are unlikely to come up with the idea of autocatalysis on their own however it is worth discussing as an example of the way in which graphs can be used to suggest and develop hypotheses.

Health & Safety checked, May 2009

Боргириҳо

Download the student sheet Enzyme-catalysed synthesis (73 KB) with questions and answers.


Part 3: How do you choose a centrifuge?

Centrifuge speed

Centrifuges may be classified based on maximum speeds, measured as revolutions per minute (RPM). Speeds range from 0-7,500 RPM for low-speed centrifuges, all the way to 20,000 RPM or higher.

Centrifuge rotor speed is often expressed as RCF in units of gravity (x г) for various procedures. However, many centrifuges display speed as revolutions per minute (RPM), necessitating conversion to ensure the correct experimental conditions. The following formula is used to convert RPM to RCF, where R is the rotor radius (cm) and S is the speed (RPM):

Centrifuge size

Centrifuges are available as various benchtop or floor-standing models.

Floor-standing models offer greater sample capacity and can achieve high speeds. Superspeed centrifuges can achieve a maximum г-force (relative centrifugal force, RCF) of over 70,000 x г, and ultracentrifuges often used for DNA or RNA fractionation, can achieve up to 1,000,000 x г. For large-capacity, low-speed applications, low-speed centrifuges reaching approximately 7000 x г дастрас мебошанд.

Benchtop models have a smaller footprint, and general-purpose models are ideal for a wide range of applications. There are many benchtop models available, including high-speed, microcentrifuge, clinical, and cell washer models. Clinical benchtop models and cell washers typically operate at lower speeds, and are suited to diagnostic applications, and washing debris from red blood cells.

Centrifuges for different applications

It is essential to select a centrifuge that is suited to the specific application. When purchasing a centrifuge, it is important to consider the following questions:

  • What sample volumes are you working with? For processes involving large or varying volumes, a floor-standing model with higher capacity and different rotor configurations may be the best solution.
  • Are samples temperature sensitive? If so, a centrifuge with refrigeration and temperature control options is required.
  • Will the centrifuge be used for processing clinical or blood banking samples? Cell washers or clinical models are available for these specific applications.
  • How much laboratory space is available vs the centrifuge footprint?
  • What is the maximum g-force the centrifuge is capable of generating? Low-speed centrifuges are ideal for separating whole cells, while ultracentrifuges are necessary for separating DNA and RNA.

Centrifugation speeds for cells. - (Feb/05/2013 )

What speed do you guys use to spin down your cells? Is there a rule of thumb for the different types of cells in terms of centrifugation speed?

I am having a problem with my cell count and I am not sure if the spinning down process is shearing my cells. Last night I counted my cell suspension with a hemocytometer and it came out to 1.5*10^6 cells but the FACS analysis reported a much lower number (around 10^4 cells). I know I will lose cells during the staining process and during the analysis but going from 10^6 to 10^4 is huge loss. Any advice will be appreciated.

Hm, I spin my cells down with 1300rpm for 3 min. Later during the FACS staining process I spin them down with 2400 rpm for 3 min, but be careful as this can harm the cells. Interestingly I also observe huge cell loss during the staining process although I never quantified it like you did. Do some of your cell stick to the wall of the reaction tube perhaps ?

Tabaluga on Tue Feb 5 19:12:56 2013 said:

Working with epithelia cells I use 3000 rpm for 3mins and working with HSCs the protocol calls for 1500 rpm for 5mins. I don't think my cells are sticking to the wall of the reaction tube but I don't know for sure. I don't know if it is pipetting error, cell count error or the speed of spinning.

For spinning live cells do not exceed 300 RCF (relative centrifugal forces also known as "g"), it is best to do it as low as possible, I routinely use 100 RCF for 5-10 min and it works fine for all the cancer cell lines that I work with.

When working with centrifuges, rpm is a relative measure that has no reference unless you also provide the rotor radius so Wek's 3000 rpm may in fact be lower RCF than Tabaluga's 2400, but we will never know.

Spinning too fast can cause a "smear" of cells up the wall of the tube that you may be missing when resuspending the cells.

Just looked it up, my 2400 rpm correspond to 600 g, apparently.

I will try 100, 200, and 300 RCF for 5 mins and see if there is any significant loss of cells. My 3000 rpm equals to 800 RCF.
I have actually noticed the line smear on the wall of the tube when using compensation beads but haven't really noticed it when spinning down cells.

Dear Guys,
I know this is out of ur discussion, but regarding converting RPM into G or vice verse, I just measure the radius of my centrifugal ring, not the whole machine, just the rotor radius with a ruler or something, put the data on RPM-G converter like these website:
http://www.endmemo.com/bio/grpm.php
http://www.geneinfinity.org/sp/sp_rotor.html

then I got the required number in G or in RPM

great links, thanks. Some centrifuges have also got the advantage that you can switch between both values on the display, thereby detemining very quickly the relation between their rpm and g.

Just to throw in my 2 cents. In a neuro lab we spin at 90g for glia, and 160g for neurons in 15ml falcon tubes for 3 minutes.

Considering neurons are pretty small I doubt you'd need to go much faster.


Видеоро тамошо кунед: Галилео. Прогноз погоды (Сентябр 2022).


Шарҳҳо:

  1. Farraj

    cognitive topic

  2. Radford

    Мо инро фаҳмида метавонем?

  3. Demarcus

    Who can help me figure it out in more detail?

  4. Atreides

    Паёми бонуфуз :), кундон ...



Паём нависед